促进剂-dna组合疫苗的制作方法[0001]序列表[0002]本申请含有已以ASCII格式提交且据此以引用的方式整体并入的序列表。于2011年9月22日创建的所述ASCII拷贝命名为VGXO127W.txt.。发明领域[0003]本发明涉及一种含有疫苗促进剂和编码抗原性肽的DNA的疫苗。所述疫苗可进一步含有抗原性肽。[0004]背景[0005]许多疫苗依赖‘预测和产生(predict and produce) ’方法。举例而言,流感疫苗是基于在流感季节期间最可能蔓延全球的病毒株的血凝素(hemagglutinin)和神经氨酸苷酶(neuraminidase)序列而产生。然而，循环病毒的变化或其糖蛋白具有重大变化的大流行性病毒株的出现将致使所述疫苗无效。此外，当前卵基流感疫苗(egg-based influenzavaccine)制造技术取决于流感病毒株在卵中复制的能力且会花费至少6个月来制造足以用于季节性疫苗接种活动的剂量。[0006]当前疫苗的生产能力据估计低于对目前全球人口接种疫苗所需的生产能力。此夕卜，疫苗(如DNA疫苗)已长久遭受通过基于注射器的递送对宿主细胞的转染低效的缺点。因此，与用于增加疫苗剂量产生的手段有限相关的缺点以及缺乏用于增加疫苗转染的新型技术已引起健康护理专业人员的关注。[0007]不知如何增加DNA疫苗转染。此外，不知如何设计用于抗原呈递以使对适当免疫反应的诱导最大化的抗原性表位或疫苗。更快且简化疫苗制造技术为流感和非流感相关疫苗策略所需以成为在未来大流行的情况下的可行解决方案。因此，对用于抗原基疫苗的更好抗原选择和设计方法存在需要，所述方法可高效转染宿主靶细胞且有效对抗各种疾病。
[0008]发明概述
[0009]本文提供一种包含疫苗促进剂和编码抗原性肽的DNA的疫苗。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5- (N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(amiloride) (EIPA)、苯扎明(benzamil)或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。疫苗也可含有抗原性肽。DNA可为环状质粒或载体，或它可为线性表达盒(LEC)。LEC可不具有磷酸骨架。疫苗可被电穿孔至有需要的受试者中。抗原可为例如M2、LACK、HBV、HIV、肿瘤相关抗原(TAA)、神经氨酸苷酶、血凝素或其变体或其共有序列。DNA可包含启动子，如CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子或多角体蛋白(polyhedrin)启动子。LEC可为pcrNP或pcrM2。
[0010]本文也提供一种包括所述疫苗的疫苗接种试剂盒。所述试剂盒可进一步包括电穿孔装置。所述电穿孔装置可为微创性电穿孔装置。
[0011]本文也提供一种疫苗接种方法。所述方法可包括向有需要的受试者施用所述提供的疫苗。疫苗可通过电穿孔施用。电穿孔途径可为皮内或肌肉内途径。微创性电穿孔装置可用于将疫苗电穿孔。
[0012]附图简述
[0013]图1.阿米洛利在体外加速质粒进入。在有或无ImM阿米洛利的情况下Cy5_pEGFP进入细胞系被监测为在第3天RAff264.7 (A, B、C)、JAffSII (D、E)和DC2.4(F、G)的2小时Cy5+%和EGFP+Cy5+%。添加 LipofactamineTM2000 (Lipo2000)作为阳性对照。显示的是具有类似结果的三次独立实验之一。
[0014]图2.阿米洛利在体内加速质粒进入。在有或无阿米洛利的情况下，用Cy5_pEGFP在后足垫中皮下免疫首次接受试验的C57小鼠。在4小时之后，收集淋巴结以测试Cy5+细胞的比例⑶和亚型(C)。η = 3。B中的*，在所有组之间具有统计显著性。
[0015]图3.阿米洛利加速脂筏和胞膜窖依赖性质粒进入。脂筏抑制剂M β CD或胞膜窖抑制剂菲律宾菌素(fillipin)与阿米洛利一起添加来阻断细胞系RAW264.7(A、B)、JAWSII (C、D)和DC2.4(E、F)的胞吞途径。接着添加Cy5-pEGFP以测定2小时内的进入和3天内的表达。显示的是具有类似结果的三次独立实验之一。
[0016]图4.阿米洛利增强APC成熟和先天性细胞因子分泌。在有或无ImM阿米洛利的情况下将?ο μ g/ml PCD-S2添加至细胞培养物中以进行刺激。在第3天测试RAW264.7 (A、B、C)、JAWSII (D、E)、DC2.4(F、G)、腹膜巨噬细胞(H、I)和脾DC(J、K)的表面成熟标记物CD40、⑶80、⑶83、⑶86、MHC 1、MHC II以及分泌至上清液中的先天性细胞因子IL_6、TNF-α、IL-Ιβ、IFN-y。显示的是具有类似结果的三次独立实验之一。对于腹膜巨噬细胞和脾DC，n = 3。*和**，在+/-阿米洛利之间具有统计显著性。
[0017]图5.阿米洛利增强针对HBV S2的适应性免疫。Α，免疫常规程序。B，抗S2IgG抗体滴度。C，在用Iyg sAg在后足垫中皮下再刺激24小时之后的延迟过敏(DTH)反应。添加PBS作为阴性对照。*，在所有组之间具有统计显著性。D和E，体外(D)和体内(E)HBVS208-215特异性溶解，*，在+/_阿米洛利之间具有统计显著性。F和G，体外(F)和体内(G)HBVAlbl转基因小鼠肝溶解。A-G, η = 3。
[0018]图6.阿米洛利增加IFN- Y +穿孔素+粒酶B+⑶8Τ细胞的比例。来自pcD_S2+/-阿米洛利免疫的小鼠的脾细胞用10 μ g/ml S208-215体外再刺激12小时(A-C)或用10 μ g/ml sAg体外再刺激24小时(D)，接着进行多色细胞内染色。添加PMA和离子霉素作为阳性对照。A，CD8T细胞中的IFN-Y、穿孔素或粒酶B阳性细胞被计算为反应性细胞。B，在+/-阿米洛利之间，反应性⑶8T细胞中的细胞因子表达样式。C，阿米洛利剂量对IFN- Y +穿孔素+粒酶B+细胞的比例的影响。D，响应于sAg再刺激的IFN- Y +穿孔素+粒酶B+细胞的比例。E和F，与腹膜巨噬细胞(E)或脾DC(F)共培养，接着用S208-215再刺激，且染色的⑶8T细胞中的IFN-Y +穿孔素+粒酶B+。n>3。
