专利名称：利用核苷酸化学分子式鉴定植物品种的方法植物品种是指经过人工选育而形成种性基本一致、遗传性比较稳定、具有人类需要的某些经济性状如观赏性状、药用性状或其它经济性状，作为特殊生产资料用的栽培植物群体。如牡丹品种、核桃品种、苹果品种等。植物品种一般利用表型性状进行鉴定和识别。但是，植物品种在特征表现上存在季节差异，在有的季节可能表现不出品种间有差异的性状。例如，牡丹品种通常按照花型和花色分类，然而，每年只有一个月左右的开花期，花期以外的时间存在品种鉴定难的问题， 牡丹品种通过嫁接无性繁殖；有些西瓜品种只有到瓜熟期根据瓜外皮表面的斑纹和色泽才能鉴定，其它时期难以区分。品种的准确度和纯度的分析一直是经济植物和资源植物(如花卉)产业发展上的重要课题。在规模化生产领域，以某种具体植物品种为生产资料和产品进行大规模生产，通过市场销售获取利润的企业，鉴定品种名称、分析批量产出的植物品种纯度及解决相关技术问题，需要借助灵敏度高的DNA分子分形检测技术进行精确鉴定和分析。目前的DNA检测技术，如DNA随机扩增多态性标记[random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD)]、重复序列间隔区多态性标记[inters impIe sequencerepeat (ISSR)]、扩增片段长度多态性标记[amplified fragment lengthpolymorphism(AFLP)]、序列相关扩增多态性标记[sequence-related amplifiedpolymorphism(SRAP)]以及微卫星或简单重复序列多态性标记[microsatellites orpolymorphic simple sequence repeats (SSRs)],在应用方面都可以解决一些问题,如品种间遗传关系的推测等，但都存在不同程度的局限和不足。
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测牡丹品种的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)用引物对对待测牡丹品种进行PCR扩增，获得目的区域的PCR产物；所述引物对由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子组成；2)将所述PCR产物测序，得到待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列；3)将所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列与核苷酸序列组群进行比对，找出单核苷酸多态性位点，列出待测牡丹品种核苷酸分子式；所述待测牡丹品种的核苷酸分子式的通式为=BxlBx2By Bxn，其中，B为单核苷酸多态性位点上的碱基种类，为A、T、C和G四种碱基中的任意一种；xl为第I个单核苷酸多态性位点在所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序编号，x2为第2个单核苷酸多态性位点在所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序编号，类推，xn为第n个单核苷酸多态性位点在所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序编号；所述BxlBx2Bx3…Bxn为所有单核苷酸多态性位点按照其在所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列中从5’末端起依次列出；所述核苷酸序列组群由序列表中序列3、序列4、序列5和序列6组成；4)将所述待测牡丹品种核苷酸分子式与核苷酸分子式组群比对，确定待测牡丹品种；所述核苷酸分子式组群由如下四种核苷酸分子式组成T3C3(I1A348G416C571G712、G3C301G348G416A571G712、TsA301G348G416A571T712 和 T3A301G348A416A571T712 ；每一种所述核苷酸分子式对应一个牡丹品种组群。 上述方法中，步骤I)中，所述PCR扩增的模板为所述待测牡丹品种的基因组DNA ；步骤3)中，所述列出待测牡丹品种的核苷酸分子式的方法包括如下步骤将所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列中从5’末端起第3、301、348、416、571和712位的单核苷酸多态性位点的核苷酸字母按顺序依次列出，并将每个单核苷酸多态性位点在所述待测牡丹品种目的区域的核苷酸序列中自5’末端起的位置顺序号作为下标，标在所述单核苷酸多态性位点的核苷酸字母的右下角，得到待测牡丹品种的核苷酸分子式；所述待测牡丹品种的核苷酸分子式的通式为B3B3tllB348B416B571B712 ；步骤4)中，所述T3C3tllA348G416C571G712对应的牡丹品种组群至少由如下品种组成‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’；所述T3C3tllA348G416C571G712对应的牡丹品种组群具体由如下品种组成‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’；待测试的品种数量增多时，隶属于该谱系的品种数目有可能增多；以下类推。所述G3C3tllG348G416A571G712对应的牡丹品种组群至少由如下品种组成‘红斑白’和‘凤丹所述G3C3tllG348G416A571G712对应的牡丹品种组群具体由如下品种组成‘红斑白’和‘凤丹，;所述T3A3tllG348G416A571T712对应的牡丹品种组群至少由如下品种组成‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’和‘首案红’；所述T3A3tllG348G416A571T712对应的牡丹品种组群具体由如下品种组成‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’和‘首案红’；所述T3A3tllG348A416A571T712对应的牡丹品种组群至少由如下品种组成‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’；所述T3A3tllG348A416A571T712对应的牡丹品种组群具体由如下品种组成‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’。