单唾液酸神经节苷脂gm1的制作方法[0001]本申请是申请日为2007年9月29日、申请号为200710199780.7、发明名称为“获得医用纯单唾液酸神经节苷脂GMl的方法”的中国专利申请的分案申请。[0003]神经节苷脂是一类鞘糖脂，具有一个或多个唾液酸残基，被大量发现于人类和动物的大脑、神经组织中。已知单唾液酸神经节苷脂GMl可用于很多药学应用中，特别是在中枢和周围神经系统病症的修复和治疗中。[0004]按照美国专利US4849413，从牛或猪的大脑组织中方便地提取神经节苷脂。为了适合于制药学的应用，单唾液酸神经节苷脂GMl随后必须被分离并纯化。[0005]为了提高单唾液酸神经节苷脂GMl的产率，已知用化学、酶的方法来处理提取的脂质混合物，以把其它神经节苷脂组分转变成单唾液酸神经节苷脂GM1。这些方法包括用弱酸水解，例如CN1353112中所记载的，或利用唾液酸酶进行酶水解，例如在US5296360中所记载的。[0006]在EPO150712中记载了使用氯仿:甲醇:水之比为60:30:4.5的洗脱液，通过排阻色谱法对所述强化GMl的脂质混合物的进一步纯化。EP0489352记载了通过用α -环糊精对脂质混合物溶液进行超滤，之后用乙醇溶剂萃取而对GMl进行萃取，对GMl强化脂质混合物的纯化。据报道可以获得纯度为95%的GMl。[0007]这些方法先前已经被证实在GMl的纯度和产率、以及涉及到费用、效率和应用于工业规模的有效性上，存在缺陷。[0008]对于制药学应用，需要生产出高纯度的神经节苷脂GM1。相应地，保持着对获得高纯度神经节苷脂GMl的迫切需求。


[0009]本申请的

[0010]基于本发明，已经发现使用含有钾或铯离子的洗脱液通过离子交换柱色谱从含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中将GMl分离出来的方法，可以制备出高纯度的神经节苷脂GM1。
[0011]基于本发明，提供了一种根据权利要求1所述的神经节苷脂GMl的分离和纯化方法。
[0012]基于本发明的优选
[0013](a)使用含有钾或铯离子的洗脱液通过离子交换柱色谱从含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中分离出GM1，
[0014](b)从洗脱溶液中回收溶质，
[0015](C)对回收的溶质的水相溶液进行渗滤，
[0016](d)加入钠盐，并对所得溶液进行渗滤，并
[0017](e)回收 GMl。
[0018]优选，本发明的方法允许高纯度单神经节苷脂GMl的制备。根据本发明，单唾液酸神经节苷脂GMl可以以高于98%的纯度，甚至高于99.0%，甚至99.9%的纯度被制备出来。
[0019]进而，本发明的方法有利地使用简单步骤，是划算的，且适合于工业规模的应用。
[0020]本发明的其他目的和有益效果将从权利要求书和下述具体说明和实施例中显现。
[0021]详细说明
[0022]本发明提供了一种单神经节苷脂GMl纯化的方法，其中GMl是使用含有钾或铯离子的洗脱液通过离子交换柱色谱从含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中分离出来的。
[0023]在一个优选的实施方式中，提供了一种制备高纯度单唾液酸神经节苷脂GMl的方法，包括步骤: [0024](a)使用含有钾或铯离子的洗脱液通过离子交换柱色谱从含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中分离出GM1，
[0025](b)从步骤(C)的洗脱溶液中回收溶质，
[0026](C)对步骤(d)回收的溶质的水相溶液进行渗滤，从而去除残留的钾或铯盐，
[0027](d)加入钠离子，优选以适宜的钠盐的形式，以置换出与GMl结合的钾或铯离子，并对水相溶液进行渗滤，以除去残留钠盐，并且
[0028](e)回收钠盐形式的GMl。
[0029]脂质混合物可以由牛、绵羊、马、猪大脑组织的脂质粗提物制备。
