专利名称：一种含有蛋白质或多肽的口服制剂、其制备方法及用途的制作方法胰岛素(insulin)，甲状旁腺激素(parathyroidhormone),降钙素 (calcitonin)，生长激素(growth hormone)，肠促胰岛素样肽-1 (GLP-I)等蛋白质或多肽 药物，是临床治疗中的重要药物。但这类药物的共同特点是口服给药几乎无效，需要频繁的 注射给药。蛋白质多肽类药物由于在临床中缺乏口服给药途径而限制了它们的应用，胃肠 道中蛋白酶的降解以及肠上皮细胞屏障作用等多种因素限制了这类药物的口服生物利用 度。几十年来，研究人员采用共价修饰、酶抑制剂、吸收促进剂、微囊微球包裹、ff/0(油包 水)乳剂等策略，以期解决蛋白质多肽类药物口服生物利用度低的问题。Carino G. P. et al (2000)J. Control. Release. 65 :261-269 ；Kathrynffehitehead, et al (2004)J. Control. Release.98 :37-45 ；YanPan, et al(2002) Int. J. Pharm 249 :139-147 ；Nerurkar Μ. Μ. etal (1996)Pharm. Res. 13 :528-534 ；Marschutz Μ. K. et al (2000)Biomaterials 21 1499-1507 ；Christopher J. H. et al (1997)Adv. Drug. Deliver. Rev. 25 :71-89 Jeff Wang, et al (2003) J. Control. Release. 88 :369-380 ；Roger R. C. New, et al (1997) Adv. Drug. Deliver. Rev. 25:59-69 ；Anja Graf, et al (2008)Int. J. Pharm. 350:351-360 ；R. Neslihan Gursoy et al (2004)Biomed. Pharmacother. 58 :173-182 ；CN01115327.X，US4849405, US58M638。上述策略存在明显的不足，如共价修饰会降低药物活性，并可能改变药物分子的 药理、毒理，带来高昂的制备成本和严重的安全隐患；酶抑止剂能有效避免蛋白酶的水解作 用，但酶抑制剂同时也影响了食物蛋白的消化，长期服用将造成消化吸收紊乱甚至胰脏的 肿大或增生；吸收促进剂在增加肠道通透性的同时，有可能对细胞膜造成不可逆的破坏，长 期服用会导致膜中毒；微囊微球制备工程中常需要有机溶剂的参与，并需要高速离心等步 骤，增加了工艺的复杂性。另外有研究表明，中链脂肪酸可以作为底物引发级联反应并最终打开细胞间紧密 连接，从而增加肠道的渗透性(Masahiro Hayashi, etal (1997) ADV. DRUG. DELIVER. REV. 28 191-204.)。Panayiostis等人以中链脂肪酸甘油酯作为吸收促进剂，研究了 W/0型微 乳制剂对亲水性小分子药物的吸收效果(Panayiostis P. Constantinides, etal (1994) PHARM RES 11:1385-90 ；Panayiostis P.Constantinides, et al (1996)PHARM RES 13: 210-215。)，但其所用药物分子量不足700道尔顿，并且该类药物直接口服后生物利用度可 达2%，与蛋白质多肽类药物存在本质差别。经过进一步的研究，P. Constantinides通过 联合应用高HLB值(亲水亲油平衡值)表面活性剂和低HLB值表面活性剂，获得了能够包 含RGD、降钙素、胰岛素等不同亲水分子的自乳化W/0制剂，但其口服生物利用度效果却没有公开的报道。Mao-BoCheng等人制备了含蚓激酶的口服W/0型微乳制剂(Mao-Bo Cheng, etal(2008) J. Control. Release. 129 :41-48)。上述文献以微乳为载体，实现了对蛋白质或多肽药物的包裹，但存在一个最大的 问题就是这些制剂乳化效果差，粒径大小悬殊很大，并且乳化后(稀释后)乳液出现了分 层；或者清亮区域狭小，稀释后不能均勻分散，从而会限制其口服生物利用度效果。甚至可 能导致乳滴破乳，包裹于内层水相中的蛋白质多肽类分子会被快速释放出来，被胃肠道中 的蛋白酶降解，或与中链脂肪酸酯等物质由于不相容性的问题，蛋白质多肽类分子发生絮 集、沉淀，造成药物活性丢失且难以被机体吸收。