上述方法中，步骤4)中，所述确定待测牡丹品种的方法包括如下步骤若所述待测牡丹品种的核苷酸分子式为T3C3tllA348G416C571G712,则待测牡丹品种为或候选为‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’组成的品种组群中的任意一种；若所述待测牡丹品种的核昔酸分子式为G3C3tllG348G416A571G712,则待测牡丹品种为或候选为‘红斑白’和‘凤丹’组成的品种组群中的任意一种；若所述待测核苷酸分子式为T3A3tllG348G416A571T712,则待测牡丹品种的名称为或候选为‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’和‘首案红’组成的品种组群中的任意一种；若所述待测品种的核苷酸分子式为T3A3tllG348A416A571T712,则待测牡丹品种的名称为或候选为‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’组成的品种组群中的任意一种。上述方法中，在步骤4)后还包括如下步骤比较所述待测牡丹品种与其所属的品种组群中的每一种品种的表型特征，若待测牡丹品种与其所属的品种组群中的一种品种表型特征(花色或花型)相同，则所述待测牡丹品种为或候选为对应的品种。本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测牡丹品种的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括引物对、记载有核苷酸序列组和核苷酸分子式组的比对卡；所述引物对为由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子组成的引物对；所述核苷酸序列组由序列表中序列3、序列4、序列5和序列6组成； 所述核苷酸分子式组由如下四种核苷酸分子式组成T3C3(I1A348G416C571G712、G3C301G348G416A571G712、TsA301G348G416A571T712 和 T3A301G348A416A571T712 ；所述待测牡丹品种具体为‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘红斑白’、‘凤丹’、‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’、‘肉芙蓉’或‘凤丹粉’。上述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测牡丹品种中的应用也是本发明保护的范围；所述待测牡丹品种具体为‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘红斑白’、‘凤丹’、‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’、‘肉芙蓉’或‘凤丹粉’。本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定植物品种的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)通过比对植物多个品种的叶绿体基因组序列，选取所述多个品种的叶绿体基因组序列中存在单核苷酸多态性位点差异的区域作为目的DNA区域；2)利用所述目的DNA区域两侧保守区域的序列，设计能够扩增所述目的DNA区域的引物；3)分别用所述引物对每一个品种分别进行PCR扩增，得到每个所述植物品种的目的DNA区域；4)测序每个所述植物品种的目的DNA区域，得到每个品种的目的DNA区域的核苷酸序列；5)比较所有品种的目的DNA区域的核苷酸序列，检测单核苷酸多态性位点，列出每个品种的核苷酸分子式；所述每个品种的核苷酸分子式由每个品种的目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端到3’末端或从3’末端到5’末端依次列出的所有单核苷酸多态性位点及其位置顺序编号组成；所述每个品种的核苷酸分子式通式为BxlBx2Bx3…Bxn，其中，B为单核苷酸多态性位点上的碱基种类，为A、T、C和G四种碱基中的任意一种；xl为第I个单核苷酸多态性位点在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或从3’末端起的位置顺序编号，x2为第2个单核苷酸多态性位点在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或从3’末端起的位置顺序编号，类推，xn为第n个单核苷酸多态性位点在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或从3’末端起的位置顺序编号；
所述BxlBx2Bx3…Bxn为将所有单核苷酸多态性位点按照其在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列从5’末端或3’末端起依次列出；6)将具有相同所述核苷酸分子式的品种组成同一个谱系，具有不同核苷酸分子式的品种组成不同的谱系；将所有谱系组成核苷酸分子式谱系表；所述核苷酸分子式谱系表中，每一种核苷酸分子式对应来自一个谱系的品种组群;7)将待测植物按照步骤3) -5)重复操作，将步骤3) _5)中的品种替换为待测植物，得到所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式；将所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中所有核苷酸分子式比较，确定所述待测植物的品种名称及其隶属的谱系。
