专利名称：一种海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法 “海龙蛤蚧口服液”功能主治温肾壮阳，补益精血。用于腰足酸软，面色白光白，阳萎遗精，宫冷不孕，头目眩晕。“海龙蛤蚧口服液”的原检测标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十三册。原标准中只有药材人参和黄芩的薄层色谱鉴别，由于原标准的检测项目少，方法单一，因此不能保证对该药品的质量进行全面的控制和检测。
本发明提供了海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法，用于海龙蛤蚧口服液药物的质量控制，本发明设计的检测项目合理，提供的检测方法先进，精密度及重现性好，能够全面的对海龙蛤蚧口服液进行质量控制，保证产品质量的稳定性均一性。本发明海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法，将海龙39. Ig、蛤蚧0.73g、人参 4. 68g、羊鞭4. 68g、羊外肾4. 68g、黄芩4. 68g、熟地黄3. Ig、菟丝子3. lg、何首乌3. lg、地黄3. lg、陈皮3. lg、当归1.56g、黄芪4. 68g、阳起石1.56g、莲须1.56g、甘草1.56g、川芎 1. 56g、泽泻1. 56g、锁阳1. 56g、豆蔻1. 56g、沉香1. 56g、鹿茸1. 56g、枸杞子1. 56g、肉苁蓉 0. 78g、羊油炙淫羊藿1. 56g、肉桂1. 56g、韭菜子1. 56g、蛇床子1. 56g、花椒0. 31g 二十九味成分加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，在80°C浓缩至相对密度为1. 04 1. 06的清膏，加乙醇二倍量，冷藏12小时，滤过，浓缩，加水，冷藏，滤过，滤液加苯甲酸适量使溶解， 用8%氢氧化钠调PH值4. 6 4. 8，加矫味剂木糖醇3%，调整总量至1000ml，滤过，分装， 灭菌，即得。淡棕色至红棕色的液体；味微苦。本发明海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法，1)取海龙蛤蚧口服液30ml，加乙醚20ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层用水饱和的正丁醇提取3次，用量依次为20ml、 15ml、15ml，合并正丁醇液，加4%氢氧化钾溶液30ml洗涤一次，弃去洗液，再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水液，正丁醇液置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rgl对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μ1，对照品溶液5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以 65:35:10的三氯甲烷一甲醇一水10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；2)取海龙蛤蚧口服液40ml，用盐酸酸化，pH值3 4，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每Iml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液ΙΟμΙ，对照品溶液5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以1 1 1的乙酸丁酯一甲酸一水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%的三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；3)取海龙蛤蚧口服液60ml，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次40ml，合并乙酸乙酯液， 置蒸发皿中蒸干，残渣加乙酸乙酯0. 5ml使溶解，作为供试品溶液；另取橙皮苷对照品，力口甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液 15μ1，对照品溶液ΙΟμΙ，分别点于同一含0. 5 %氢氧化钠的硅胶G薄层板上，以100 17 13 的乙酸乙酯一甲醇一水为展开剂，展开5cm，再以20 10 1 1的甲苯一乙酸乙酯一甲酸一水的上层溶液为展开剂，展开13cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯下检视，波长为365nm;供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；4)取海龙蛤蚧口服液60ml，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，加1 %氢氧化钠溶液振摇提取3次，每次20ml，弃去氢氧化钠溶液，正丁醇层加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇0. 5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μ1，对照品溶液5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10:20:11:5的三氯甲烷一乙酸乙酯一甲醇一水10°C以下放置的下层溶液为展开齐U，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；5)检查pH值为4.0 5. 0，相对密度无糖型应不低于1. 01 ；低糖型应不低于1. 05 ； 其他应符合合剂中国药典2010年版一部附录I J项下有关的各项规定；6)含量测定淫羊藿苷照高效液相色谱法测定
