一种活性多肽及其在植物根部发育中的应用的制作方法[0003]根瘤的形成过程大致为:聚集在根毛顶端的根瘤菌分泌一种纤维素酶，这种酶将根毛细胞壁溶解掉，根瘤菌从根毛尖端侵入根的内部，产生感染丝，根瘤菌不断地进入根毛，并且大量繁殖，在根瘤菌侵入的刺激下，根细胞分泌一种纤维素，将感染丝包围起来，形成一条分枝或不分枝的纤维素鞘，叫做侵入线，侵入线不断地延伸，直到根的内皮层，根的内皮层处的薄壁细胞，受到根瘤菌分泌物的刺激，产生大量的皮层细胞，从而使该处的组织膨大,最后形成根瘤。[0004]根瘤菌的固氮作用是在常温、常压下进行的。根瘤固氮具有固氮效率高、无污染、成本低、收益高等优点。根瘤菌的固氮能力，不仅取决于土壤条件和农业措施，也取决于植物品种，人工培养的一些根瘤菌品系的固氮能力往往比野生品系的固氮能力高几倍。[0005]本领域目前还没有找到一种可以直接应用的影响植物根部发育特别是影响植物根瘤形成的基因或活性物质。因此迫切需要进行影响农业植物尤其是豆科植物的根部发育的研究及开发。
[0006]本发明的目的就是提供一种新的植物磺酸化肽及其在植物根部发育中的应用。[0007]在本发明的第一方面，提供了一种分离的活性多肽，所述的活性多肽任选自下组:[0008](I)从N，端到C，端依次为Y、1、Y、T、N的多肽；
[0009](2)上述(I)中多肽的衍生物；
[0010](3)上述(I)中多肽或⑵中多肽的衍生物的前体。
[0011]在另一优选例中，所述的活性多肽来源于植物，较佳地来源于豆科植物。
[0012]在另一优选例中，(2)中所述的衍生物为磺酸化衍生物。[0013]在另一优选例中，所述多肽的磺酸化位点为酪氨酸残基(Y);较佳地，所述多肽的2个酪氨酸残基都被磺酸化。 [0014]在本发明的第二方面，提供了编码第一方面所述活性多肽的多核苷酸。
[0015]在另一优选例中，所述的多核苷酸为如SEQ ID N0.: 11_20任一所示的多核苷酸。
[0016]在本发明的第三方面，提供了一种含有本发明第二方面所述多核苷酸的载体。
[0017]在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。
[0018]在本发明的第五方面，提供了第一方面所述活性多肽，或第二方面所述多核苷酸的用途，所述用途选自下组的一种或多种:
[0019](a)用于调节植物侧根数目；
[0020](b)用于调节植物根的长度；
[0021](c)用于调节豆科植物根瘤的形成。
[0022]在本发明的第六方面，提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤:
[0023]将编码第一方面所述活性多肽的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。
[0024]在另一优选例中，所述的多核苷酸为序列如SEQ ID N0.:11_20任一所不的多核苷酸。
[0025]在另一优选例中，所述的植物为豆科植物，较佳地任选自:大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脉根、木豆、豌豆、蚕豆、红豆、绿豆、田菁等。
[0026]在本发明的第七方面，提供了一种制备第一方面所述活性多肽的方法，所述方法任选任自下组:
[0027](I)培养第四方面所述的宿主细胞，收集获得第一方面所述的活性多肽；
[0028](2)人工化学合成第一方面所述的活性多肽；
[0029](3)从含有第一方面所述活性多肽的植物组织或器官中提取所述的活性多肽。
[0030]在另一优选例中，(3)中所述的植物为豆科植物,较佳地任选自:大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脉根、木豆、豌豆、蚕豆、红豆、绿豆、田菁等。
[0031]在另一优选例中，(3)中所述的植物器官为根或根瘤。
[0032]在本发明的第八方面，提供了一种改良植物性状的方法，所述的植物性状选自下组:
[0033](a)增加植物侧根数目；
[0034](b)增加植物根的长度；
[0035](C)促进豆科植物根瘤的形成，
[0036]包括步骤:提高所述植物中第一方面所述活性多肽或其或其编码基因的表达水平。
[0037]在另一优选例中，所述植物中第一方面所述活性多肽的表达水平提高10%以上，较佳地提高30%以上，更佳地提高50%以上，更佳地提高70%以上，更佳地提高90%以上，最佳地提高100%以上。
[0038]在本发明的第九方面，提供了一种方法，所述的方法任选自下组:
[0039](a)增加植物侧根数目的方法；[0040](b)增加植物根的长度的方法；
[0041](c)促进豆科植物根瘤的形成的方法，
[0042]包括步骤:向所述的植物施用本发明第一方面所述的活性多肽。
[0043]在另一优选例中，所述活性多肽的施用浓度为0.1-1000 μ Μ，较佳地10 μ Μ。