上述核苷酸分子式的下标也可以为从任意可比起点开始算起的位数。上述方法中，步骤I)中，所述目的DNA区域为部分psbf-petL基因间隔区；步骤3)中，所述PCR扩增的模板为每个所述植物品种的基因组DNA ；步骤5)中，所述每个品种的核苷酸分子式由每个品种的目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端到3’末端依次列出的所有单核苷酸多态性位点的核苷酸字母及其位置顺序编号组成；所述每个品种的核苷酸分子式通式为BxlBx2By Bxn，其中，B为单核苷酸多态性位点上的碱基种类，为A、T、C和G四个碱基中的任意一种；xl为第I个单核苷酸多态性位点在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序编号，x2为第2个单核苷酸多态性位点在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序编号，类推，xn为第n个单核苷酸多态性位点在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序编号；所述BxlBx2Bx3…Bxn为将所有单核苷酸多态性位点按照其在所检测的目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端起依次列出；步骤7)中，所述确定所述待测植物的品种名称及其隶属的谱系的方法包括如下步骤若所述待测植物的目的DNA区域的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的一个核苷酸分子式相同，则所述待测植物品种为或候选为所述一个核苷酸分子式对应的所述谱系中的任意一种品种。上述方法中，步骤5)中，所述列出每个品种的核苷酸分子式的方法包括如下步骤将每一个品种的目的DNA区域的核苷酸序列中的所有单核苷酸多态性位点按照其在所述目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端起的顺序依次列出，且将所述每个单核苷酸多态性位点在所述目的DNA区域的核苷酸序列中从5’末端起的位置顺序号作为所述单核苷酸多态性位点的核苷酸字母的下标；得到每个品种的核苷酸分子式。上述方法中，步骤I)中，所述植物为牡丹，所述植物多个品种及其对应的所述部分psbE-petL基因间隔区的核苷酸序列如下所述植物品种为‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘红斑白’、‘凤丹’、‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’、‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’;所述‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪
浪’、‘花斑白’、‘景玉’的部分psbE-petL基因间隔区的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；
所述‘红斑白’、‘凤丹’的部分psbE-petL基因间隔区的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’的部分psbE-petL基因间隔区的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述‘肉芙蓉’、‘凤丹粉’的部分psbE-petL基因间隔区的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；步骤2)中，所述引物为由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子组成；步骤4)中，所述‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列3 ；、所述‘红斑白’、‘凤丹’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列4 ；所述‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列5 ；所述‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列6 ;步骤2)中，所述引物为由序列表中序列I和序列表中序列2所示的DNA分子组成；步骤4)中，所述‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列3 ；所述‘红斑白’、‘凤丹’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列4 ；所述‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列5 ；所述‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’的目的DNA区域的核苷酸序列均为序列表中的序列6 ;步骤5)中，所述‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’和‘景玉’的核苷酸分子式均为T3C3tllA348G416C571G712 ；所述‘红斑白’和‘凤丹’的核苷酸分子式均为G3C3tllG348G416A571G712 ；所述‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’和‘首案红’的核苷酸分子式均为
