一种dna特异位点甲基化的检测方法及试纸条生物传感器的制造方法 [0002]表观遗传学是指基因组DNA序列不改变的情况下发生的可遗传的基因表达或细胞表现型的变化。这种变化通常是由于DNA和组蛋白修饰、RNA干扰等对基因的表达进行调控引起的。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。它与多种疾病有着特别密切关系。基因启动子区域的CpG岛产生甲基化是导致基因沉默的重要原因，癌症发生的重要原因之一是抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化引起抑癌基因失活。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，所以甲基化的诊断可以对肿瘤发生进行早期诊断，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测还可用于肿瘤的分级。 [0003]DNA的甲基化检测可分为基因组整体水平的检测、特异位点的检测以及寻找新的甲基化位点。检测方法主要根据重亚硫酸盐处理和甲基化敏感限制性酶。重亚硫酸盐处理能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，在PCR过程中尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。通过PCR测序即重亚硫酸盐测序PCR法，可以确定目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。也可以设计特异性引物检测单个位点的甲基化，这些方法包括甲基化特异性PCR、甲基化特异性荧光定量PCR、甲基化敏感的单核苷酸引物扩增和甲基化特异性微阵列技术。甲基化敏感限制性内切酶法使用的是甲基化敏感的限制性内切酶Hpa II和不敏感的同裂酶Msp I分别消化待测DNA，然后进行Southern杂交或PCR扩增检测特异位点的甲基化状态。此外还有5’甲基化胞嘧啶单克隆抗体和MBD柱层析法。 [0004]重亚硫酸盐处理方法存在DNA易被降解、灵敏度低的缺点，而甲基化敏感限制性内切酶存在处理不完全的缺点。且上述检测方法均操作时间长、步骤繁琐，需要多种昂贵的仪器设备和熟练的操作人员。因此研发一种快速简便的检测DNA甲基化的检测方法及相关装置是十分必要的。
[0005]本发明的目的之一在于提供一种DNA特异位点甲基化的检测方法，具有简便、快速的特点。
[0006]本发明的另一目的在于提出了一种基于该方法的检测DNA特异位点甲基化的试纸条生物传感器，结构简单，使用方便，能够实现快速操作检测。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种DNA特异位点甲基化的检测方法，采用试纸条生物传感器进行检测。
[0008]优选的，所述生物传感器上含有检测线和质控线，所述检测线由能与检测探针互补杂交的捕获探针形成，所述质控线由抗His-tag抗体形成。
[0009]优选的，所述检测方法中还设有用于增强检测信号的增强探针。
[0010]优选的，所述增强探针由His-tag抗体与胶体金颗粒偶联形成。
[0011]一种检测DNA特异位点甲基化的试纸条生物传感器，包括:
具有粘性的底板；
硝酸纤维素膜，粘贴在所述底板的中部；
吸水纸，粘贴在所述硝酸纤维素膜的一侧的底板上，所述吸水纸与所述硝酸纤维素膜之间有2-3mm的重叠；
样品垫，粘贴在所述硝酸纤维素膜的另一侧的底板上，所述样品垫与所述硝酸纤维素膜之间有2-3mm的重叠；
检测试剂:检测探针、MBD蛋白及孵化反应溶液、增强探针。
[0012]进一步，所述硝酸纤维素膜上喷有能与检测探针互补杂交的捕获探针形成检测线以及喷有抗His-tag抗体形成质控线。
[0013]进一步，所述样品垫根据以下方法制备:将玻璃纤维浸泡在含有1% BSA,2%Triton,2% PEG4000、20 mM Tris-Ac和50 mM NaAc的溶液中，晾干后形成所述的样品垫。
[0014]进一步,所述增强探针由His-tag抗体与胶体金颗粒偶联形成。
[0015]进一步，所述检测探针是指以待测目的基因序列为模板，在与待测位点对称的位点，以5’甲基化胞嘧啶代替胞嘧啶，化学合成的30~70mer的核酸探针。
[0016]进一步,所述MBD蛋白带有His-tag,且所述MBD蛋白与胶体金颗粒偶联。
[0017]进一步,所述孵化反应溶液是PBS缓冲液。
[0018]进一步，所述检测DNA特异位点甲基化的试纸条生物传感器用于检测APC基因启动子区CpG岛甲基化状态。
[0019]检测时，所述样品垫上先滴加检测探针、待测目的基因片段、MBD蛋白共同孵化后的反应溶液，然后滴加由His-tag抗体与胶体金颗粒偶联形成的增强探针
本发明的有益效果是:
I)本发明中使用试纸条法检测特异位点的DNA甲基化位，简便快速，在30分钟内能用肉眼观察到检测结果，从而避免了重亚硫酸盐、PCR等繁琐的操作。
[0020]2)本发明中使用了一个His-tag抗体与胶体金颗粒偶联形成的增强探针，可以增强检测线显色，使检测信号进一步放大。
[0021]3)本发明所使用的的试纸条具有很高的特异性，非目的基因的甲基化对检测信号不产生干扰。




[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为本发明一种检测DNA特异位点甲基化的试纸条生物传感器的结构以及反应原理示意图。


[0024]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]如图1所示，本发明将以检测抑癌基因APC启动子甲基化为例，来说明采用本发明公开的检测方法以及基于该检测方法的试纸条生物传感器，过程如下:
其中，所述待测DNA样本的序列为(SEQ NO:1):
5’ -GATTACACAGCTGCTTCTCTCTCmCGCTTCCCGACC-3’，其中 mC 为待测的甲基化修饰胞嘧啶。
[0026]1、设计与待测目的基因序列部分互补的检测探针(SEQ N0:2),
其序列为:5’
-GGTCGGGAAGmCGGAGAGAGAAGCAGCTGTGTAATCATACTCCCCCAGGTGCCG-3， (SEQ NO:2)。其中mC为甲基化修饰的胞嘧啶。
[0027]2、设计与检测探针序列部分互补的捕获探针(SEQ NO:3)，
其序列为:5’ -CGGCACCTGGGGGAGTAT-3’ (SEQ NO:3)。
[0028]3、MBD蛋白与胶体金颗粒(AuNPs)偶联，形成AuNP-MBD偶联物。
[0029]4、抗His-tag抗体与AuNPs偶联，形成用于增强试纸条检测信号的增强探针。
[0030]5、将玻璃纤维浸泡在含有 1% BSA,2% Triton,2% PEG4000.20 mM Tris-Ac 和 50mM NaAc的溶液中，晾干后形成样品垫。
[0031]6、将捕获探针和抗His-tag抗体同时喷在硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线。
[0032]7、提取样品基因组DNA，经超声破碎处理得到100~200mer的片段。95°C加热5min后立即置于冰上，形成单链DNA片段。
[0033]8、将基因组DNA片段、AuNPs偶联的MBD蛋白、检测探针在37°C的PBS缓冲液中共同孵化15min。
[0034]9、将孵化后的溶液滴加到样品垫上，1min后，再滴加抗His-tag抗体与AuNPs偶联形成的增强探针，5分钟后观察实验结果。
[0035]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。