本发明人通过大量的试验和创造性的劳动，惊奇地发现，通过选用高HLB值表面 活性剂和中链脂肪酸酯(特别再添加磷脂时)，得到的含有蛋白质或多肽的乳剂的相容性 和稳定性很好，乳剂在保持较高的生物利用度的同时，保持优异的乳化性能。并且乳剂在被 水稀释时，能均勻分散，生成的乳滴粒径分布比较均勻，不会导致乳液不清。由此提供了下 述发明本发明的一个方面涉及一种乳剂，包含蛋白质或多肽、水相、油相、乳化剂，其特征 在于，所述油相含有中链脂肪酸酯(例如中链脂肪酸甘油酯)，并且所述乳化剂包括HLB值 大于12的乳化剂；具体地，所述油相为中链脂肪酸酯(例如中链脂肪酸甘油酯)，所述乳化 剂为HLB值大于12的乳化剂。所述蛋白质或多肽为乳剂的有效成分(药效成分)或者活性成分。所述蛋白质或 多肽可以从生物机体中分离获得，也可以通过基因工程手段(例如基因重组)或化学合成 的方式获得。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述蛋白质或多肽为降钙素、胰岛素、 GLP-U甲状旁腺激素、甲状旁腺激素1-84、甲状旁腺激素1-34、或生长激素。在一些实施 方案中，所述降钙素，包括鲑鱼、鳗鱼和人的降钙素；所述胰岛素，包括猪、牛、人和重组的胰 岛素；所述GLP-1，包括重组和合成的GLP-I ；所述甲状旁腺激素，包括人体甲状旁腺激素 1-84、重组和/或合成的甲状旁腺激素1-34 ；所述长激素，包括猪、牛、人体和重组的生长激ο根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述中链脂肪酸酯为中链脂肪酸甘油酯、 聚乙二醇化的中链脂肪酸甘油酯、乙酰化中链脂肪酸甘油酯、中链脂肪酸丙二醇酯、中链脂 肪酸丁二醇酯、或中链脂肪酸聚乙二醇酯。所述中链脂肪酸甘油酯可以为中链脂肪酸甘油 一酯、中链脂肪酸甘油二酯、以及中链脂肪酸甘油三酯中的一种或多种。所述中链脂肪酸甘 油酯中的中链脂肪酸可以结合在甘油分子中的任何一个或多个羟基位置，当形成中链脂肪 酸甘油二酯或中链脂肪酸甘油三酯时，甘油分子中的羟基上结合的中链脂肪酸分子可以相 同或者不同。在本发明中，中链脂肪酸是指碳原子数6-12的脂肪酸，其可以是饱和的，也可 以是不饱和的，可以是直链的，也可以是支链的。具体地，所述中链脂肪酸为辛酸和/或癸 酸。在本发明的一个实施方案中，所述中链脂肪酸酯为碳原子数6-12的脂肪酸的甘 油一酯、甘油二酯、和/或甘油三酯；更具体地，为选自辛酸癸酸甘油酯、聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯、辛酸甘油酯、癸酸甘油酯中的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述HLB值大于12的乳化剂为选自泊洛 沙姆188、泊洛沙姆407、吐温20、吐温80、聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯醚(35)蓖 麻油、聚氧乙烯醚GO)氢化蓖麻油、生育酚琥珀酸聚乙二醇酯、聚乙二醇-32-月桂酸甘油 酯、聚乙二醇-32-硬脂酸甘油酯中的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述蛋白质或多肽为0.01-1重量份，所 述中链脂肪酸酯(例如中链脂肪酸甘油酯)为50-1000重量份，所述HLB值大于12的乳化 剂为20-2000重量份；具体地，所述蛋白质或多肽为0. 01-0. 5重量份，所述中链脂肪酸酯 (例如中链脂肪酸甘油酯)为100-500重量份，所述HLB值大于12的乳化剂为50-1000重 量份；更具体地，所述蛋白质或多肽为0. 01-0. 3重量份，所述中链脂肪酸酯(例如中链脂肪 酸甘油酯)为100-300重量份，所述HLB值大于12的乳化剂为50-500重量份。根据本发明的任一项所述的乳剂，优选地，所述乳剂还含有磷脂，并且磷脂与蛋白 质或者多肽的摩尔比为10 1至1000 1。所述磷脂与蛋白质或者多肽的摩尔比优选为 20 1至500 1，更优选为60 1至200 1。所述磷脂优选为大豆卵磷脂和/或蛋黄 卵磷脂。根据本发明的任一项所述的乳剂，其还包含药学上可接受的辅料，例如分散介质、 等渗剂、抗氧化剂、冻干保护剂、或PH调节剂。