液滴中的碎片化的基因组dna的分析的制作方法[0001]优先权申请的交叉引用[0002]本申请要求享有下述在先申请的优先权:2010年11月I日提交的美国临时专利申请系列号61/409，106 ;和2010年12月22日提交的美国临时专利申请系列号12/976，827，在2011年9月8日以美国专利申请公布第2011/0217712A1号被公布。两项专利申请基于所有目的在此通过引用全文并入本文。[0003]额外资料的交叉引用[0004]本申请基于所有目的在此通过引用全文并入下述资料:2006年5月9日授权的美国专利第7，041，481号；2010年7月8日公布的美国专利申请公布号2010/0173394A1 ；2011年9月29日公开的PCT专利申请号TO2011/120024 ；以及Jos印hR.Lakowicz,PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (第二版，1999)。[0005][0006]许多生物医学应用依赖于核酸靶样品的高通量测定。例如，在研究和临床应用中，使用靶特异性试剂的高通量遗传测试可以为药物发现、生物标志物发现和临床诊断以及其他方面提供核酸靶的准确且精确的量化。[0007]乳液为革新靶的高通量测定带来了相当大的希望。乳化技术可以产生大量的用作生物化学反应的独立的反应室的含水液滴。例如，含水样品(如，20微升)可以被分配成液滴(如，20，000颗液滴，各一纳升)以允许对每一颗液滴进行靶的单独测试。[0008]含水液滴可以被悬浮在油中以产生油包水乳液(W/0)。可以用表面活性剂稳定乳液以减少加热、冷却和输送期 间液滴的聚结，由此使得能够进行热循环。因此，乳液已经被用于进行使用聚合酶链式反应(PCR)对液滴中的核酸靶分子的单拷贝扩增。由于检测到液滴中存在单个分子的祀的能力，因而使得能够进行数码测定(digital assay)。
[0009]在示例性的基于液滴的数码测定中，样品被分配成有限稀释的靶的一组液滴(即，一些液滴不包含靶分子)。如果靶分子被无规分布在液滴中，那么泊松分布描述了基于液滴中的给定平均靶浓度来准确发现液滴中的0、1、2、3或更多个靶分子的几率。相反，可以从在液滴中发现给定数目的分子的几率计算液滴中(且因而在样品中)的靶分子的浓度。
[0010]未发现靶分子的几率和发现一个或多个靶分子的几率的估计值可以在数码测定中进行测量。在二进制方法中，每一颗液滴可以被测试以确定液滴是否是阳性的并包含至少一个靶分子，或是阴性的且不包含靶分子。在液滴中未发现靶分子的几率可以通过所测试的液滴是阴性的比例(“阴性比例”)被近似得出，而发现至少一个靶分子的几率通过所测试的液滴是阳性的比例(“阳性比例”)被近似得出。然后可以在泊松算法中利用阳性比例或阴性比例的值来计算液滴中靶的浓度。在其他情形中，数码测定可以产生大于二进制的数据。例如，测定可以测量每一颗液滴中存在多少个靶分子，且分辨率大于阴性(O)或阳性(> O)(如，O、I或> I个分子；0、1、2或> 2个分子；或类似的)。
[0011]为了在不同样品的基于液滴的DNA测定中兼具高通量和准确性，液滴应该被快速产生且具有均匀的尺寸(即，单分散性的液滴)。然而，样品组分可能干扰液滴与主体的样品相分离的能力，尤其是当提高了液滴产生的频率时。因此，所形成的液滴的尺寸，或甚至完全形成液滴的能力可能从样品到样品是变化的，从而削弱了测定的可靠性。需要新的方法来提供以较高的产生频率可靠而一致地产生液滴。
[0012]
[0013]本公开内容提供了一种分析基因组DNA的方法。可以获得包含靶的基因组DNA。基因组DNA可以有意地(volitionally)被碎片化以产生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿过液滴产生器以产生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以对液滴进行数码测定以确定靶的水平。在一些实施方案中，液滴可以包含每微升至少约5纳克浓度的基因组DNA，液滴可以以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生，液滴可以具有每滴小于约10纳升的平均体积，液滴可以以每秒大于约50纳升的样品流速产生，或其任何组合。
[0014]附图简沭
