专利名称：一种两核苷酸实时合成dna解码测序方法随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差 异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及Applied Biosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基，这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数，或者通过可逆封闭核苷酸单体3端羟基的特殊单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间，而后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。以前，我们提出过基于标记核苷酸单体的“两核苷酸同时合成DNA测序方法及其应用”(中国发明专利申请号201110321795. 2)实施高通量DNA测序的方法来提高测序长度。然而，一方面，标记核苷酸单体、尤其是具有特定被切割性能的标记核苷酸单体其价格是商品化非标记天然核苷酸单体的数百倍以上，且引入切割反应、改变天然核苷酸结构均会对测序长度造成影响。另一方面，荧光强度不仅依赖于核苷酸合成的数目，而且也与具体的序列密切相关。例如，在最简单的两核苷酸合成片段AC与CA中，原理上它们应该给出相同的荧光比值，然而，在具体的测序操作中，当荧光标记单体以一定比例掺入后(如1/5)，在合成标记物核苷酸后面紧接着合成标记物的可能性非常少，所以第二个标记核苷酸掺入的数值则为4/5X1/5 = 4/25。因此，在合成片段AC中，荧光强度(A/C) = 1/5/4/25 = I. 25 ;而在合成片段CA中，荧光强度(A/C) = 4/25/1/5 =0. 8 ;两者相差I. 56倍。因此定量关系实际上是相当复杂的，需要对大量的不同序列进行预先的统计分析以给每种特定的序列确定一个相关系数，而这些在序列测定前又往往事先不知道。利用检测天然核苷酸单体合成反应实时产生的焦磷酸盐、氢离子而发展的454高通量测序技术(Margulies, et al. Nature, 2005. 437 (7057) :376-380)、Ion Torrent 测序技术(Rothberg，et al. Nature，475348-352)允许原始DNA的合成，核苷酸被合成后无需进行任何处理步骤。因此，测序过程相当快、准确率高，且序列阅读长度要比标记核苷酸单体的合成测序方法高数倍，目前的水平接近传统的Sanger技术。
解决的技术问题本发明的目的就是利用价格便宜的天然核苷酸单体为测序原料,通过一种两核苷酸实时合成DNA测序方法，实现待测核酸序列的高通量检测。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYn信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二组测序反应排列的若干XYn信息，最后通过解码二组排列的若干XYn信息组装出待测核酸 序列的具体碱基信息。该方法采用价格便宜的天然核苷酸单体为测序原料，只涉及简单的合成反应、无需要对合成的核苷酸进行后续处理，且为天然核苷酸结构对后续的测序反应无任何副作用，因此测序阅读长度比荧光修饰单体的将会有明显的增加。另一方面，由于所有核苷酸合成产生的检测分子均相同，合成核苷酸的数目与产生的检测分子数量间存在简单严格的定量关系，与具体序列无关。技术方案一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XYn。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYn信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XYn信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XYn信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸是指由(dATP+dCTP)、(dATP+dGTP)、(dATP+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应是指(dATP+dCTP)/(dGTP+dTTP)，(dATP+dGTP) / (dCTP+dTTP)，(dATP+dTTP) / (dCTP+dGTP)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。单个两核苷酸测序反应得到一个碱基序列片段编码XYn信息包括该测序反应参与的核苷酸种类X、Y，以及碱基序列片段包括的碱基数目n 个编码XYn对应包括唯一的正确序列片段在内的2n个碱基序列片段。核苷酸是未加任何修饰的dNTPs，或者三磷酸上标记可供检测的分子(如荧光基团，化学发光底物或者量子点等)的dNTPs。dNTPs合成实时产生的检测分子相同的，其检测分子可以是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子等。高通量DNA测序中，待测核酸序列是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。不同待测核酸序列的并行(高通量)测序中，每个模板需要独立的微反应池,避免不同模板间因合成反应产生相同检测分子的污染。解码是指从XYn对应的2n个碱基序列片段中找出唯一的正确序列片段的过程。待测核酸序列的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的。对于有参考序列的基因组测序的再测序，两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码即可以直接用于基因组参考序列的比对，而不需要对编码进行解码，而实现对基因组序列的再测序。一个已知可能的多模板序列的准确测定可 以通过选定的一组核苷酸实时合成DNA测序得到的特定编码排列来确定具体序列。一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，步骤为a:全基因组模板制备将目标基因组用超声破碎成大小为IOO-IOOObp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子(如连接子I的序列为CTGCTGTAC CGTACAGCC TTGGCC G ;连接子2的序列为CGC TTT CCTCTC TAT GGG CAG TCG GTGA T)进行连接，并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段，并纯化。将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段，并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板，最后，将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上，每个反应池最多容纳一个微珠；b.测序引物杂交将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物(为了保证每个模板每次均能发生合成反应，我们将测定连接子上的一个已知碱基序列，并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基，如在该实例中连接子中已知碱基为T，每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包标记的dATP)；c.测序第一组测序反应将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物(为了保证每个模板每次均能发生合成反应，我们将测定连接子上的一个已知碱基序列，并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基，如在该实例中连接子中已知碱基为T，每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包标记的dATP)；按照循环加入(dATP/dGTP)、(dCTP/dTTP)的方法进行循环测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；第二组测序反应用SM尿素在65°C下处理5分钟(2次)，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板，然后与测序引物进行杂交；按照循环加入(dATP/dCTP)、(dTTP/dGTP)的方法进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；d.解码利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息，解码组装出相应的碱基序列信息；e.序列组装利用所有模板的碱基序列信息，组装成大肠杆菌基因组序列；表I一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XYn。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYn信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XYn信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XYn信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。