[0030]有利地，含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物可以由含有至少30%、优选至少50%，更优选至少70%的神经节苷脂混合物的脂质提取物制备得到。脂质提取的剩余物通常由硫脑苷脂、脑苷脂、脂肪酸和蛋白质组成。
[0031]脂质提取物可以有利地首先通过具有微孔尺寸为10000到100000道尔顿，优选为约50000道尔顿的膜进行渗滤,从而使溶液脱盐。对于渗滤，可以使用任何传统的透析膜。优选过滤盒，例如可以使用SART0C0N? (赛多利斯)聚砜过滤盒类型，比如具有约50000道尔顿分离点(cut-off)的。
[0032]脂质提取物优选经受水解处理以将其他主要神经节苷脂组分例如GTlb、GTla以及⑶Ib转变成GMl以提高GMl的含量。
[0033]水解可以使用传统方法进行。水解可以有利地使用文献中已知的用于神经节苷脂的被称为酸水解或酶水解的两种常规水解方法中的任何一种进行。
[0034]酸水解可以例如使用稀无机酸例如稀盐酸、硫酸和硝酸来进行。酸水解可以通过调整脂质提取物水相溶液的PH值到介于pH3.5到5之间，优选pH4.0左右，然后加热溶液至一温度优选介于90°C到100°C之间并保持完成其他主要神经节苷脂组分转化成GMl所需要的时间而实现。将主要的神经节苷脂水解成GMl所需的时间依赖于pH值和所选择的温度。通常，PH值越高，完成水解所需要的时间越长，而反应温度越高，完成水解所需的时间越短。水解反应通常可以进行大约2到5个小时。例如，当在pH4.0和95°C下进行水解时，所需的完成水解反应的时间是大约3小时。
[0035]酶水解可以使用任何适宜的唾液酸酶来进行。优选可以使用产脲节杆菌唾液酸酶系S或霍乱弧菌唾液酸酶。优选产脲节杆菌唾液酸酶系S和霍乱弧菌唾液酸酶对GTla、⑶la、⑶Ib是有活性的，但对GMl没有活性。酶水解可以通过例如调整脂质提取物水相溶液的PH值到所使用的酶最佳活性的pH，例如在pH4和pH6之间，例如大约pH5而进行，通过添加适合的缓冲液例如醋酸缓冲液，在唾液酸酶是霍乱弧菌唾液酸酶的情况下加入Ca2+离子，并在所用酶的最佳活性温度例如大约37°C下加热溶液，保持所需的时间从而完成转变。水解通常可以进行大约12-24小时，取决于添加的酶剂量。
[0036]由于其属于非特异性水解过程，以及向其他神经节苷脂类的转化通常提供较低的GMl产量，所以酸水解是较不优选的。而且，酸水解过程会导致缺乏唾液酸基的-GMl杂质的形成。 [0037]由于高的化学转化特异性，其通常提供更高的GMl产率，因此酶水解方法是优选的。对于酶水解，产脲节杆菌唾液酸酶是优选的，因为其不需要为其活性而添加Ca2+离子。进而，由于其52000道尔顿的分子量(相对于霍乱弧菌唾液酸酶的82000道尔顿)，其可以有利地通过渗滤被洗去。
[0038]为了从反应溶液中回收这样产生的具有提高单唾液酸神经节苷脂GMl含量的脂质混合物，反应液可以有利地被渗滤，例如通过具有10000到100000道尔顿，优选约为50000道尔顿的微孔尺寸的膜。渗滤可以使用任何传统的透析膜。可以有利地使用过滤盒，例如SART0C0N? (赛多利斯)聚砜的过滤盒类型，优选具有约50000道尔顿的分离点(cut-off)的。随后将渗透物干燥而获得包含单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物粉末。干燥可以通过传统方法进行。有利地，干燥可以通过喷雾干燥或真空干燥进行。
[0039]脂质混合物通常可以含有10到200g/lt的GMl浓度，优选至少100g/lt。
[0040]基于本发明的方法，神经节苷脂GMl是使用离子交换色谱从脂质混合物中的其他神经节苷脂中分离出来的。
[0041]已经惊奇地发现，当使用含有铯或钾离子的洗脱液时，从其他单唾液酸神经节苷脂类中成功分离出GMl是可能的。
[0042]已发现，传统上使用的离子交换技术通常不允许有效地从其他单唾液酸神经节苷脂类中分离出GM1。特别值得注意的是在通过已知水解处理生产的猪的脂质混合物中作为主要的神经节苷脂杂质存在的岩藻糖酰单唾液酸神经节苷脂GM1。
[0043]GMl和岩藻糖酰GMl两种分子具有非常类似的物理特性。两者都带有单个负电荷，由唾液酸的羧基基团提供，并具有类似的分子量；分别是1558和1704。从而，当被装填于预平衡的离子交换柱中时，两种神经节苷脂和树脂的结合力是相同的。
