专利名称：L－苏氨酸的生产方法图1中。ppc基因是从苏氨酸产生菌株-TF4076中获得的。分离染色体DNA，用限制酶Sal I消化，将其电泳以选择性地分离4-5Kb DNA片段。将分离的DNA片断作为模板，使用引物1(5’-aggaattcttccgcagcatttgacgtcac-3’)和引物2(5’-aggaagcttttagccggtattacgcatacc-3’)，扩增ppc基因。用EcoRI和HindIII消化扩增产物，而后再次将其电泳以最终分离一种2.8Kb的ppc基因片段。用来一种自墨西哥国立大学的7.6Kb的pBRINT-TsGm(一种pBRINT-Ts载体)来克隆(Sylvie Le Beatriz等.，1998，pBRINT-Ts一种有温度敏感复制子的质粒家族，为染色体整合入大肠杆菌的lacZ基因而设计，基因，223，pp213-219)。用相同的限制酶EcoR I和HindIII双消化pBRINT-TsGm，用T4 DNA连接酶将其与分离的ppc基因片段连接。通过电穿孔，用连接的DNA转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有抗生素50毫克/升羧苄青霉素和5毫克/升庆大霉素的LB固体培养基(酵母抽提物5克/升；细菌用胰蛋白胨10克/升、氯化钠10克/升；细菌培养用琼脂1.7％；pH7.0)上培养。接下来，收集单集落。将单集落在含有相同抗生素的LB培养基上培养以从生长菌株中分离质粒。首先鉴别每个质粒的大小并且用限制酶EcoR I和HindIII双消化，以分离出2.8Kb的DNA片段。鉴别所得到的DNA片段，由此完成含有ppc基因的重组质粒pGmPPC(10.7Kb)的构建。实施例2含有苏氨酸操纵子和ppc基因的染色体DNA整合载体用TF4076的染色体DNA克隆构建的重组质粒载体pAT94(韩国专利申请号92-24732)，被用于苏氨酸操纵子，实施例1中的重组质粒pGmPPC被用于ppc基因。来自墨西哥国立大学的pBRINT-TsGm(一种pBRINT-Ts载体)被用作染色体DNA整合载体(Sylvie Le Beatriz等.，1998，pBRINT-Ts一种有温度敏感复制子的质粒家族，为染色体整合入大肠杆菌的lacZ基因而设计.，基因.，pp213-219)。图2阐述了重组质粒的构建方法。用限制酶HindIII和BamHI双消化pAT94。用电泳从双消化物中分离出6.4千碱基对的苏氨酸操纵子DNA片段。用HindIII和EcoRI双消化pGmPPC以分离出2.8千碱基对的ppc基因片断。用EcoRI和BamHI消化pBRINT-TsGm质粒载体，用同样方法分离完全消化的DNA片段。将得到的质粒载体消化产物、分离的苏氨酸操纵子DNA片段、和ppc基因片断混和，用T4 DNA连接酶连接。通过电穿孔用连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有抗生素50毫克/升羧苄青霉素、5毫克/升庆大霉素的LB固体培养基(酵母抽提物5克/升；细菌用胰蛋白胨10克/升、氯化钠10克/升；细菌培养用琼脂1.7％；pH7.0)上培养。接下来，收集单集落。将单集落在含有相同抗生素的LB培养基上培养以从生长菌株中分离质粒。首先鉴别每个质粒的大小并且用限制酶EcoR I和HindIII双消化以分离出9.2和7.9千碱基对的DNA片段。鉴别所得到的DNA片段，由此完成对含有苏氨酸操纵子和ppc基因的重组质粒pGmTN-PPC(17.1千碱基对)的构建。实施例3整合有染色体重组质粒菌株的筛查用从大肠杆菌菌株DH5α中分离出来的重组质粒pGmTN-PPC转化TF4076(一种苏氨酸产生株)，在含有5毫克/升庆大霉素的LB固体培养基(酵母抽提物5克/升；细菌用胰蛋白胨10克/升、氯化钠10克/升；细菌培养用琼脂1.7％；pH7.0)上培养，在30摄氏度培养60个小时。将每个单集落接种到0.5毫升的LB中，30摄氏度下培养4小时。将培养物的等分试样转移到10毫升的LB中，30摄氏度下培养6小时，而后37摄氏度下过夜。将培养物的10-3-10-6的稀释物接种到含有5毫克/升庆大霉素的LB固体培养基中。此时，也将12微升的IPTG(0.1M)和60微升的X-gal(2％)接种到LB固体培养基上。