专利名称：改造的止血多肽及其运用的制作方法血浆血管性血友病因子/瑞斯托霉素辅因子(von Willebrand factor，vWF)在凝血过程中发挥重要作用。vWF基因定位于人12号染色体的短臂末端(12pl2-pter)，全长 1781Λ，包括52个外显子和51个内含子，转录91Λ的mRNA，编码观13个氨基酸组成的前体蛋白，包括22个氨基酸组成的信号肽、741个氨基酸的前肽(prop印tide)及2050个氨基酸的成熟亚单位，其中前肽包含与黏附蛋白结合的Arg-Gly-Asp (RGD)序列。vWF前体蛋白包括4种重复结构域，从N端到C端的排列顺序为D1-D2-D’ -D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1 -C2-CK，其中D1-D2位于前肽中。前体蛋白生成后转运至内质网，信号肽断裂，vWF单体在其近羧基端通过二硫键以尾-尾相连的形式构成二聚体。vWF二聚体继续转运至高尔基体， 通过氨基端头-头相连的二硫键实现多聚化，然后通过糖基化、硫基化、切除前肽等加工过程，形成成熟的vWF多聚物。从血浆中分离得到的vWF是由分子量约250kD的相同亚单位组成的一系列大小不等的多聚物，最大可包含多达100个亚单位，其多聚化程度对于维持vWF 的正常生物学活性具有重要意义。vWF多聚化程度越高，血栓的形成就越容易。vWF由血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成。vWF在高尔基体中的多聚化和加工修饰完成后，一部分持续分泌至血浆，另一部分贮存于Wfeibel-Palade小体或血小板的α颗粒中。内皮细胞和血小板中贮存的vWF是大分子量的多聚物，在凝血过程中发挥重要作用。vWF的生理作用主要包括以下几种①作为凝血因子F VDI的载体，保护其免受各种蛋白酶(凝血酶、纤溶酶及蛋白C)的作用而失活，使F VDI在血浆中保持稳定，延长其半衰期， 结合位点为成熟vWF亚单位氨基端的272个氨基酸残基；②在高剪切力条件下(如动脉血管损伤时)，与内皮下胶原结合，结合位点为Al区和A3区；③与血小板膜GP I b-IX复合物结合，在止血过程中起桥梁作用，介导血小板黏附于血管损伤部位，结合位点为Al区的474 488位及514 542位氨基酸；④与血小板膜GP II b_ III a结合，促进血小板的聚集，结合位点为C区的Arg-Gly-Asp (RGD)序列(1744 1746位氨基酸)。研究表明游离的vWF-血小板聚合物可以阻塞下游细小的循环血管，造成器官缺血，导致血栓性疾病的发生。此外， vWF基因突变可导致血管性血友病(von willebrand disease, vWD)。vWD是一组临床上常见的遗传性出血性疾病，大部分病人表现为止血功能降低。另一方面，vWF可作为潜在的研究凝血药物的新靶点。研究表明，当机体出现生理性或是病理性出血，血小板首先聚集到受伤/异常的内皮细胞上。为促使更多的血小板聚集至伤口，vWF多聚物介导了两个血小板之间或是一个血小板与内皮细胞之间的连接。血小板表面表达多个vWF受体，当出现病理性或是生理性出血的时候，及在高剪切力的作用刺激下，这些受体被激活，vWF多聚物介导了更多的血小板之间及内皮细胞的交联，使血小板黏附到出血部位血管壁上，聚集，初级血栓形成。接着血小板又经过复杂的变化，激活凝血酶系统，血凝块收缩，血栓变得更坚实，更有效地起止血作用，这是二级止血作用。由此可知，vWF在初级血栓形成过程中起着必不可少的重要作用。血菜vffF的大小可被一种特异性的vWF裂解酶(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs 13,ADAMTS13) IjfKfj^J, ^ffliliK 别vWF的Tyr16tl5 - Met1606 A2位点进行切割，将血浆中的大分子量vWF多聚物降解成小分子片段，使vWF多聚物与内皮下胶原和血小板的黏附能力降低，阻止vWF多聚物参与凝血过程发生。