淫羊藿苷照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定； 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以25 75的乙腈_水为流动相；检测波长为270nm，柱温为室温。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于 1500 ；
对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，用甲醇溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得，淫羊藿苷每Iml含8 μ g ；
供试品溶液的制备精密量取海龙蛤蚧口服液40ml，加乙醚振摇提取3次，每次40ml，弃去乙醚液，水层加水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，加
0.5mol/L碳酸钠溶液振摇提取3次，每次40ml，弃去碳酸钠溶液，正丁醇层置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇25ml使溶解，作为供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μ 1，注入液相色谱仪，测定， 计算，即得。海龙蛤蚧口服液每Iml含淫羊藿以淫羊藿苷分子式为C33H4tlO15计，不得少于
1.35 μ g0本发明的积极效果在于在原检测标准基础上增加了海龙蛤蚧口服液处方中陈皮、黄芪的薄层色谱检测方法，改进了人参和黄芩的薄层色谱法，增加了处方中淫羊藿的高效液相色谱法测定含量；本发明设计的检测项目合理，提供的检测方法先进，精密度及重现性好，用于海龙蛤蚧口服液药物的质量控制，能够全面的对海龙蛤蚧口服液进行质量控制，保证产品质量的稳定性均一性。本发明在原低糖口服液的基础上，创新增加了无糖型口服液，使得很多糖尿病的适用者可以服用本口服液，增加了适应症人群。


图1 人参薄层色谱图
1、人参皂苷对照品Rgl 2、3、4、三批样品；5、阴性对照
图2 黄芩薄层色谱图
1、黄芩苷；2、3、4、三批样品；5、阴性对照
图3 陈皮薄层色谱图
1、橙皮苷；2、；3、；4、三批样品；5、阴性对照
图4 黄芪薄层色谱图
1、黄芪甲苷；2、3、4、三批样品；5、阴性对照
图5 淫羊藿苷对照品紫外吸收图
图6 淫羊藿苷对照品标准曲线图
图7 淫羊藿苷对照品HPLC色谱图
图8 供试品溶液的HPLC色谱图
图9 阴性对照液的HPLC色谱图。

取海龙39. Ig、蛤蚧0. 73g、人参4. 68g、羊鞭4. 68g、羊外肾4. 68g、黄芩4. 68g、熟地黄3. Ig、菟丝子3. lg、何首乌3. lg、地黄3. lg、陈皮3. lg、当归1.56g、黄芪4.68g、阳起石1. 56g、莲须1. 56g、甘草1. 56g、川芎1. 56g、泽泻1. 56g、锁阳1. 56g、豆蔻1. 56g、沉香 1. 56g、鹿茸1. 56g、枸杞子1. 56g、肉苁蓉0. 78g、淫羊藿(羊油炙)1. 56g、肉桂1. 56g、韭菜子1. 56g、蛇床子1. 56g、花椒0. 31g 二十九味成分加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，在 80°C浓缩至相对密度为1.04 1.06的清膏，加乙醇二倍量，冷藏12小时，滤过，浓缩，力口水，冷藏，滤过，滤液加苯甲酸适量使溶解，用8%氢氧化钠调PH值4. 6 4. 8，加矫味剂木糖醇3 %，调整总量至IOOOml，滤过，分装，灭菌，即得。其检测方法包括一下步骤
1)取海龙蛤蚧口服液30ml，加乙醚20ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层用水饱和的正丁醇提取3次，用量依次为20ml、15ml、15ml，合并正丁醇液，加4%氢氧化钾溶液30ml 洗涤一次，弃去洗液，再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水液，正丁醇液置蒸发皿中蒸干， 残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rgl对照品，加甲醇制成每Iml含 Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μ1，对照品溶液5μ1， 分别点于同一硅胶G薄层板上，以65:35:10的三氯甲烷一甲醇一水10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见附图1 ；2)取海龙蛤蚧口服液40ml，用盐酸酸化，pH值3 4，加乙酸乙酯振摇提取3次， 每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每Iml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验， 吸取供试品溶液10μ1，对照品溶液5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以1 1 1的乙酸丁酯一甲酸一水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%的三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见附图2 ；
3)取海龙蛤蚧口服液60ml，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次40ml，合并乙酸乙酯液， 置蒸发皿中蒸干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品，力口甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液 15μ1，对照品溶液10μ1，分别点于同一含0. 5 %氢氧化钠的硅胶G薄层板上，以100 17 13 的乙酸乙酯一甲醇一水为展开剂，展开5cm，再以20 10 1 1的甲苯一乙酸乙酯一甲酸一水的上层溶液为展开剂，展开13cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯下检视，波长为365nm。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见附图3 ；