[0044]已经观察到，当向洗脱液中添加醋酸钠以增大洗脱液的离子强度，并提供置换神经节苷脂的条件时，在相同的离子强度和相同时间下，GMl和岩藻糖酰GMl都被洗脱。不能实现这两种单唾液酸神经节苷脂的分离。
[0045]然而，本
【发明者】惊奇地发现，使用铯或钾离子，例如通过添加甲醇钾或醋酸铯，岩藻糖酰GMl被首先洗脱，从而GMl和岩藻糖酰GMl被分别洗脱。分离是彻底的，神经节苷脂GMl和岩藻糖酰GMl中每种都可以被分离。
[0046]同时，不希望被任何理论所约束，本发明的发明人认为，所观察到的分离可以归因于下述事实，与传统的离子交换理论相反，溶质GMl和岩藻糖酰GMl不但依照其与树脂结合力的顺序，而且依照它们与为了将其从凝胶上分离必须结合的反荷离子的亲合力的顺序而被从柱子上释放出来。从而，遵循这种理论，假如两种溶质中的一种具有与反荷离子不同的亲合力，那么溶质将被以两种不同的离子强度释放出来，并能够进行纯化。
[0047]本发明人已经惊奇地发现，尽管存在所有三种金属属于同一族的事实，单唾液酸神经节苷脂GMl和岩藻糖酰GMl对钠具有相同的亲合力，但对钾和铯的亲合力不同。已经由本
【发明者】发现，岩藻糖酰GMl对钾和铯比GMl具有更高的亲合力，并被先洗脱出来。
[0048]本发明的离子交换色谱方法能够方便地使GMl从岩藻糖酰GMl中有效地分离出来。进而，本发明的方法也有利地允许GMl从相应的脂肪酸中分离出来。与神经节苷脂具有相同电荷的脂肪酸，具有对于铯或钾离子更高的亲合力。
[0049]对于离子交换色谱，可以使用任何适宜的树脂。有利地可以使用具有季氨基的树月旨，例如FRACTOGEL? EMD TMAE(S)或琼脂糖凝胶树脂例如Q-琼脂糖凝胶HP树脂。
[0050]在第一步骤中，用合适的溶剂平衡树脂。合适的溶剂包括乙醇、甲醇或甲醇和氯仿的混合物。优选溶剂为甲醇，因为其是神经节苷脂、钾和铯盐都能溶解的。
[0051]然后用脂质混合物在合适的洗脱溶剂中的溶液装填柱子。洗脱溶剂应当包含与用于平衡树脂的溶剂相同的溶剂组分。优选所选择的溶剂是甲醇。用洗脱溶剂初步洗脱使未键合物质例如脑苷脂得以洗脱。
[0052]随后将钾或铯离子加入洗脱溶剂中。钾或铯离子优选以钾或铯的醋酸盐、甲酸盐、丙酸盐或其他有机酸的盐的甲醇溶液的形式提供。醋酸钠或醋酸钾的甲醇溶液是优选的。有利地，醋酸钾或醋酸铯在洗脱液中可以以足够将洗脱液中的导电率减少到1100-1400 μ S/cm，优选1200-1300 μ S/cm的量而存在。这种包含钠或钾盐的洗脱液可以以任何合适的流速，例如介于100ml/h到140ml/h之间的流速均匀通过柱子。
[0053]假如使用按照本发明的离子交换色谱方法进行分离，脂肪酸和岩藻糖酰GMl在GMl之前被洗脱，同时仍然和柱子结合的硫脑苷脂可以在柱洗涤过程中被洗脱。
[0054]含有GMl的洗出液被收集，有利地，从柱子上洗脱的洗脱溶剂可以通过蒸馏而回收。
[0055]含有GMl的溶质可以通过将洗出溶液干燥而回收，从而生产出含有GMl的粉末。干燥可以使用传统方法来进行，例如喷雾干燥或真空干燥。
[0056]随后，含有GMl的溶质可以通过具有微孔尺寸为10000到100000道尔顿，优选约50000道尔顿的薄膜的水相溶液渗滤而被纯化，以去除残留的钾或铯盐。任选地，无机酸，例如含水硫酸、硝酸，或者优选盐酸，可以在渗滤之前被加入溶液中以调整PH到介于pH6到8之间，优选约PH7。
[0057]钠离子，合适的是以钠盐的水溶液的形式，优选NaCl，可以被加入到溶液中，从而置换出与GMl连接的钾或铯离子，并获得生理钠盐形式的GM1。随后溶液可以使用具有微孔尺寸为10000到100000道尔顿，优选约50000道尔顿的膜，经历第二次渗滤以消除残留盐(例如NaCl)。有利地,可以使用过滤盒,例如SART0C0N? (Sartorius)聚砜类型,优选具有50000道尔顿的分离点(cut-off)的过滤盒。[0058]随后溶液可以被干燥以回收粉末形式的GM1。干燥可以以传统方法进行。有利地，干燥可以通过喷雾干燥或真空干燥进行。
