专利名称：：一个受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用的制作方法：小麦赤霉病(FHB)是一种真菌性病害，它能对小麦，大麦等禾谷类以及玉米等作物产生病害而直接造成作物减产和品质下降；另一方面，收获的粮食由于被deoxynivalenol(DON)和其他一些单端孢霉烯类毒素所污染，人和动物误食会产生毒害。目前随着全球气候的变暖，该病在全世界各个小麦种植区迅速蔓延，控制小麦赤霉病的发生发展已经成为世界性的难题。选育抗赤霉病小麦品种是控制赤霉病最经济和有效的途径。明确其抗病机制，克隆抗病相关基因，对于防治小麦病害、开展抗病育种改良具有重要理论指导意义。小麦抗病分子机制是目前小麦赤霉病研究的热点课题。赤霉病病原菌与寄主小麦之间的互作关系十分复杂。赤霉病菌具有腐生兼寄生的特性，既能在死体植物上生活，也能从活体寄生植物上汲取营养；小麦对赤霉病抗性是非小种专化的，同时也是多基因控制的数量遗传性状。分析病原菌-寄主互作过程中的基因表达情况，有助于发掘抗病基因和发现抗病通路，对于阐明抗病机制具有重要意义。利用各种途径和方法，如构建受赤霉病菌诱导表达的cDNA文库、SSH文库，利用双向电泳结合质谱技术、芯片技术等，筛选一些可能与赤霉病抗性相关的基因或蛋白，如各种病程相关蛋白、细胞色素P450、葡萄糖基转移酶、ABC转运蛋白等，也发现与抗病相关的信号通路，如茉莉酸途径、乙烯途径等。小麦地方品种望水白是到目前为止普遍公认的对赤霉病抗性强，抗性稳定。本研究根据芯片检测望水白和感病突变体NAUH117穗部受赤霉菌诱导后基因表达谱差异，在望水白克隆出一个受体蛋白激酶基因，并将其转化感赤霉病病小麦品种扬麦158中，以期提高赤霉病抗性。
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种受体蛋白激酶基因TaRLK-B。本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现受体蛋白激酶基因TaRLK-B,来自普通小麦(TriticumasetivumL.)地方品种望水白，其核苷酸序列为SEQIDNO.I。该受体蛋白激酶基因编码的蛋白质TaRLK-B，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。含有所述的受体蛋白激酶基因TaRLK-B的表达载体。所述的含有权利要求I所述的受体蛋白激酶基因TaRLK-B的表达载体优选以PAHC25为出发载体，将权利要求I所述的TaRLK-B基因插入pAHC25的SmaI和SacI酶切位点间所得。所述的受体蛋白激酶基因TaRLK-B在构建抗赤霉病小麦品种中的应用。所述的含受体蛋白激酶基因TaRLK-B的表达载体在构建抗赤霉病小麦品种中的应用。有益效果本发明首次从小麦种克隆得到了一个受体蛋白激酶基因TaRLK-B及其所编码的蛋白质TaRLK-B，为小麦中首次报道。将其插入表达载体PAHC25，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感赤霉病小麦品种对赤霉病的抗性。TaRLK-B用于基因工程育种，将其导入易感赤霉病小麦品种中，能够获得具备赤霉病抗性的小麦种质。图I利用中国春第三部分同源群缺体-四体和部分3B短臂缺失系材料对TaRLK-B基因进行染色体区段定位，将TaRLK-B定位到3BS的O.78-0.87区段1，Marker;2，望水白(Wangshuibai);3，H117;4，中国春(ChineseSpring)；5,N3A/T3B；6,N3A/T3D；7,N3B/T3D；8，N3B/T3A;9、N3D/T3A;10、N3D/T3B;11，3BS_3;12，3BS_8;13，3BS_9;14，3BS_1;15，水对照。图2TaRLK_B在望水白、NAUH117和Alondra’s受赤霉菌诱导后的穗组织中的半定量RT-PCR横坐标表示赤霉菌诱导0h、6h、24h、48h、96h的小麦穗组织样品图3TaRLK_B超量表达载体的构建A:植物表达载体pAHC25；BpAHC25=TaRLK-B表达载体构建图4TaRLK_B转化扬麦158的Ttl代阳性植株的PCR分子鉴定泳道I为DNAladder,泳道2为水对照，泳道3为未转化扬麦158对照，泳道4为包含目的基因的载体对照，泳道5-11为阳性转化植株。图5TaRLK_B转化扬麦158的TO代阳性植株的赤霉病抗性鉴定结果(病小穗率)xj6、xj10,xj26,xj35、xj36,xj37和xj38为鉴定的阳性转化植株，xj33和xj34为鉴定阴性植株，扬麦158为转基因受体小麦,望水白为抗病对照，Alondra’s和绵阳85-45为感病对照。