[0019]图7.尽管是IFN- Y -/-受损的CTL，但阿米洛利仍然增加双阳性细胞和CTL。特异性溶解被计算为体外(A)和体内(B)S208-215涂布的初始脾细胞(靶细胞)对初始脾细胞(对照细胞)、或体外(C)和体内(D)Albl肝细胞(靶细胞)对初始C57肝细胞(对照细胞)，其中WT或IFN- Y -/-小鼠用pcD-S2+/_阿米洛利免疫作为效应CTL。计算所有组之间或+/-阿米洛利之间的差异。η = 3。E，WT与IFN- Y -/-之间的反应性⑶8T细胞比例。F，在S208-215再刺激之后的IFN-Y-/-小鼠细胞因子样式。G，在HBsAg再刺激之后的穿孔素+粒酶B+双阳性细胞比例。η = 3。
[0020]图8.显示编码流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的质粒表达载体以及相应线性表达盒的图。线性表达盒pcrNP或pcrM2含有CMV启动子、用于拼接的内含子、具有终止密码子和聚腺苷酸化信号的NP或M2的全长基因。
[0021]详述
[0022]本

[0023]本文所述的疫苗可向受试者施用以提供由受试者群体良好耐受的较长久持续的抗原特异性免疫反应。本发明也涉及可自DNA表达的许多抗原。
[0024]1.定义
[0025]本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和随附权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a/an)”和“所述(the) ”包括复数个指示物。
[0026]a.共有或共有序列
[0027]如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于对特定抗原的多个亚型的比对的分析而构建的合成核酸序列或相应多肽序列。序列可用于诱导针对特定抗原的多个亚型或血清型的广泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可操作为共有序列(或共有抗原)。
[0028]b.变体
[0029]如本文所用的“变体”可指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括由特异性抗体结合的能力或促进免疫反应的能力。变体也可指氨基酸序列大致上与具有某一氨基酸序列的参照蛋白相同的保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守性取代，即，用具有类似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸置换某一氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑如本领域中所了解的氨基酸的亲疏水性指数来鉴定。Kyte等，J.Mol.B1l.157:105-132 (1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于对它的疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是具有类似亲疏水性指数的氨基酸可被取代且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲疏水性指数为土 2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已报道与抗原性和免疫原性良好关联的适用度量。美国专利号4，554，101以引用的方式完全并入本文。如本领域中所了解，取代具有类似亲水性值的氨基酸可产生保留生物活性，例如免疫原性的肽。可用亲水性值在彼此的土2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数与亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链影响。与那个观察一致的是，可与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于所述氨基酸的相对类似性，且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其它性质所揭示。
[0030]关于对本文数值范围的叙述，明确涵盖在其之间的具有相同精度的各插入数值。举例而言，对于范围6-9，除6和9之外也涵盖数值7和8，且对于范围6.0-7.0,明确涵盖数值 6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9 和 7.0。
[0031]2.疫苗
[0032]本文提供包含疫苗促进剂和编码抗原的DNA的疫苗。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5- (N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。靶细胞由DNA高效转导，借此疫苗诱导抗原特异性免疫反应。疫苗可进一步包含呈肽形式的抗原。
[0033]a.钠(Na) /钾(K)泵抑制剂_
[0034]本文提供一种在体外和在体内促进DNA进入细胞中的化合物。该化合物可为钠(Na)/钾⑷泵抑制剂。Na/K泵抑制剂化合物可为3，4 二氯苯扎明盐酸盐、3，4，5，6-四羟基氧杂蒽酮(3,4, 5，6-tetrahydroxxanthone)、巴伐洛霉素(bafilomycin)、布美他尼(bumetanide)、刀豆素 A(concanamycin A)、二氢乌本箭毒苷(dihydroouabain)、埃索美拉唑(esomeprazole)、呋塞米(furosemide)、兰素拉唑(lansoprazole)、奥美拉唑(omeprazole)、乌本箭毒苷八水合物(ouabain octahydrate)、泮托拉唑钠(pantoprazolesodium)、盐酸丙胺卡因(prilocaine hydrochloride)、氯化血根喊(sanguinarinechloride)、甜菊苷水合物(stev1side hydrate)、托塞米(torsemide)、5_ (N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利。优选地，疫苗促进剂是5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。化合物可为阿米洛利，其常用于管理高血压和充血性心脏衰竭。阿米洛利具有以下结构:
[0035]
【发明者】王宾, 耿爽 申请人:北京艾棣维欣生物技术有限公司