专利名称：复制缺陷甲病毒表达载体系统及疫苗制备方法披膜病毒科中的甲病毒的核酸序列主要由两部分构成，结构蛋白和非结构蛋白序列组成。带有非结构蛋白序列复制子可以RNA的复制，并能大量扩增结构基因的亚基因组，能够大量表达替换结构基因的外源蛋白的大量表达。但是结构基因的缺失，其无法单独包装成具有感染力的病毒颗粒，也就无法再次感染细胞。利用这一特点，可以使用复制缺陷甲病毒作为外源基因表达载体。常见的甲病毒有基孔肯雅病毒(chikimgimya virus, CHIKV)、辛德比斯病毒(sindbis virus, SIN), Semliki Forest 病毒(semliki Forest virus, SFV).以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine enceplitis virus, VEEV)寸。披膜病毒科中的甲病毒表达载体系统是一种成熟、安全、高效的表达系统，已广泛用于蛋白的表达、结构和功能的研究。由于该系统是一个高效的蛋白表达系统，因此也作为表达系统可以用来表达外源蛋白。其中最常用的该类病毒载体为辛德比斯病毒(sindbis virus, SIN) > Semliki Forest 病毒(semliki Forest virus, SFV).以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine enceplitis virus, VEEV)等多个病毒。甲病毒表达载体系统的主要特点为由外源抗原基因取代结构蛋白基因，但保留了 “自主复制”功能，能够高水平的进行RNA复制和外源基因的表达。因此可以直接用做RNA、 DNA疫苗。在甲病毒结构蛋白辅助载体帮助下，复制子DNA疫苗可以包装成重组甲病毒颗粒，其可以成为一种重组的甲病毒病毒样颗粒疫苗，它可通过和病毒感染一样的途径感染免疫细胞，从而有效地诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。甲病毒的核酸编码序列可分为其结构蛋白序列和非结构蛋白序列。两者的表达产物结合在一起才能包装成具有感染力的病毒。甲病毒类的结构蛋白具有一定的毒性，野生型甲病毒类结构蛋白在细胞内的表达会引起细胞自杀。现有的甲病毒表达载体系统，一般通过分析甲病毒的序列，然后将其结构蛋白序列和非结构蛋白序列分离，进而构建甲病毒表达载体系统。使用时，一般通过共转染甲病毒复制子载体和结构蛋白辅助载体，得到子代病毒。与常规DNA疫苗载体相比，甲病毒表达载体的基因组比较大，转染效率较低，操作较为复杂。此外，该系统的子代病毒产量不能自主复制，因此不能大量产生重组的甲病毒。由于甲病毒类的结构蛋白具有一定的毒性，会引起载体细胞自杀，含有现阶段没有合适的用来合成甲病毒类结构蛋白的稳定互补细胞系，以辅助完成病毒的包装，也就无法得到可以稳定生产甲病毒载体系统的细胞系。所以该病毒系统用做大规模疫苗生产、蛋白表达等工业化操作，存在较大的障碍。另外同时转染甲病毒载体和结构蛋白辅助载体容易产生重组的病毒克隆，产生回复突变，而形成感染性的病毒，因此存在一定的风险，一定程度上也限制了其应用。因此，现在使用的甲病毒表达载体系统中，使用的都是减弱突变型的甲病毒，并采用特殊的细胞系，以稳定生产甲病毒载体系统。此外，由于甲病毒复制子系统，是通过大量扩增亚基因组到达大量扩增目的基因的目的。而甲病毒复制子系统是一种正调控系统，往往会引起目的基因的过量表达，而过量表达目的基因会影响病毒结构基因的表达，从而影响重组的甲病毒的产生，导致包装出的甲病毒量较低。这在一定程度上影响了该系统的应用。因此，现阶段缺乏操作简便，安全可靠的甲病毒表达载体系统。同样也缺乏相应的疫苗制备方法。