图6中国春小麦及中国春小麦3B缺体/四体和缺失系的染色体示意图a，普通小麦中国春染色体示意图；b，中国春小麦3B缺体/3A四体染色体示意图；c，中国春小麦3B缺体/3D四体染色体示意图；d，中国春小麦3B缺失系3BS-3染色体示意图，O.87指示3BS染色体短臂缺失顶端O.13部分；e，中国春小麦3B缺失系3BS-8染色体示意图，O.78指示3BS染色体短臂缺失顶端O.22部分具体实施例方式实施例I望水白受赤霉菌诱导的穗组织中一个受体蛋白激酶基因克隆望水白(裴自友贾高峰等普通小麦籽粒DON含量的配合力分析，作物学报ACTAAGRONOMICASINICA,2007,33(5):731-737)是高抗赤霉病的材料。本实验室在前期研究中，利用快中子辐射望水白，筛选获得感赤霉病突变体NAUHl17(Jinxiao,XinpingJiaetal.AFast-neutronInducedFragmentDeletionof3BSinwheatvarietyWangshuibaiIncreasedItsSusceptibilitytoFusariumHeadBlight，ChromosomeResearch，2011-2-18，19=225-234.)，该突变体在3BS的部分区域发生染色体缺失，且缺失片段正好是望水白抗赤霉病主效QTL所在区域。为了获得望水白中与赤霉病抗病相关的基因，本发明利用小麦基因芯片筛选望水白和NAUH117赤霉菌接种前后的差异表达基因，从中选择重要基因进行功能验证。在抽穗期对小穗采用单花滴注法接种赤霉菌，赤霉菌株是从田间自然发病植株上分离和培养得到(赤霉菌采集和培养方法见刘传琴，关淑卿，黄巍.小麦赤霉菌分离培养及接种，现代化农业，1998:9)，用不含赤霉菌的水接种作为阴性对照，共4个处理。接种后24h取穗样，用TRIZOL(invitrogen)按试剂说明书分别提取总RNA，进行基因芯片杂交(Affymetrix小麦基因表达谱芯片,partnumber900515),该实验在“上海国家生物芯片工程中心”完成。以实验组信号与对照组信号比值大于2为标准筛选上调表达基因。其中I个基因推测为受体蛋白激酶类似物(receptorkinasehomolog,探针号为Ta.25825.I.Al_at)，在望水白中受赤霉菌诱导上调表达，在NAUH117中不上调表达，挑选进行候选基因克隆研究。通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)，在望水白受赤霉菌诱导穗组织中获得该基因的全长。该基因全长1843bp的序列，序列如SEQIDNO.I所示，序列分析显示该序列包含一个全长0RF，其中5，-UTR(非翻译区)332bp、3’-UTR371bp、0RF(开放阅读框)1140bp,编码380个氨基酸,经SMART软件(http://smart,embl-heidelberg.de/)分析,该基因编码了一种跨膜蛋白，在N端具有22氨基酸信号肽序列(Signalsequence)，并且包含由约80个氨基酸组成的未知功能胞外区，中央位置是由28个氨基酸组成的疏水跨膜区域；C端包括一个由211个氨基酸组成丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(S/TPK)胞内域，具有这种蛋白结构的基因为受体类蛋白激酶(Receptor-LikeKinase,RLKs)，将该基因命名为TaRLK-B。实施例2TaRLK_B基因的染色体定位根据TaRLK-B基因序列设计特异引物Pl(tatttcagcagccctatcac,SEQIDNO.3)和P2(tgattgatcctggtagcatt,SEQIDNO.4),以一套普通小麦品种中国春的缺体-四体以及缺失系(E.R.Sears,陈佩度，翁益群.中国春非整倍体的历史，麦类作物学报，1990，216-19;远藤隆等.普通小麦染色体缺失系统的育成，1995，2:5-8.本发明中所用缺体/四体和缺失系材料引自美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心(WheatGeneticsResourceCentre,KansasStateUniversity,USA))的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，对TaRLK-B基因进行染色体物理定位。PCR程序10-50ngDNA模板，10μM的Pl和P2各0.5μI；2.5μIlOXbuffer；2.5μI2.5mM的dNTP；1.5μI25mM的Mg2+；0.25μI(5U/μI)Taqpolymerase(TaKaRa),加水至25μI。PCR反应条件为94°C预变性3min；94°C45秒,48°C45秒，72°CI分钟，33个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物经8%的聚丙烯凝胶电泳检测。该引物只在第三部分同源群缺体-四体中出现扩增带型的差异，TaRLK-B在3B缺体/3A四体、3B缺体/3D四体的材料(附图6-b，c)和NAUH117中扩增都缺少一条213bp的条带，表明TaRLK-B位于3B染色体上，并且在NAUHl17缺失。