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述分散介质选自壳聚糖、二氧化硅、硅 酸铝镁、羧甲基纤维素钠、交联纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、硫酸镁、硬脂酸镁、聚乙二 醇400、和甘油中的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述等渗剂选自木糖醇、氯化钠、果糖、山 梨醇、和葡萄糖中的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述抗氧化剂选自L-半胱氨酸盐酸盐、 亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、没食子酸丙酯、谷胱甘肽、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、和维生素E中 的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述的冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、海藻 糖、葡萄糖、甘氨酸、精氨酸、和木糖醇中的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其中，所述的pH值调节剂选自盐酸、硫酸、乳 酸、苹果酸、醋酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、和磷酸二氢钠中 的一种或多种。根据本发明的任一项所述的乳剂，其为微乳剂。微乳是指由水、油、乳化剂组成的， 各向同性、透明、热力学稳定的分散体系，通常粒径小于500nm。根据本发明的任-根据本发明的任-重组人胰岛素盐酸壳聚糖生理盐水中链脂肪酸甘油J-项所述的乳剂，其通过口服给药。 -项所述的乳剂，其各组分及含量如下0. 008-0. 012 重量份适量0. 04-0. 06重量份 0. 4-0. 6重量份酯(例如 Crodamol
6TCC)o．8-1．2重量份
聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯(例如
Sc，lut。[HSl5，BASt，)o．8-1．2重量份
七温801．2一1．8重量份
维生素Eo．08-0．12重量份；
本发明还涉及该乳剂在制备治疗或预防糖尿病、或者降低血糖的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗或预防糖尿病、或者降低血糖的方法，包括给予有效量的该乳剂的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述乳剂的组分及含量如下
重组人胰岛素o．ol重量份
盐酸适量
壳聚糖o．05重量份
生理盐／j0．5重量份
中链脂肪酸甘油三酯(例如Cr。clame’l
GTCC)l重量份
聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯(例如
Sc，lut。[HSl5，BASt，)l重量份
七温801．5重量份
维生素Eo．1重量份。
根据本发明的任一项所述的乳剂，其各组分及含量如下
猪胰岛素0．004—0．006重量份氢氧化钠适量PBs缓冲液0．8-1．2重量份．．．．*气二乎主．主／、**+**‘w j，工．8—2．2重量份sofi tgen”767。
sAs0L)．泊洛沙姆1 88(例如Lu．t ro 1 F6 8，BAsF) 0．1 5-0．25重量份大豆卵磷脂(例如Ep ikuron 1 7 0，Degus s a)0．4-0．6重量份二氧化硅(例如sYL0工D⑥，GRACE DAv工s0N)0．8—1．2重量份交联纤维素钠0．1-0．1 4重量份硬脂酸镁0．01 3—0．01 7重量份甘氨酸0．2 5—0．35重量份；
本发明还涉及该乳剂在制备治疗或预防糖尿病、或者降低血糖的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗或预防糖尿病、或者降低血糖的方法，包括给予有效量的该乳剂的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述乳剂的组分及含量如下
猪胰岛素 氢氧化钠 PBS缓冲液
聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯(例如 Sofitgen 767， SAS0L)
泊洛沙姆 188 (例如 Lutrol F68, BASF) 大豆卵磷月旨(例如Epikuron 170,Degussa ) 二氧化硅(例如 SYLOID ，GRACE DAVISON ) 交联纤维素钠 硬脂酸镁 甘氨酸根据本发明的任一项所述的乳剂，其各组分及含量如下
0. 005重量份 适量 1重量份
2重量份
0. 2重量份 0. 5重量份 1重量份 0. 12重量份 0. 015重量份 0. 3重量份。