临床上常见的血栓性血小板减少性紫癜(TTP/HUS)患者其在疾病缓解期又出现了慢性复发，血浆中存在超大vWF多聚体，导致其微血管(如小动脉和毛细血管)内有散在的、血小板构成的玻璃样血栓，表明vWF多聚体是导致微血管内血小板聚集的主要因素，而裂解酶ADAMTS13的缺乏是导致这些患者体内持续存在超大vWF多聚体的原因。ADAMTS13是一种金属蛋白酶，位于染色体9q34，由肝脏星形细胞分泌。其基因长度约37 kb,包括四个外显子和编码1 427个氨基酸残基，包括1个疏水信号肽，1个C末端成对碱性氨基酸蛋白酶切割位点的短的前导肽，1个r印rolysin样金属蛋白酶活性域，1个去整合素样域，1个凝血酶敏感蛋白域(TSP1)，1个富含半胱氨酸域，1个间隔域。此外其羧基端还包含另外7个TSP 重复域(TSP2-8)和2个补体结合域(CUB)，2个CUB为ADAMTS13所特有。此外，ADAMTS13 蛋白cysteine-rich及spacer domains区域)对于为表面受体结合位点。体内外研究表明 ADAMTS13具有切割vWF的酶切活性。ADAMTS13结构域的功能可以从不同结构域截断后的分泌效应及其切割vWF或人工合成短肽底物的活性来判断。从ADAMTS13的TSP2域及其远端截断，体外保留裂解vWF的活性，而在TSP2域以内的近端截断(金属蛋白酶域、TSP1、富半胱氨酸区或间隔区)导致蛋白失活或分泌减少。表明ADAMTS13从金属蛋白酶域到间隔域均为裂解酶底物所需，并且与底物识别特异性有关。在血流动态下，C-末端远端的TSP2-8和 CUB结构域也与底物识别特异性有关，因为体外截断这些结构域，其蛋白酶裂解活性显著受损。ADAMTS13能以1 :2的比例结合于vWF，即一个ADAMTS13分子结合2个vWF分子， 在2小时内达到平衡，半衰期约为4小时。静息条件下由于vWF或裂解的结构位点未暴露， 故不能被ADAMTS13裂解。公开号为P2008-301776A的日本专利文献公开了三条来源于 ADAMTS13的多肽，分别如SEQ ID N0:USEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3氨基酸序列所示的止血多肽，它们能特异地与vWF结合，抑制ADAMTS13与vWF的结合，进一步抑制ADAMTS13对 vffF裂解，促进vWF多聚物的形成，进而促进机体凝血。但其性质不够稳定，凝血效果一般。
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改造的止血多肽，该止血多肽作为如SEQ ID N0:USEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的止血多肽的改进，其止血效果更佳。为实现上述目的，本发明的技术方案为改造的止血多肽，在由一个赖氨酸构成的树状核心的分枝上连接有二聚体A和二聚体 B，所述二聚体A由如SEQ ID N0:1所示的多肽和SEQ ID N0:2所示的多肽依次串联而成，所述二聚体B由如SEQ ID N0:2所示的多肽和SEQ ID N0:3所示的多肽依次串联而成，所述改造的止血多肽的赖氨酸构成的树状核心同SEQ ID N0:2所示的多肽的末端缬氨酸连接。本发明的另一目的为提供上述改造的止血多肽的运用，该运用为高效止血提供了CN 102161692 A说明书3/6页新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的改造的止血多肽在制备止血药物中的运用。进一步，所述止血多肽在制备血浆血管性血友病因子和/或瑞斯托霉素辅因子抑制剂中的运用；