[0059]依照本发明获得的GMl具有98%或更高纯度的级别，通常为约99.0到99.9%。依照本发明的方法获得的GMl包含岩藻糖酰-GMl杂质少于0.1 %。
[0060]本发明的方法方便地能够从其他单唾液酸神经节苷脂类中有效分离GMl。特别是，本发明的方法允许从岩藻糖酰-GMl杂质中将GMl分离出来。
[0061]有利地，本发明的方法允许良好产率和高水平纯度的单唾液酸神经节苷脂GMl的制备。
[0062]根据本发明方法纯化的GMl可以用于人类和动物受治疗者的处理，特别是，根据本发明的纯化GMl被设想用于人类或哺乳动物的治疗，特别是中枢和外围神经系统病症和疾病，包括脑中风，帕金森病、脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、迟发性运动障碍、肌萎缩侧索硬化、周围神经病变和自主神经性病变。
[0063]本发明可 进一步通过下述实施例进行阐述。
【具体实施方式】
[0064]实施例1
[0065]含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂类的脂质混合物的制备
[0066]以约25g/l的浓度将含有具有70%纯度的神经节苷脂混合物的脂质提取物溶解于纯化水中。随后溶液通过具有50000道尔顿分离点(cut-off)的SART0C0N?聚砜过滤盒渗滤。
[0067]随后通过添加50mM的醋酸缓冲液和4mM的氯化钙将2001的溶液平衡到pH5.5。加入30000U的霍乱弧菌唾液酸酶，并将溶液加热到37°C保持12小时以完成其他主要神经节苷脂类(GTlb、⑶la、⑶Ib)到GMl的转化。所得的溶液具有14_15g/l的GMl浓度。
[0068]在酶水解之后，溶液通过具有50000道尔顿的分离点(cut-off)的过滤盒渗滤。随后将IM NaCl加入滞留物中，使溶液经历第二次渗滤。在第二次渗滤之后，通过不经任何水置换的渗透物流动，滞留物被浓缩到GMl浓度为100g/l。然后，溶液在真空下干燥，获得大约3200g的，具有通过HPLC测量浓度为85%的粉末。
[0069]得自含有单唾液酸神经节苷脂GMl作为主要神经节苷脂类的脂质混合物的GMl的盤
[0070]使用前述步骤获得的粉末制备浓度为10g/l的甲醇溶液，溶液被通过0.22 μ m的Sartopore 滤芯(由 Sartorius AG 制造)。
[0071]随后，对每个循环，在含有201在甲醇中平衡的Fractogel? EMD TAME⑶树脂的FPLC柱子上装填7升经过滤的溶液。随后柱子用具有1200-1300 μ S/cm的传导率的甲醇:醋酸钾的甲醇溶液，以1201/h的流速洗脱。重复循环直至GMl溶液的终点。
[0072]洗出液(大约60-701)通过蒸馏不断浓缩，然后被干燥以获得粉末，并回收甲醇。所获得的粉末是纯GMl和醋酸钾的混合物。
[0073]由此获得的粉末溶解于纯化水中至25g/l的浓度，并添加18%的HCl将pH中和到
7。通过具有50000道尔顿的分离点(cut-off)的过滤盒，对溶液渗滤。而后加入IM NaCl,并通过具有50000道尔顿的分离点(cut-off)的过滤盒，对溶液再次渗滤。在第二次渗滤之后，通过不经任何水置换的渗透物流动，将滞留物浓缩到100-120g/l。
[0074]浓缩的溶液随后通过0.22 μ m过滤器过滤并通过喷雾干燥，以提供大约2700g白色-浅褐色的GMl粉末，由TLC鉴别，此GMl粉末具有由HPLC测量的99.8%的纯度。所得的GMl粉末具有通过HPLC测量的小于0.1 %的岩藻糖酰-GMl含量。
[0075]比较实施例
[0076]制备和纯化GMl的方法以与上述实施例1中相同方式进行，除了柱色谱中甲醇:醋酸钾的甲醇溶液由甲醇:醋酸钠的甲醇溶液代替之外。
[0077]获得3100g由HPLC测量含有91 % GMl和8%岩藻糖酰-GMl的GMl粉末。
[0078]从上述实施例可以看出假如用醋酸钠作GMl洗脱液，获得的GMl的纯度很低。这可能是由于与相反的完全将两者的峰分离开的钾或铯反荷离子相比，钠反荷离子无法区分GMl和岩操糖酸-GMl的 事实。
【发明者】S·卡里诺, R-P·邦特 申请人:梅迪多姆实验室股份有限公司