本发明的目的在于提供一种操作简便，安全可靠的甲病毒表达载体系统。本发明所采取的技术方案是复制缺陷型甲病毒表达载体系统，包括甲病毒复制子系统和甲病毒辅助包装系统，甲病毒复制子系统的复制子含有至少一个启动子和去除了编码结构蛋白序列的甲病毒核酸序列，甲病毒辅助包装系统的结构蛋白辅助子含有编码甲病毒结构蛋白序列的反义核酸序列，反义核酸序列的5’端连接有基因复制调控开关核酸序列，基因复制调控开关核酸序列的5’端连接有基因复制启动子。结构蛋白复辅助子的甲病毒结构蛋白序列的反义核酸序列和基因复制调控开关核酸序列之间设有亚基因组增强子。甲病毒复制子系统的复制子和甲病毒辅助包装系统的结构蛋白复辅助子的核酸序列连接在不同的质粒中。基因复制调控开关为动物、植物、细菌、病毒的抑制子，优选为四环素抑制子。甲病毒优选为基孔肯雅病毒。一种疫苗制备方法，包括以下步骤1)将病菌的免疫原序列插入到权利要求1或3所述的甲病毒复制子系统的复制子，取代原甲病毒核酸序列的结构蛋白序列，得到免疫原复制子；2)将权利要求1或3所述的甲病毒辅助包装系统的结构蛋白辅助子转染表达基因复制调控开关核酸序列抑制蛋白的细胞，得到结构蛋白辅助细胞；3)在结构蛋白辅助细胞的培养基中加入与基因复制调控开关核酸序列抑制蛋白结合的底物，解除细胞对结构蛋白表达的抑制；4)使用免疫原复制子转染解除结构蛋白表达抑制的辅助细胞，包装得到大量具有感染力的重组甲病毒；
5)使用重组甲病毒感染正常细胞，得到大量免疫原，进而使用免疫原制备得到疫苗。免疫原序列为肠道病毒亚单位蛋白序列或整个肠道病毒结构基因，肠道病毒为 EV71、cosA16、cosB3、脊髓灰质炎病毒。本发明的复制缺陷甲病毒表达载体，共转染后可以产生具有感染力的甲病毒颗粒，保留了现有甲病毒表达载体高效表达的优点。同时，共转染后，甲病毒复制子系统的复制子中的正链核酸序列不能和甲病毒辅助包装系统的结构蛋白复辅助子中的结构蛋白负链核酸序列重组，避免了甲病毒表达载体重组成为具有感染力的病毒克隆，大大降低了复制缺陷甲病毒表达载体使用风险。由于甲病毒辅助包装系统中，结构蛋白的表达受基因复制调控开关调控，可以根据需要人为地调节其表达与否，表达量的多少。因此，可以构建得到可表达甲病毒结构蛋白的稳定细胞系，只要转染甲病毒复制子系统后，得到的子代病毒能够在该细胞系中持续地复制，有效避免了现有重组甲病毒不能够扩大培养、产量不足的缺点。在转染前，通过打开基因复制调控开关，直接提供适当水平的结构基因的负链。一旦复制子系统转染进入该细胞后，立即利用该相当水平的结构基因的负链转录出大量的正链RNA，从而快速的翻译出大量的结构蛋白，在少量表达外源基因的情况下，尽可能多的包装出子代病毒。该系统解决了该类疫苗载体产毒能力不足的问题，适合工业化制成各种类型的疫苗的形式。


图1是本发明复制缺陷甲病毒表达载体系统的核酸序列结构示意图。图2是基因复制调控开关调控的调控机制图。图3是本发明复制缺陷甲病毒表达载体的工作原理示意图。图4是本发明复制缺陷甲病毒表达载体大规模培养的工作原理示意图。

1)将病菌的免疫原序列插入到权利要求1或3所述的甲病毒复制子系统的复制子，取代原甲病毒核酸序列的结构蛋白序列，得到免疫原复制子；
2)将权利要求1或3所述的甲病毒辅助包装系统的结构蛋白辅助子转染表达基因复制调控开关核酸序列抑制蛋白的细胞，得到结构蛋白辅助细胞；
3)在结构蛋白辅助细胞的培养基中加入与基因复制调控开关核酸序列抑制蛋白结合的底物，解除细胞对结构蛋白表达的抑制；
4)使用免疫原复制子转染解除结构蛋白表达抑制的辅助细胞，包装得到大量具有感染力的重组甲病毒；
5)使用重组甲病毒感染正常细胞，得到大量免疫原，进而使用免疫原制备得到疫苗。
免疫原序列为肠道病毒亚单位蛋白序列或整个肠道病毒结构基因，肠道病毒为 EV71、cosA16、cosB3、脊髓灰质炎病毒。下面结合实施例，进一步说明本发明。复制缺陷基孔肯雅病毒表达载体系统