进一步，所述改造的止血多肽的剂量为0. 1-lg/L。本发明的有益效果在于本改造的止血多肽源于ADAMTS13，其能特异地与vWF结合，抑制ADAMTS13与vWF的结合进一步抑制其对vWF裂解，促进vWF多聚物的形成，进而促进机体凝血。本改造的止血多肽止血效果优于如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3氨基酸序列所示的止血多肽，其本改造的止血多肽稳定性更佳；在使用相同剂量的情况下，本改造的止血多肽涉及的多肽凝血效果更好。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为改造的止血多肽质谱分析图2为改造的止血多肽用反相HPLC图，两流动相中都添加了 TFA (三氟乙酸)，PH 2 ； 图3为止血多肽及对照体外凝集实验效果，多肽浓度为0. lg/L时，在PRP (富血小板) 血浆中的凝集情况，PI、P2、P3肽未见肉眼可见沉积，所述改造的止血多肽即刻出现少数沉积；
图4为止血多肽及对照体外凝集实验效果，多肽浓度为0. lg/L时，在PRP (富血小板) 血浆中的凝集情况，PI、P2、P3及对照未见肉眼可见沉积，所述改造的止血多肽即刻出现沉积；
图5为止血多肽及对照体外凝集实验效果，各多肽浓度为0. lg/L时，在PPP(贫血小板) 血浆中的凝集情况，PI、P2、P3肽未见肉眼可见沉积，所述改造的止血多肽即刻出现少数沉积；
图6为止血多肽及对照体外凝集实验效果，各止血多肽浓度为lg/L时，在PPP(贫血小板)血浆中的凝集情况，PU P2、P3肽及对照未见肉眼可见沉积，所述改造的止血多肽即刻出现沉积；
图7为所述改造的止血多肽体外凝集实验效果，P4肽分别浓度为0. lg/L及lg/L浓度时在PRP、PPP血浆中体外凝血实验效果。从实验结果可知①P4的凝集是即刻产生的；②P4 体外凝血呈剂量依赖；③所述改造的止血多肽体外凝血与作用时间成正相关；
图8为止血肽对下游靶标蛋白凝集量检测。各止血多肽及对照体外凝集后，血浆中vWF 多聚体量检测，结果显示所述改造的止血多肽肽凝集后，血浆中vWF多聚体量最多，提示所述改造的止血多肽促进血栓形成。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。氨基酸的缩写如下
甘氨酸gly G ；丝氨酸Ser S ；丙氨酸ala A ；苏氨酸thr T ；缬氨酸val V ；异亮氨酸 ile I ；亮氨酸leu L ；酪氨酸tyr Y ；苯丙氨酸phe F ；组氨酸his H ；脯氨酸pro P ；天冬氨酸asp D ；甲硫氨酸met M ；谷氨酸glu E ；色氨酸trp W ；赖氨酸Iys K ；半胱氨酸cys C ；精氨酸arg R0本申请实施例
及说明书附图部分，将SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽命名为Pl JfSEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽命名为P2，将SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的多肽命名为P3，空白对照为PBS溶液。实施例1改造的止血多肽的制备
改造的止血多肽的合成采用国际先进的多肽固相合成仪以及多肽人工合成技术相结合，使用制备级HPLC对产物进行分离纯化，采用电喷雾质谱技术对合成肽的分子量进行鉴定，鉴定的分子量均相符；最后对纯化的合成肽进行HPLC纯度鉴定，各合成肽纯度均大于 95%。一、改造的止血多肽的合成
改造的止血多肽由杭州中肽生物有限公司合成。合成方法参照《P印tide synthesis protocols》提供的方案实施。本改造的止血多肽结构如下所示


本发明涉及生物蛋白质领域，特别涉及改造的止血多肽及其运用，改造的止血多肽在一个赖氨酸构成的树状核心的分枝上连接有二聚体A和二聚体B，二聚体A由如SEQIDNO:1所示的多肽和SEQIDNO:2所示的多肽依次串联而成，二聚体B由如SEQIDNO:3所示的多肽和SEQIDNO:2所示的多肽依次串联而成，其赖氨酸构成的树状核心同SEQIDNO:2所示的多肽的末端缬氨酸连接；本改造的止血多肽可用于制备止血药物；其止血效果优于如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3氨基酸序列所示的止血多肽，其稳定性更佳；在使用相同剂量的情况下，其凝血效果更好。