进一步利用中国春3B的缺失系(图6-e，f)DNA为模板进行PCR扩增对TaRLK-B进行染色体区段定位，将该基因定位于3BS的FL0.78-0.87的染色体区段，即位于望水白3BS抗FHB主效QTL区域(图I)。实施例3TaRLK_B基因受赤霉菌诱导的表达特征利用赤霉菌对望水白、NAUHl17和感赤霉病小麦品种Alondra’s(李明浩，陈炜，邢莉萍，等，普通小麦品种Alondra’s遗传转化体系的建立，植物学报，2010，45(4)=466-471ο)诱导0h、6h、24h、48h、96h，应用能特异扩增TaRLK-B的引物对Pl(tatttcagcagccctatcac,SEQIDNO.3)和P2(tgattgatcctggtagcatt,SEQIDNO.4),对TaRLK-B基因受赤霉菌诱导进行实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析。分别提取经诱导不同时间后的望水白、NAUH117和Alondra’s的总RNA，逆转录合成cDNA第一链所用试剂均购自Takara公司。在200ul的eppendorf离心管中加入Iug总RNA、2ul的Oligod(T)18primers(100nmol/mL),用去RNA酶的无菌水补足溶液体积至IOul;混勻后旋转离心，在PCR仪上70°C孵育lOmin，然后冰上骤冷2min，离心收集；在冰上依次加入以下成分5XReverseTranscriptaseXLBuffer4ul,dNTPMixture(lOmmol/Leach)2ul,RibonucleaseInhibitor(40U/ul)0.5μI,ReverseTranscriptaseXL(AMV)(5U/ul)Iul,用去RNA酶的无菌水补足溶液体积至20ul。混匀，室温下放置IOmin;在PCR仪上42°C，40min；48°C,30min；70°C,15min终止反应，冰上冷却并离心收集;加入O.5μIRNaseH,37°C，30min;离心收集，稀释10倍后于_20°C保存备用。PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uLPCR反应体系中含2XSYBRGreenPCRMasterMix10uL，O.5μM引物Pl和P2，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为95°C10分钟，然后95°C15秒、60°C30秒，72°CI分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平定量用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在望水白中TaRLK-B受赤霉菌诱导上调表达，24h后表达水平最高，从48h后开始下调；在NAUH117中TaRLK-B缺失，因此在赤霉菌诱导前及诱导后的各个时段都不能检测其表达。在感赤霉病小麦品种Alondra’s中，其表达水平在各个时间段也都远低于在望水白中的表达量(图2)。Q-PCR的结果表明，TaRLK-B可能与赤霉病抗性相关。实施例4TaRLK_B正义表达载体构建及其转化普通小麦扬麦158及抗病性鉴定以来自望水白的TaRLK-B基因cDNA为模板,使用引物对P3(tcccccgggatggctgtggtgagtgcctcttt,SEQIDNO.5)和P4(CRaRctctcacctRRRRcctRatac,SEQIDNO.6)进行PCR扩增，回收扩增片段。用SmaI和SacI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到SmaI和SacI双酶切后的载体pAHC25(ChristensenAH,QuailPH,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants,TransgenicResearch,1996,5:213-218.)中，将TaRLK-B置于Ubi启动子后面的多克隆位点处，替换掉载体本身带有的GUS基因。由此将目标基因TaRLK-B克隆到强启动子Ubi的下游，获得表达载体pAHC25=TaRLK-B(图3)。挑取预培养7天约2000块扬麦158幼胚愈伤组织，将携有目的基因TaRLK-B的过量表达载体PAHC25=TaRLK-B通过基因枪轰击法转化到扬麦158，轰击前在高渗培养基(MS+ABAO.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，PH5.8)上预处理4-5小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-Dlmg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos,pH5.8)，筛选培养2周。