复制缺陷基孔肯雅病毒表达载体系统的基孔肯雅病毒复制子和结构蛋白辅助子的基本结构如图1所示。病毒复制子使用CMV启动子作为复制缺陷基孔肯雅病毒的启动子，启动子后依次连接有5’ UTR、基孔肯雅病毒的非结构蛋白核酸序列nsP1234、3’ UTR和复制终止序列SV40 ploy-Α尾，当然，为更为方便的插入外源核酸序列，在nsP1234与3’UTR之间还添加有克隆位点。结构蛋白辅助子使用CMV启动子，启动子后依次连接有Tet02、5’ UTR、基孔肯雅病毒结构蛋白的反链核酸序列sPs、3’ UTR和复制终止序列SV40 ploy-A尾。优选的，为取得更好的调控效果，TetO2可重复至少一次；为促进基孔肯雅病毒结构蛋白的表达，Sb之前设有亚基因组增强子。作为载体使用时，在nsP1234与3’UTR之间插入外源核酸序列，以取代基孔肯雅病毒结构蛋白核酸序列。为促进外源基因的表达，在nsP1234和外源核酸序列之间还可设有亚基因组增强子。复制缺陷基孔肯雅病毒复制子可转染至质粒中，然后使用转染质粒构建稳定细胞系，使复制缺陷基孔肯雅病毒复制子稳定传代。复制缺陷基孔肯雅病毒结构蛋白辅助子可转染至常量表达TetR的质粒，然后使用该质粒转染细胞，或将结构蛋白辅助子转染至常规质粒中，然后将该质粒转染至常量表达TetR的细胞中。这样在没有添加四环素的情况下，质粒或细胞表达的TetR结合在TetA 上，基孔肯雅病毒结构蛋白的表达受到抑制，无法正常表达，这样避免了传代培养时，基孔肯雅病毒结构蛋白对细胞的杀伤作用，使结构蛋白辅助子稳定传代。其调控机理如图2所
7J ο根据本领域技术人员的基本常识可知，CMV启动子可以使用其他的启动子替换，这些启动子可以是来自真核细胞、原核细胞、植物、病毒等的启动子序列。Tet-on (四环素基因调控开关)是最为常见的基因调控开关之一。在了解本发明的技术方案之后，本领域的技术人员可以轻易地想到使用其他类似的基因调控开关来实现基孔肯雅病毒结构蛋白的表达调控。类似的，可以使用其他甲病毒，如辛德比斯病毒(sindbis virus, SIN), Semliki Forest 病毒(semliki Forest virus, SFV).以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine enceplitis virus, VEEV)等，构建出相应复制缺陷甲病毒。下面以构建的复制缺陷基孔肯雅病毒表达载体系统为例，说明本发明的复制缺陷甲病毒表达载体系统是如何生产得到外源蛋白。1)将外源蛋白核酸序列插入基孔肯雅病毒复制子；
2)添加四环素，解除TetR对基孔肯雅病毒结构蛋白辅助子转录的抑制，结构蛋白辅助子的负链结构蛋白序列转录得到正链结构蛋白mRNA，表达出结构蛋白；
3)将基孔肯雅病毒复制子和结构蛋白辅助子共转染至表达TetR的细胞中，基孔肯雅病毒复制子转录得到mRNA，表达出复制酶和外源蛋白；
4)这时，在辅助细胞中同时存在基孔肯雅病毒复制子和结构蛋白，在复制酶的作用下， 包装成具有感染力的病毒颗粒，得到第一代重组基孔肯雅病毒；
5)使用第一代重组基孔肯雅病毒感染带有基孔肯雅病毒结构蛋白辅助子并表达TetR 的稳定细胞系(以下称为互补细胞)，添加四环素，实现重组基孔肯雅病毒的二次感染，实现大规模重组基孔肯雅热病毒的大量生产；
6)然后利用大量产生的重组基孔肯雅热病毒感染正常细胞，得到大量外源蛋白。其机理如图3和图4所示。当外源蛋白核酸序列为病菌的免疫原序列时，即可生产得到相应的免疫原，进而使用常规技术生产得到疫苗。当免疫原序列为肠道病毒亚单位蛋白序列或整个肠道病毒结构基因，如肠道病毒EV71、COSA16、COSB3、脊髓灰质炎病毒的病毒亚单位蛋白序列或整个肠道病毒结构基因，即可经济地得到大量免疫原，进而得到更为经济的疫苗。


本发明公开了复制缺陷甲病毒表达载体系统及疫苗制备方法。载体系统由缺失结构基因的复制缺陷型甲病毒载体和含有可调控的甲病毒结构基因的负链互补质粒或者细胞组成。通过构建缺失病毒结构蛋白的复制缺陷甲病毒载体，引入外源基因目标；结合可调控的甲病毒结构基因的负链互补质粒或者细胞，可连续的、大规模的产生复制重组甲病毒，解决现有甲病毒系统病毒产量较低的缺点，实现大规模的制备重组病毒的目标，能够规模化表达外源蛋白、病毒样颗粒，适合大规模进行DNA疫苗、载体病毒疫苗、外源蛋白表达的规模化生产。