[0044]在另一优选例中，将第一方面所述的活性多肽与所述的植物(优选植物根部)接触。
[0045]在另一优选例中，(a)或(b)中所述的植物为:拟南芥、水稻、或烟草。
[0046]在另一优选例中，(C)中所述的豆科植物为大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脉根、木
豆、豌豆、蚕豆、红豆、绿豆、田菁等。
[0047]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0048]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0049]图1显示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)编码基因的组成和结构。
`[0050]图2显示大豆、蒺藜苜蓿和百脉根中NGF小肽(￥603)1￥(503)了幻编码基因的表达结果；其中，图2A显示大豆中NGF编码基因在根毛、根系和根瘤中表达，其中在根瘤中表达量最高；图2B显示在蒺藜苜蓿中，NGF编码基因在根瘤中特异表达；图2C显示百脉根中NGF编码基因在根系、叶和根瘤中表达，其中在根瘤中表达量最高；图2D显示，百脉根中NGF编码基因在根系中的表达受根瘤菌诱导。
[0051]图3显示蒺藜苜蓿中NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)编码基因扰乱后的结瘤测试结
果O
[0052]图4显示NG F小肽(Y(S03) IY(S03)TN)的质谱鉴定结果。
[0053]图5显示了在拟南芥(A)、大豆根瘤(B)、百脉根根瘤(C)、紫花苜蓿根瘤(D)、烟草(E)、水稻(F)中NGF的含量，G为化学合成的NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)。
[0054]图6显示苜蓿不同组织(A，蒺藜苜蓿的花器官；B，蒺藜苜蓿的叶子；C，紫花苜蓿的叶子；D，紫花苜蓿根瘤；E，蒺藜苜蓿的果荚；F，紫花苜蓿的根系；G，紫花苜蓿的茎)的NGF小肽(Y (S03) IY (S03) TN)含量的分析结果。
[0055]图7显示NG小肽(Y(S03) IY(S03) TN) F对拟南芥根系生长的影响结果。
[0056]图8显示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)对百脉根和蒺藜苜蓿结瘤的影响。
[0057]图9显示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)对拟南芥侧根数目的影响。

[0058]本发明人经过广泛而深入的研究，具体地，发明人意外发现一种新的活性多肽，所述多肽从N’端到C’端依次为Y (Tyr)、I (lie)、Y (Tyr), T (Thr),N (Gln);本发明还包括所述多肽的衍生物及其前体；所述的活性多肽具有种属特异性，并参与植物根部的发育，能促进拟南芥根部的增长，增加侧根的形成，对豆科植物根瘤的形成具有促进作用。在此基础上完成了本发明。
[0059]如本文所用，术语“本发明的小肽”，“本发明的活性多肽”，或“本发明的多肽”可以互换使用，都是指N’端到C’端依次为Y、1、Y、T、N的小肽，其中，所述的Y为Tyr，I为He，T 为 Thr，N 为 Gin。
[0060]如本文所用，术语“本发明的多肽衍生物”或“本发明的小肽衍生物”可以互换使用，都是指本发明的具有YIYTN结构的多肽的衍生物；较佳地为磺酸化衍生物；磺酸化位点优选酪氨酸残基；更优选地，小肽中的所有酪氨酸残基都被磺酸化。
[0061]如本文所用，术语“NGF小肽”是指结构为(Y(S03)IY(S03)TN)的磺酸化小肽。
[0062]本发明还包括上述多肽(或其衍生物)的前体。
[0063]例如:在部分种属中，NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)前体的氨基酸序列见下:
[0064]>GmNGFlab
[0065]MRLSKPTLLL FLVFIFTTVQ GQAVTNERVV GSESVVSFEL RRSGGCEKQG FEYREGNGGL 60
[0066]EDTVLENEDY IYTNSLP77
[0067](SEQ ID N0.:1)
[0068]>GmNGF2
[0069]MRLSKPALLL FLVF IFTVVQ GQAVTNERVV CSKSSTTVRR SGGCEKQGFE YKEGNGGLED 60
[0070]TVLENEDYIY TNFLP75
[0071](SEQ ID N0.:2)
[0072]>LjNGF
[0073]MKLLKPALFL CLVSIFIVVY VVQREAVTNE QVAGGASQSS VTVKRSGCEK QGFECKEGSG 60