[0015]图1是阐释了根据本公开内容的各方面的分析基因组DNA的示例性方法的流程图。
[0016]图2是由液滴产生器在四种不同驱动压力的每一种下处理三种不同样品的照片得到的图的矩阵。
[0017]图3是不包含基因组DNA或包含被消化(EcoRI)或未被消化的基因组DNA (Raji或Coriell)的样品的液滴体积作为液滴产生频率的函数而绘制的图。
[0018]图4是图3的样品的液滴体积作为样品流速的函数而绘制的图。
[0019]图5是图3的样品的最大延伸作为液滴产生频率的函数而绘制的图。
[0020]图6是图3的样品的最大延伸作为样品流速的函数而绘制的图。
[0021]迸述
[0022]本公开内容提供了一种分析基因组DNA的方法。可以获得包含靶的基因组DNA。基因组DNA可以有意地被碎片化以产生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿过液滴产生器以产生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以对液滴进行测定以确定靶的水平。在一些实施方案中，液滴可以包含每微升至少约5纳克浓度的基因组DNA，液滴可以以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生，液滴可以具有每滴小于约10纳升的平均体积，液滴可以以每秒大于约50纳升的流速产生，或其任何组合。
[0023]如本文公开的，分析液滴中的基因组DNA的方法具有比基于液滴的其他方法相当大的优势。优势可以包括以更高的频率产生液滴、具有更高的单分散性、具有更大的DNA负载量和/或具有来自基因组DNA的显著更弱的干扰。
[0024]在下面的部分中描述了本公开内容的这些和其他方面:(I)基因组DNA分析的示例性方法的概述，(II)液滴产生测试的示例性数据以及(III)优选的实施方案。
[0025]1.基因组DNA分析的示例性方法的概述
[0026]图1显示阐释了分析基因组DNA的示例性方法20的流程图。所呈现的步骤可以按照任何合适的顺序且按照任何合适的组合进行。
[0027]可以获得基因组DNA，以22标示。可以从任何合适的生物体获得DNA，生物体诸如哺乳动物(如人类、小鼠、大鼠、猴等)、非哺乳动物的脊椎动物、无脊椎动物、酵母或真菌、植物、原生动物、细菌或类似物。可以通过任何合适的方法获得DNA，方法诸如市购、以礼物接受、通过从细胞或流体提取获得、以临床样品接受或类似方法。DNA可以以相对高分子量的形式获得，诸如具有至少约IO4UO5或IO6千道尔顿以及其他(如，具有至少约25、50、100,200,500或1000千碱基的平均长度)的分子量。
[0028]在产生液滴之前，可以碎片化基因组DNA，以24标示。碎片化可以是意志行为，即有意地进行的。碎片化通常包括显著减小基因组DNA的分子量的任何程序，诸如通过切割或断裂DNA链。碎片化可以将平均分子量和/或长度减小任何合适的量，诸如至少约5、10、20,50或100倍以及其他的。碎片化基因组DNA的示例性方法包括用限制酶(如，具有4、
5、6或8个核苷酸识别位点的酶、以及其他)消化。靶可以不包含限制酶的识别位点以避免靶分子的任何裂解。限制酶消化可以被进行完全或可以是部分消化。可选择地或另外，基因组DNA的含水样品可以被加热以碎片化DNA。碎片化DNA的示例性加热可以在至少95°C的温度下进行至少约10、15、20或30分钟以及其他时间。在其他情形中，DNA可以通过剪切、超声处理、雾化、辐射或类似方法被碎片化。
[0029]基因组DNA可以包含靶，通常是待测试的所感兴趣的序列。可以进行基因组DNA的碎片化而基本上不会破坏靶，这意味着通过碎片化方法，基因组DNA中不到一半的靶序列被破坏(如断裂或切割)。
[0030]可以产生包含碎片化的DNA的液滴，以26标示。液滴可以由一个或多个液滴产生器中的每一个按顺序产生。碎片化的DNA可以穿过至少一个液滴产生器以产生液滴。通常，碎片化的DNA被布置在含水样品中，且含水样品与不混溶的连续相被穿过液滴产生器以形成包含碎片化的DNA且被布置在连续相中的含水液滴。液滴产生器和可能合适的乳液相的进一步的方面描述在交叉引用下所列出的文献中，这些文献通过引用在此并入，尤其是2010年7月8日公布的美国专利申请公布号2010/0173394A1 ;2011年9月29日公布的PCT 专利申请号 W02011/120024。