PTH 1-34
0. 0008-0. 0012 重量份
PBS缓冲液
辛酸癸酸甘油酯(例如Miglyol 812， SAS0L)
聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯(例如 Solutol HS 15， BASF)
生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(例如TPGS, Eastman) 吐温20 维生素E本发明还涉及该乳剂在制备治疗或预防骨质疏松的药物中的用途。本发明还涉及 一种治疗或预防骨质疏松的方法，包括给予有效量的该乳剂的步骤。在本发明的一个实施 方案中，所述乳剂的组分及含量如下
0. 4 - 0. 6重量份 0. 6 - 0. 8重量份
1.8-2. 2重量份
0. 4 - 0. 6重量份
0. 4 - 0. 6重量份 0. 08-0. 12 重量份;
9PTH 1-34 PBS缓冲液
辛酸癸酸甘油酯(例如Miglyol 812， SAS0L)
聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯(例如 Solutol HS 15， BASF)
生育酚琥珀酸聚乙二醇酯(例如TPGS， Eastman) 吐温20
维生素E根据本发明的任一项所述的乳剂，其各组分及含量如下
0. 001重量份 0. 5重量份
0. 7重量份 2重量份
0. 5重量份
0. 5重量份 0. 1重量份。
GLP-I
0. 08-
重量份
BASF) 170 ,
去离子水
辛酸癸酸甘油酯(例如Miglyol 812， SAS0L)
泊洛沙姆188 (例如Lutrol F68, 大豆卵缚脂(例如Epikuron Degussa) 甘油
聚乙二醇400 维生素E本发明还涉及该乳剂在制备治疗或预防糖尿病、或者降低血糖的药物中的用途。 本发明还涉及一种治疗或预防糖尿病、或者降低血糖的方法，包括给予有效量的该乳剂的 步骤。在本发明的一个实施方案中，所述乳剂的组分及含量如下
55 - 65重量份
12-18重量份
1.3-1.7重量份
6-8重量份
8-12重量份
6 - 8重量份
0. 25 - 0. 35 重量份;
GLP-]
0. 1重量份
去离子水60重量份
辛酸癸酸甘油酯(例如Miglyol 812，15重量份SAS0L)
Degussa) 甘油
泊洛沙姆188 (例如Lutrol F68, BASF) 1. 5重量份
大豆卵磷脂(例如Epikuron 170，v
、7重量份
聚乙二醇400 维生素E
10重量份 7重量份 0. 3重量份。根据本发明的任一项所述的乳剂，其为冻干乳剂(冻干制剂)。对本领域技术人员 而言，能够制得上述乳剂的冻干制剂，例如在上述乳剂中加入适量的冻干保护剂，然后通过 冷冻干燥(例如温度-40°C，工作真空度30pa)后去除水分，从而得到干燥的蛋白质或多肽 冻干乳剂。冻干后乳剂不含水相，可以做成片剂、胶囊剂等终剂型。本发明所的乳剂的制备方法，例如可以采用下面的步骤1)如下的步骤A或B:A.在4_25°C条件下，将蛋白质或多肽分子溶于水相；B.制备蛋白质或多肽的磷脂复合物；2)在20-70°C条件下，将中链脂肪酸酯、HLB值大于12的乳化剂相混合，并在 200-800rmp搅拌条件下持续搅拌，直至整个体系呈透明清亮状；3)在4-37°C条件下，将步骤1)产物加入到步骤2)产物中，并在200_800rmp条件 下继续搅拌，直至形成透明清亮的均勻制剂，最终获得含蛋白质或多肽药物的乳剂。关于步骤A，可选地，溶于水相的成分还包括pH调节剂和/或等渗剂。关于步骤B，为对本领域技术人员而言，能够制备所述的磷脂复合物。例如采用下 面的方法分别将磷脂和蛋白溶于有机相和水相，混合后，冷冻干燥(-40至-150°C，甚至 更低；压力为低于-100帕，低于-200帕，或者低于-300帕；冻干时间为12小时以上，例如 12-24小时，或者为M小时以上，例如M-48小时)，获得蛋白磷脂复合物。在优选的实施 方案中，磷脂与蛋白质或者多肽的摩尔比为10 1至1000 1。所述磷脂与蛋白质或者多 肽的摩尔比更优选为20 1至500 1，进一步优选为60 1至200 1。所述磷脂优选 为大豆卵磷脂和/或蛋黄卵磷脂。有机相为二氯甲烷、丙酮、或二甲基亚砜，优选二甲基亚 砜。关于步骤幻，可选地，相混和的还包括去离子水；可选地，还包括分散介质和/或 抗氧化剂。在本发明的一个实施方案中，所述制备方法还包括步骤4)将步骤幻中制得的乳 剂进行冻干，得到冻干乳剂。步骤B)和步骤4)中涉及的冻干步骤可以使用本发明描述的 冻干保护剂。在本发明中，术语“胶束(micelles) ”是指在溶液中由若干溶质分子或离子缔合形 成的以疏水基团为内核、亲水基团为外壳的分子有序聚集体。胶束是一种胶体分散体系，属 于一类缔合胶体。两亲性高分子物质在溶液中分散达到临界胶束浓度(CMC)时，分子缔合 自组装形成胶束。