[0074]GSQDTVLENE DYIYTNSLP79
[0075](SEQ ID N0.:3)
[0076]>MtNGFl
[0077]MRLSKPTLIL FVFFIFTVTC VVQMEAVINE RVVDAGSGSS SVNVVRRGEC EKQGVECKQV 60
[0078]NGGNEDNDLE SEDYIYTNSV LP82
[0079](SEQ ID N0.:4)
[0080]>PsNGF
[0081]RVVKGGGSGS NSTTVVVRRG ECEKQGVECE KENGENEETD LENEDYIYTN SVLP54
[0082](SEQ ID N0.:5)
[0083]>CcNGFl
[0084]MRLSKPALLL FRRGGCEKQG VECKEGNGGL EDTVLENEDY IYTNSLP47
[0085](SEQ ID N0.:6)
[0086]>CgNGF
[0087]GRAQSKYHEV FETRFFLFLV FCYLTFVSEG KSDTTESFVG SGGASANEGR AECGQGDVEC 60
[0088]KEGSRGSADN LFENEDYIYT NSLP 84
[0089](SEQ ID N0.:7)
[0090]>QpNGF
[0091]NEFSRLAFLL TLAFIYYLIF VAQGKADTNE LLVGSAGTSV NEGRAECSKD AVECKEGNGG 60
[0092]SEENAYENED YIYTNSLP 78[0093](SEQ ID N0.:8)
[0094]>VvNGF
[0095]MRFSGPYMFL FLAFFFYLVF AIQGKEDTNG VTRRKVLSAE KEMEEQKSVF ESEDYIYTNS 60
[0096]LP62 [0097](SEQ ID N0.:9)
[0098]>CsNGF
[0099]MQGRAECGKE QNVECKKRSD QEDDVFEDED YIYTNSLP38
[0100](SEQ ID N0.:10)
[0101]其中，Gm表不 Glycine max (大豆)，Lj 表不 Lotus japonicus (百脉根)，Mt 表不Medicago truncatula (蔡藜苜猜)，Ps 表不 Pisum sativum (豌豆)，Ce 表不 Cajanus cajan(木豆)，Cg 表示 Casuarina glauca (木麻黄)，Qp 表示 Quercus petraea (无梗花栎)，Vv 表不 Vitis vinifera (葡萄)，Cs 表不 Cannabis sativa (大麻)。
[0102]如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。“分离的多肽”是指所述的小肽基本上不含天然与其相关的其它肽、脂类、糖类或其它物质。
[0103]本领域的技术人员能用常规方法，如标准的小肽纯化技术纯化。基本上纯的小肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带，其纯度能用氨基酸序列分析。
[0104]本发明的活性多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主。
[0105]修饰(通常不改变一级结构)的形式包括:体内或体外的化学衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
[0106]活性多肽的编码序列
[0107]本发明还提供了编码本发明活性多肽的多核苷酸，所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0108]术语“编码本发明活性多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽或其衍生物的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列(如信号肽序列)的多核苷酸。
[0109]本发明还涉及上述多核苷酸的变异体。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
[0110]本发明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。可以完全通过化学合成来得到编码本发明的小肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明的小肽序列中。用于PCR的引物可根据本文所公开的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。
[0111]在部分种属中，编码NGF小肽(Y (S03) IY (S03) TN)的CDS序列如下:
[0112]