[0031]液滴可以具有任何合适的尺寸。例如，液滴可以具有小于约lyL、100nL、10nL、lnL、100pL、10pL或IpL以及其他的平均体积。可选择地或另外，液滴可以具有大于约10fL、100fL、lpL、IOpL或IOOp L以及其他的平均体积。在一些情形中，液滴可以具有约IpL到IOOnLUpL到10nL、或0.1到IOnL以及其他的平均体积。液滴可以是单分散性的。
[0032]液滴可以包含任何合适浓度的碎片化的DNA。例如，碎片化的DNA可以以至少约
0.1、0.2、0.5、l、2、5、10、20、50ng/yL以及其他的浓度被布置在液滴中。在一些情形中，浓度可以是约0.1-50或0.2-20ng/ μ L。碎片化DNA允许更高的DNA负载量被结合到液滴中。碎片化的DNA可以以平均每颗液滴小于约2个基因组等价物存在。靶可以以平均每颗液滴小于约2个分子存在。
[0033]液滴可以以任何合适的液滴产生频率形成，诸如至少约IO、20、50、100、200、500或1，OOOHz (液滴/秒)以及其他的。通常，液滴产生频率与被产生的液滴的尺寸负相关，且较小的液滴允许较高的液滴产生频率。
[0034]用于形成液滴(且包含碎片化的DNA)的含水样品可以以任何合适的流速穿过液滴产生器和/或被转化成液滴。可能合适的示例性流速包括至少约1、5、10、20、50、100、200,500,1, 000,5, 000或10，OOOnL/秒以及其他的。通常，样品流速与被产生的液滴的尺寸正相关，且较大的液滴允许较高的流速。
[0035]上面所列出的液滴体积、DNA浓度、液滴产生频率以及流速的示例性值(或范围)可以以任何合适的组合被组合。[0036]可以对液滴进行测定，以28标示。测定可以是检测液滴中的单独靶分子的数码测定。数码测定可以包括扩增靶分子，诸如通过PCR或连接酶链式反应以及其他的。数码测定还可以包括检测来自液滴的荧光。测定还可以包括用泊松算法确定液滴中靶的水平(如浓度)。
[0037]11.液滴产生测试的示例性数据
[0038]此部分呈现了由采用或未采用碎片化的基因组DNA的液滴产生测试的示例性数据；参见图2-6。
[0039]在微流体设备中的液滴产生可以取决于样品行进至液滴产生器的流速和产生液滴的频率。在高流速时，样品流可以喷射入不混溶的连续相中，不再产生液滴。在产生速率接近喷射限值时，在产生液滴之前，样品开始延伸得更深入出口通道中。此延伸长度可以用于了解一组产生条件与喷射限值的接近度。
[0040]图2显示了由在四种不同的驱动压力的每一种下且因而不同流速下处理三种不同的含水样品32-36的液滴产生器30的照片得到的图片的矩阵。三种样品是(a)不包含DNA的对照样品32 (无模板的PCR缓冲液)、(b)未被消化的且具有高分子量(MW)的人类基因组DNA的含水样品34(Raji，18.75ng/yL)以及(c)已经用限制酶消化且具有降低的分子量的人类基因组DNA的含水样品36 (Raji, 18.75ng/ μ L)。四种驱动压力(1、2、3和4)是施加在液滴产生器的下游的负(真空)压力且以每平方英寸磅(psi)表示，且Ipsi等于约6.9千帕。真空水平可以控制样品流速、总流速以及液滴产生频率。
[0041]液滴产生器30可以通过包括样品入口通道38、至少一个或至少一对油入口通道40、42以及出口通道44的通道网络形成。入口通道38将含水样品32、34或36的主体水相(bulk aqueous phase) 46输送至液滴产生器。入口通道40、42将连续相48 (如，带有表面活性剂的油)输送至液滴产生器。出口通道44将连续相48中的液滴50输送远离通道交汇点52。
[0042]上排显示了不包含 基因组DNA的对照样品32的液滴产生。液滴50是约InL且在不同真空水平下尺寸变化不大。
[0043]中排显示了包含未消化的基因组DNA的样品34的液滴产生。仅在所测试的最低的真空水平(Ipsi)下发生基因组DNA极大地损害液滴产生。即使在此最低水平，存在主体水相46大量延伸通过通道交汇点52,由箭头54标示,且液滴50较大。在较高的真空水平(如，Ipsi与2-4psi相比)和流速下，无液滴产生，原因是样品流喷射进入出口通道44中，由箭头56标示，不会破裂成液滴。因此，人类基因组DNA的存在可以强烈地干扰液滴产生，且可能要求使用较低的DNA浓度、流速和液滴产生频率。因此，样品处理可能相当缓慢。此夕卜，乳液中的靶阳性液滴的频率可能被显著减少(由于较低的DNA浓度)，这将需要分析更多的液滴以获得所确定的靶水平的同样的置信度。