^3-^301^348^416-^571^712 ;所述‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’的核苷酸分子式均为T3A3tllG348A416A571T71215本专利中描述的方法构建核苷酸分子式适用于植物品种分类、鉴定、调查和管理等企业式赢利活动，社会公益性科学研究不包括在内，本文使用的核苷酸分子式是指利用植物叶绿体基因组DNA的可变区序列中的多态单核苷酸字母与其所处的位置顺序数构建的、用于区分品种的基因型类型的简单表达式。本发明的实验证明，本发明提供的方法为利用植物叶绿体基因组DNA序列，以核苷酸分子式的形式对植物品种进行鉴定和谱系分析，是一种较为精确、简捷的方法，可以提高相关产业的生产效率和质量监控水平，弥补了以往方法的不足，可以使分析精度达到一个核苷酸分子的水平。具体是通过18个观赏性牡丹叶绿体psbE-petL基因间隔区进行扩增、测序，建立核苷酸分子式，根据不同的核苷酸分子式建立不同的谱系；该由不同核苷酸分子式建立的谱系群表可以用来检测待测植物是否为18个观赏性牡丹，方法简便且易操作；与形态特征结合，进一步准确鉴定待测植物的品种。

‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’、‘肉芙蓉’和‘凤丹粉’。牡丹品种通过嫁接无性繁殖。用于分析的新鲜叶片于春季采集，利用变色硅胶(干燥剂)立即快速干燥保存。实施例I、鉴定牡丹品种
本方法的原理植物体内含有3个基因组，分别为叶绿体基因组、线粒体基因组和细胞核基因组。本方法是利用常规的分子生物学技术从植物叶绿体基因组中采集生物信息的创新方法之一。植物的DNA (脱氧核糖核酸)序列由A、G、C、T四种碱基(核苷酸)构成。根据它们英文名称的首字母，分别称之为A (Adenine腺嘌呤)、T (Thymine胸腺嘧啶)、G (Guanine 鸟嘌呤)、C (Cytosine 胞卩密唳)。本方法先利用常规方法(如CTAB法或市售的植物基因组DNA提取试剂盒)从多个目的品种的植物材料中分别提取出DNA，再从叶绿体基因组中选择I至数个DNA区域，利用其两端的保守区序列设计引物，利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)扩增出相应的DNA片段，测序获得每个品种的基因组中的该区域的DNA序列；比较其之间的差异，利用同一位点上有差异的核苷酸分子字母及从5’端的某个可比的起点位置算起(或任意确定一个可比的起点位置)，计算出突变碱基在同源序列中的顺序位次数字，在突变碱基字母的右下角，附上该突变位点的位置数字，将这样的突变碱基描述按照顺序连接起来，即可构建出核苷酸分子式，该核苷酸分子式可用于区分或鉴定植物品种(谱系或品系)，当一个以上品种拥有同样的一个核苷酸分子式(即需要鉴定属于同一谱系或品系的多个品种时)，可结合表型性状进行植物品种(谱系或品系)的深入鉴定。表型性状指植物体所表现的性状，包括形态性状、生理特征、特性等。I、引物的设计针对DNA可变区域，可以设计出不止一对引物，均可用于分析、鉴定植物品种。但是，通常选择其中分辨率最高的区域之一加以利用，即可满足需要。选取牡丹叶绿体基因组DNA的psbE-petL基因间隔区设计了一对新的引物，正向引物 psbE-petL-356F(引物序列5’ 一CCTTCTTCTGACACAGCAATG—3’，序列 I)和反向引物psbE-petL-1219R(引物序列5’ 一TTACCATTATAGACAGCACTAACAA—3’，序列 2)。2、psbE-petL基因间隔区的扩增利用中国天根生物技术有限公司的植物基因组提取试剂盒(DP305)分别提取18种观赏牡丹品种‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’、‘红斑白’、‘凤丹’、‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’、‘肉芙蓉’、‘凤丹粉’的基因组DNA。将DNA稀释为每微升25纳克的工作液浓度(25ng/ul)，用上述引物psbE-petL-356F和psbE-petL_1219R进行PCR扩增，每个品种均可得到一条长度为728bp的目的DNA区域的序列。PCR扩增过程中采用的Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液是常规的、普通市售生化试齐U，本实验实施过程中购买的是宝生物技术(大连)有限公司的产品，产品编号为TaKaRaCode:DR100B，根据产品随附的操作指南进行PCR扩增。PCR扩增在Applied BiosystemsVerit 96-Well Thermal Cycler (Model#: 9902, made in Singapore) PCR 仪上进行。PCR扩增的程序为先94度保持4分钟；再进行如下34个温度循环，每个温度循环的设置为94度I分钟，53度(退火温度)40秒，72度I. 5分钟；最后，72度延伸8分钟。将上述18个品种扩增得到的DNA片段送北京华大基因有限公司(BeijingGenome Institute,简称 BGI),利用上述引物，在 3730x1 DNA analyzer (AppliedBiosystems, Foster City, California, USA)测序仪上直接PCR测序,每个品种取样测序了3个或3个以上个体，品种内个体间的测序实验结果一致。结果具体如下‘花二乔’、‘金针绣红袍’、‘叠云’、‘洛阳红’、‘珊瑚台’、‘冠世红玉’、‘金星雪浪’、‘花斑白’、‘景玉’品种扩增、测序得到的长度为728bp的(psbE-petL区)的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；
‘红斑白’、‘凤丹’品种扩增、测序得到的长度为728bp的(psbE-petL区)的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；‘豆绿’、‘姚黄’、‘大胡红’、‘罗绒红’、‘首案红’品种扩增、测序得到的长度为728bp的(psbE-petL区)的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；‘肉芙蓉’、‘凤丹粉’品种扩增、测序得到的长度为728bp的(psbE-petL区)的核苷酸序列为序列表中的序列6。3、序列比对将上述18个品种的长度为728bp的序列(序列3_序列6)进行比对，结果如表I :表I为18个观赏牡丹品种的4个遗传谱系间的可变碱基位点位置