然后将具有除草剂抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺lmmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KTlmg/L+IAAO.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂O.8%,pH5.8)进行分化，待分化芽长至2-4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8%，pH5.8)中。至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共40棵。提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用基因内部引物P5(cgacatgacaatgattcac,SEQIDNO.7)和载体上终止子引物P6(cgctatattttgttttctatcgcgt,SEQIDNO.8)进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序10-50叩/111基因组模板，1(^]1的？5和？6各0.54I；2.5μIlOXbuffer；2.5μI2.5mM的dNTP;I.5μI25mM的Mg2+；0.25μI(5U/μI)Taqpolymerase(TaKaRa)，加水至25μI。PCR反应条件为94°C预变性3分钟；94°C45秒，48°C45秒，72°CI分钟，33个循环；72°C延伸10分钟。PCR产物经8%的聚丙烯凝胶电泳检测。其中7株可以扩增800bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为:xj6、xjl0、xj26、xj35、xj36，xj37和xj38(图4)。对所有鉴定的阳性植株、阴性植株(xj33、xj34)进行赤霉病抗性鉴定(赤霉病抗性鉴定采用单花滴注方法将10μI赤霉菌孢子悬浮液5000个/ml滴加到刚开花穗子中部的一朵小花，套袋保湿3d后除去袋子，接种后21d后调查病小穗率。病小穗率=(发病小穗数/总小穗数)X100%)，以未转化感病小麦品种扬麦158、抗病品种望水白和感病品种Alondra’S、绵阳8545(裴自友贾高峰等,普通小麦籽粒DON含量的配合力分析,作物学报，ACTAAGRONOMICASINICA,2007,33(5):731-737)为对照。转基因Ttl代阳性植株xj26、xj35,xj36,xj37与未转化扬麦158相比，赤霉病抗病水平得到提高(图5)。权利要求1.受体蛋白激酶基因TaRLK-B，其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO.I。2.权利要求I所述受体蛋白激酶基因编码的蛋白质TaRLK-B，其特征在于氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.含有权利要求I所述的受体蛋白激酶基因TaRLK-B的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的含有权利要求I所述的受体蛋白激酶基因TaRLK-B的表达载体是以PAHC25为出发载体，将权利要求I所述的TaRLK-B基因插入pAHC25的SmaI和SacI酶切位点间所得。5.权利要求I所述的受体蛋白激酶基因TaRLK-B在构建抗赤霉病小麦品种中的应用。6.权利要求3或4所述的含受体蛋白激酶基因TaRLK-B的表达载体在构建抗赤霉病小麦品种中的应用。全文摘要本发明属于基因工程领域，公开了一个受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用。受体蛋白激酶基因TaRLK-B的cDNA序列为SEQIDNO.1及其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2。该基因来自普通小麦(TriticumasetivumL.)望水白品种，为在小麦中首次报道。TaRLK-B在抗赤霉病小麦品种望水白中受赤霉菌诱导表达增强，且表达水平远高于在感病小麦品种Alondra’s中的表达水平。将该基因插入pAHC25获得过量表达载体，并转化感赤霉病小麦品种扬麦158，T0代抗赤霉病鉴定，结果表明TaRLK-B的过量表达可以提高感赤霉病小麦品种对赤霉病的抗性。文档编号C12N9/12GK102586291SQ201110428520公开日2012年7月18日申请日期2011年12月20日优先权日2011年12月20日发明者曹爱忠,李明浩,王加,王海燕,王秀娥,肖进,薛钊坤,裴海岩,贾新平,赵维萍,邢莉萍,陈佩度,陈炜申请人:南京农业大学