4)取海龙蛤蚧口服液60ml，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，加1 %氢氧化钠溶液振摇提取3次，每次20ml，弃去氢氧化钠溶液，正丁醇层加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇0. 5ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μ1，对照品溶液5μ1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以10:20:11:5的三氯甲烷一乙酸乙酯一甲醇一水10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见附图4 ；
5)检查pH值为4.0 5. 0，相对密度无糖型应不低于1. 01 ；低糖型应不低于1. 05 ； 其他应符合合剂中国药典2010年版一部附录I J项下有关的各项规定；
6)含量测定照高效液相色谱法测定；
淫羊藿苷照中国药典2005年版一部录VI D高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以25 75的乙腈-水为流动相；检测波长为270nm，柱温为室温。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于 1500 ；
对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，用甲醇溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得，淫羊藿苷每Iml含8 μ g ；
供试品溶液的制备精密量取海龙蛤蚧口服液40ml，加乙醚振摇提取3次，每次40ml， 弃去乙醚液，水层加水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，加0. 5mol/L碳酸钠溶液振摇提取3次，每次40ml，弃去碳酸钠溶液，正丁醇层置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇 25ml使溶解，作为供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。海龙蛤蚧口服液每Iml含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H4tlO15)计，不得少于1. 35μ g。高效液相色谱测定淫羊藿苷含量法标准确定说明
一、仪器、试药与试剂仪器高效液相色谱仪(TSP，美国);UV100紫外检测器；试药淫羊藿苷对照品购于中国药品生物制品检定所，批号110737-200413 ；规格供含量测定用。 试剂乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水。二、对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，用甲醇溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得，淫羊藿苷每Iml含8 μ g ；
三、供试品溶液的制备与测定精密量取海龙蛤蚧口服液40ml，加乙醚振摇提取3次， 每次40ml，弃去乙醚液，水层加水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，加 0. 5mol/L碳酸钠溶液振摇提取3次，每次40ml，弃去碳酸钠溶液，正丁醇层置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇25ml使溶解，作为供试品溶液； 四、最大吸收波长的确定用762型紫外分光光度计测得淫羊藿苷标准品(甲醇定容) 的最大吸收波长为269nm，与中国药典2010版一部淫羊藿药材项下含量测定的波长相近， 因此确定检测波长为270nm，见附图5。五、流动相选择乙腈一水(25:75)作为本制剂淫羊藿含量测定流动相。六、色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水 (25:75)为流动相；检测波长为270nm;柱温40 °C ；流速lml/min。 七、理论板数的计算依前述色谱条件测定，测定结果以淫羊藿苷峰计为N=5. 54X (46. 3/1. 4) 2 =6046，故确定以淫羊藿苷峰计算理论板数不少于1500。八、方法学考察 1、标准曲线的制备
精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇分别制成每Iml含37. 00、18. 50,9. 25,4. 63、 2.31,1. 16μδ的对照品溶液，分别吸取20μ1，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积分值为纵坐标，淫羊藿苷浓度为横坐标，绘制标准曲线，得一直线，回归方程Y = 74988x+22920,r = 1. 0，结果表明，淫羊藿苷在0. 0232μδ 0. 74μδ范围内具有良好的线性关系，见附图6。2、空白试验
按照处方比例和海龙蛤蚧口服液制备工艺，制成不含淫羊藿的空白样品，再按供试液的制备方法制成空白对照溶液，依法测定，结果表明，空白对样品测定无干扰，见附图7、8、 9。3、精密度试验
3. 1重复性试验
对同一供试品重复测定6次，计算相对标准偏差，结果淫羊藿苷RSD为1. 73%。表明该方法重复性良好，结果见表1。


本发明公开了一种海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法，在原检测标准基础上增加了海龙蛤蚧口服液处方中陈皮、黄芪的薄层色谱检测方法，改进了人参和黄芩的薄层色谱法，增加了处方中淫羊藿的高效液相色谱法测定含量。本发明设计的检测项目合理，提供的检测方法先进，精密度及重现性好，用于海龙蛤蚧口服液药物的质量控制，能够全面的对海龙蛤蚧口服液进行质量控制，保证产品质量的稳定性均一性。