[0044]下排显示了由含有与样品34相同浓度(每单位体积的质量)的基因组DNA的样品36的液滴产生，但在DNA已经用限制酶被消化成较短的碎片之后。在本文所显示的压力(和流速下)，呈碎片化形式的基因组DNA并未被检测到损害液滴产生。样品产生液滴50，这类似于缺乏DNA的对照样品32。
[0045]进行了另外的研究来定量测量产生真空、样品流速、液滴产生频率、出口通道中的速度、液滴尺寸以及液滴产生期间的最大样品延伸之间的关系。所使用的含水样品是Spectral Dye Buffer (与图2中相同的对照样品，但没有DNA聚合酶)、Raji人类基因组 DNA(Loftstrand Laboratories)( “Raji”)和 19205 人类 DNA(Coriell Institute)(“Corell”)。DNA样品是未消化的或用限制酶EcoRI消化过的。用在NEB#4缓冲液中的20U/ μ L浓度的EcoRI (New England biolabs)进行DNA消化，且基因组DNA的最终浓度是200ng/y L。将混合物在37°C下温育I小时，然后稀释到不同的最终浓度。
[0046]图 3-6 的图显示了由 Master Mix (无 DNA)、18.75ng/ μ L 的 EcoR1-消化的 RajiDNA、18.75ng/y L 的 EcoR1-消化的 Coriell 19205 DNA、18.75ng/μ L 的未消化的 Raji DNA以及18.75ng/ μ L的未消化的Coriell 19205DNA的样品进行的液滴产生试验的结果。图3显示了样品的液滴体积作为液滴产生频率的函数而绘制的图。图4显示了样品的液滴体积作为样品流速的函数而绘制的图。图5显示了样品的最大延伸作为液滴产生频率的函数而绘制的图。图6显示了图3的样品的最大延伸作为样品流速的函数而绘制的图。
[0047]对于未消化的人类基因组DNA，在发生喷射之前，仅非常低的液滴产生频率或样品流速是可能的。例如，对于Coriell 19205 DNA，最大值是60Hz和83nL/秒。对于RajiDNA，最大值是120Hz和162nL/秒。然而，即使低于这些限值，所产生的液滴具有比不存在DNA时高的体积，且产生伴有长得多的样品延伸进入输出通道中。
[0048]图还显示了对于相同浓度的消化过的DNA，DNA对液滴产生的影响是不可检测到的。在所测试的任何流速或产生频率下均未观察到喷射或长样品延伸，且液滴体积与不存在DNA的样品的体积相同。
[0049]这些结果显示了液滴产生在存在未消化的人类DNA时受到强烈损坏，但在用限制酶消化后没有受到损坏。
[0050]II1.优选的实施方案
[0051]此部分以一系列索引的段落描述了本公开内容的优选的实施方案。这些实施方案不应该限制本公开内 容的整个范围。
[0052]A.一种分析基因组DNA的方法，包括:(i)获得包含靶的基因组DNA ; (ii)有意地碎片化所述基因组DNA以产生碎片化的DNA ； (iii)使所述碎片化的DNA穿过至少一个液滴产生器以产生含有所述碎片化的DNA的含水液滴；以及(iv)对所述液滴进行数码测定以确定所述靶的水平。
[0053]B.段落A的方法，其中所述液滴具有小于约10纳升的平均体积。
[0054]C.段落A的方法，其中所述液滴包含每微升至少约5纳克浓度的所述基因组DNA。
[0055]D.段落A的方法，其中所述基因组DNA被布置在含水样品中，且其中所述液滴通过所述液滴产生器以每秒大于约50纳升的所述含水样品的流速被产生。
[0056]E.段落A至D中任一段的方法，其中所述液滴以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生。
[0057]F.段落A的方法，其中所述液滴具有小于约10纳升的平均体积且包含每微升至少约5纳克浓度的所述基因组DNA。
[0058]G.段落A的方法，其中所述液滴具有小于约10纳升的平均体积，且其中所述基因组DNA被布置在含水样品中，且其中所述液滴通过所述液滴产生器以每秒大于约50纳升的所述含水样品的流速被产生。
[0059]H.段落A的方法，其中所述液滴包含每微升至少约5纳克浓度的所述基因组DNA，且其中所述基因组DNA被布置在含水样品中，且其中所述液滴通过所述液滴产生器以每秒大于约50纳升的所述含水样品的流速被产生。