发明的有益效果在本发明中通过选用HLB值(亲水亲油平衡值)为12以上的非离子表面活性剂 为乳化剂，中链脂肪酸酯为油相，含蛋白质多肽药物的水溶液为水相，制备出分散性好，粒 径均勻，乳化性能良好的蛋白质多肽的乳剂。本发明的显著特点，是解决了蛋白质多肽类乳 剂乳化性能的问题，能显著增加蛋白质或多肽药物的口服生物利用度，极具应用前景，并且 制备工艺简单，适于工业化生产，该产品的剂型，可以是乳剂、胶束溶液、自乳化给药体系、 膏状物质或固体粉末。


图1 回肠给药后大鼠血糖化时相图。图 2 :ΡΤΗ1-34 血药浓度。图3 :ΡΤΗ1-34药效试验。对于胫骨近端BMD、胫骨近端BMC、胫骨BMD、胫骨BMD四 组中的每一组，从左至右的四个柱状图形分别表示口服组、注射组、对照组、假手术组。

猪胰岛素 5摩尔氢氧化钠
PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司) 聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯(Sofitgen 767, SAS0L)
泊洛沙姆 188 (Lutrol F68, BASF) 大豆卵碑月旨(Epikuron 170，Degussa) 二氧化硅(SYLOID , GRACE DAVISON) 交联纤维素钠 硬脂酸镁
甘氨酸该制剂的制备方法如下1)室温下，将上述重量的猪胰岛素溶解于0. 2克PBS缓冲液，加入适量氢氧化钠，
0. 005 克 适量 1克
2克
0. 2克 0. 5克 1克 0. 12 克 0. 015 克 0. 3克
12所得溶液搅拌至澄清，得A溶液；2)室温下，将上述重量的大豆卵磷脂溶解于60ml的二甲基亚砜，搅拌至澄清后， 加入步骤1)中的A溶液，在300r/min条件下搅拌5min，随后放置到液氮中30min，所得产 物经冷冻干燥后，得到猪胰岛素大豆卵磷脂复合物；:3)70°C下，将上述重量的甘氨酸、泊洛萨姆188溶于剩余PBS缓冲液，与上述重量 的聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯，混合并搅拌至透明清亮；4)室温下，猪胰岛素大豆卵磷脂复合物，加入到步骤3)中的产物中，在200r/min 转速下将混合物搅拌15min ；5)室温下，将上述重量的二氧化硅、交联纤维素钠、硬脂酸混合后，在200r/min转 速下，逐滴加入步骤4)的产物，随后提高转速至300r/min，并保持30min ；所得产物经冷冻 干燥(温度-40°C，工作真空度30pa)后，最终获得胰岛素口服制剂，为样品1。样品1可以做成片剂、胶囊剂等终剂型。本领域技术人员可以理解，尽管实施例1中的各组分的重量单位是克，但是也可 以理解为重量份，即各组分之间满足上面的实施例1中的重量比例就可以。实施例2 胰岛素口服制剂(样品2)的制备其组成如下
重组人胰岛素 1摩尔盐酸 壳聚糖 生理盐水
中链脂肪酸甘油三酯(Crodamol GTCC ) 聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯OSolutol HS 15， BASF) 吐温80
维生素E该制剂的制备方法如下1)室温下，将重组胰岛素、壳聚糖溶于生理盐水，加入适量盐酸、搅拌至澄清，得A 溶液；》40°C下，将上述重量的中链脂肪酸甘油三酯、聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯、吐温 80和维生素E，混合并搅拌至透明清亮；3)室温下，将A溶液，逐滴加入到步骤2、的产物中，在200r/min转速下将混合物 搅拌至透明清亮，最终获得胰岛素口服制剂，为样品2。本领域技术人员可以理解，尽管实施例2中的各组分的重量单位是克，但是也可 以理解为重量份，即各组分之间满足上面的实施例2中的重量比例就可以。^MM 3 MM λ甲状旁腺激素1-34 OMMM L样品3)的制各
其组成如下


本发明属于药物学和制剂学领域，涉及一种含有蛋白质或多肽的口服制剂、其制备方法及用途。具体地，涉及一种乳剂，其包含蛋白质或多肽、水相、油相、乳化剂，其特征在于，所述油相含有中链脂肪酸酯，并且所述乳化剂包括HLB值大于12的乳化剂。制得的乳剂在保持较高的生物利用度的同时，保持优异的乳化性能。本发明的乳剂在被水稀释时，能均匀分散，生成的乳滴粒径分布比较均匀，不会导致乳液不清。