44摄氏度下培养24小时，筛查对羧苄青霉素敏感的、呈白色集落状的重组菌株，该集落不能在含有15毫克/升的羧苄青霉素的LB固体培养基上生长。经筛查的重组菌株确证存在预期的质粒，其中ppc基因和苏氨酸操纵子被整合到每个菌株染色体DNA的lacZ基因位点。实施例4烧瓶培养重组菌株的苏氨酸生产能力比较通过使用锥形烧瓶中的苏氨酸滴度培养基，筛查了30个重组菌株的单集落来对苏氨酸的生产能力作比较，其中重组菌株的染色体中整合有重组质粒。每种情况所用的苏氨酸滴度培养基组合物列在表1中。集落在32摄氏度的培养箱中，在LB固体培养基上培养过夜。用一铂环量的每种培养物接种20毫升的滴度培养基，在32摄氏度，250转数/分钟的条件下培养48小时。分析结果见表2。重组菌株的所有30个集落都显示出极好的生产能力，包括有8个集落生产出26克/升或更高苏氨酸，与宿主菌株TF3076比较，TF3076只生产出20克/升的苏氨酸。这种重组菌株被命名为“pGmTN-PPC12”，该重组菌株记录了最高苏氨酸生产能力27.0克/升，比宿主菌株的产量高了35％。pGmTN-PPC12菌株于2001年1月5日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号KCCM10236。表1.苏氨酸滴度培养基组合物 表2.重组菌株烧瓶滴度测试的结果 实施例5使用发酵罐比较苏氨酸生产能力发酵罐中苏氨酸的生产能力在重组菌株pGmTN-PPC12与宿主菌株TF4076之间作比较，其中的重组菌株选自实施例4中的其最高苏氨酸滴度。使用的初始培养基组合物见表3。还包含有10克/升的葡萄糖和0.1克L-甲硫氨酸的LB培养基用来作种子培养，接种到发酵罐中的初始体积被确定在3-5％目的初始培养的体积。每次加入葡萄糖使终浓度为5％重量，伴随加入的KH2PO4为1％重量，加入次数超过6次。在这里，每一次葡萄糖的添加取决于葡萄糖的缺失。培养的起始体积为1.5升，终末体积为3.0升。通过发酵作用添加的葡萄糖总浓度为250克/升。在发酵过程中，培养基搅动率为700-1000转数/分钟，温度控制在32摄氏度，用25-28％的氨水将PH值调节在7.0。空气流动率调节到0.1vvm。结果见表4。如表4所示，宿主菌株TF4076生产出75.3克/升的苏氨酸，产量相对于葡萄糖消耗量为30.1％。相比较，重组菌株pGmTN-PPC12生产出102克/升的苏氨酸，产量为40.8％，比宿主菌株TF4076高出35.4％。此外，在重组菌株中观察到了与宿主菌株类似的发酵模式，在发酵过程中没有糖耗的降低，由于生长抑制，这种情况常常出现在重组菌株中。表3. 5升发酵罐中的初始培养基组合物 表4.重组菌株的苏氨酸发酵生产结果 如上所述，依照本发明，2个或多个ppc基因和苏氨酸操纵子被包含在染色体DNA中，由此提高ppc基因和某些基因的表达，其中，ppc基因编码一种酶，该酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化为苏氨酸生物合成的前体——草酰乙酸；所述的某些基因能够编码酶，这些酶参与从草酰乙酸到苏氨酸的生物合成路径，例如thrA(天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶)，thrB(高丝氨酸激酶)，thrC(苏氨酸合成酶)。本发明可以显著提高L-苏氨酸的生产能力，比宿主菌株高出35％。

本发明提供了一种使用微生物生产L－苏氨酸的方法。在该方法中，微生物固有的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和苏氨酸操纵子被保留，额外的一个或多个拷贝的每种ppc基因和苏氨酸操纵子被整合到微生物染色体DNA的特殊位点。因此，微生物染色体DNA中包含了两个或两个以上的ppc基因和苏氨酸操纵子，从而提高了ppc基因和某些基因的表达，其中ppc基因编码一种能将磷酸烯醇丙酮酸转化为苏氨酸生物合成前体——草酰乙酸的酶；所述的某些基因能够编码参与从草酰乙酸到苏氨酸生物合成路径的酶，包括thrA(天冬氨酸激酶－高丝氨酸脱氢酶)，thrB(高丝氨酸激酶)，和thrC(苏氨酸合成酶)，因此显著提高了L－苏氨酸的生产能力。