[0060]1.段落F的方法，其中所述基因组DNA被布置在含水样品中，且其中所述液滴通过所述液滴产生器以每秒大于约50纳升的所述含水样品的流速被产生。
[0061]J.段落F的方法，其中所述液滴以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生。
[0062]K.段落G的方法，其中所述液滴以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生。
[0063]L.段落H的方法，其中所述液滴以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生。
[0064]M.段落L的方法，其中所述液滴具有小于约10纳升的平均体积。
[0065]N.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步骤包括用限制酶消化所述基因组DNA的步骤。
[0066]0.段落N的方法，其中所述限制酶以平均每千碱基小于约一次地切割所述基因组DNA。
[0067]P.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步骤包括剪切所述基因组DNA的步骤。
[0068]Q.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步骤包括超声处理所述基因组DNA的步骤。
[0069]R.段落A至Q中任一段的方法，其中所述液滴包含平均每颗液滴小于约2个拷贝的所述靶。
[0070]S.段落A至R中任一段的方法，其中所述液滴包含平均每颗液滴小于约2个所述基因组DNA的基因组等价物。
[0071]T.段落A至S中任一段的方法，其中所述碎片化的步骤基本上不破坏所述靶。
[0072]U.段落A至T中任一段的方法，其中所述进行数码测定的步骤包括扩增所述液滴中的所述靶的步骤。
[0073]V.段落U的方法，其中所述靶通过PCR被扩增。
[0074]W.段落A至V中任一段的方法，其中所述进行数码测定的步骤包括检测来自所述液滴的荧光的步骤。
[0075]X.段落A至W中任一段的方法，其中所述进行数码测定的步骤包括用泊松算法确定所述靶的水平的步骤。
[0076]Y.段落A至X中任一段的方法，其中所述液滴具有约0.1到10纳升的平均体积。
[0077]Z.一种将包含DNA的含水样品分配成液滴的方法，所述方法包括:(i)获得包含每微升至少约5ng浓度的DNA的样品；(ii)有意地碎片化所述DNA以产生碎片化的DNA ；以及(iii)使所述样品穿过液滴产生器以产生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生且具有小于约10纳升的平均体积。
[0078]Al.一种将包含DNA的含水样品分配成液滴的方法，所述方法包括:(i)获得包含基因组DNA的样品；(ii)有意地碎片化所述DNA`以产生碎片化的DNA;以及(iii)使所述样品穿过液滴产生器以产生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少约50颗液滴的液滴产生频率被产生且具有小于约10纳升的平均体积，其中所述基因组DNA的浓度为，如果所述穿过的步骤在不碎片化所述DNA的相同条件下采用所述基因组DNA进行则干扰液滴产生。[0079]上面提出的公开内容可以包括多项具有独立功用的不同的发明。虽然本发明中的每一项已经以其优选的形式被公开，但是本文中所公开的且阐释的其具体的实施方案并不被认为是限制性的意义，原因是许多变化形式是可能的。本发明的主题包括本文公开的不同的要素、特征、功能和/或特性的所有新颖的且非显而易见的组合和子组合。下面的权利要求特别指出被认为是新颖的且非显而易见的某些组合和子组合。在特征、功能、要素和/或特性的其他组合和子组合中体现的发明可以在要求此申请或相关申请的优先权的申请中得到保护。这样的权利要求，无论涉及不同的发明还是相同的发明，且无论比初始权利要求的范围宽、窄、相等还是不同，也都被认为包括在本公开内容的发明主题内。此外，用于所确认的要素的序数标志，诸如第一、第二或第三用于区分要素，且不表明这样的要素的特定位置或顺序，除非另 外具 体陈述。