专利名称：检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒的制作方法牛流行热(Bovine ephemeral fever, BEF)又名牛暂时热,牛三日热,僵硬病等。感染牛表现为急性发热、呼吸道和消化道机能障碍以及跛行和肢体僵直。发病率高，但死亡率低，通常为1% 2%。该病在发病地区呈周期性流行，跳跃式传播。病牛一般在3日左右(故名三日热)恢复。临床上与流行性感冒相似，故曾被称为牛流行性感冒。本病流行于非洲、亚洲和大洋洲以及中东的许多国家和地区。在北、南美洲及欧洲未曾有过报道。据 记载，我国自1938年就有本病流行，但直到1976年才得到证实，并分离到病毒。牛流行热造成比较严重的经济损失。种公牛感染本病后，精子畸形率可能高达70%以上。奶牛的产奶量降低，牛乳质量下降，并可能长期不能恢复正常。役用牛则因跛行或瘫痪而不能使役。护理和治疗不当时，死亡率可能上升。牛流行热病原为牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus, BEFV),属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)暂时热病毒属(genus Ephemerovirus)。牛流行热病毒呈子弹状或圆锥形。成熟病毒粒子长130 220nm，宽60 90nm。病毒粒子有囊膜，囊膜厚约10 12nm，表面具有纤细的突起。粒子中央为电子密度较高的核心一由紧密盘缠的核衣壳组成。如将核衣壳拉直，长达2. 2 y m。除典型的子弹形病毒粒子外，还常可以看到T粒子，即截短的窝窝头样病毒粒子，特别是在以高浓度病毒传代的细胞培养物内。于超薄切片中可以看到以出芽方式从胞膜或胞浆空泡膜上向细胞外或胞浆空泡内释放的病毒粒子。宿主细胞胞浆中有毒浆结构。胞浆内的结构变化显著，出现大量微管和微纤结构。牛流行热病毒在结构上与哺乳动物其它弹状病毒相似。含有负股单链RNA,长Ilkb左右，占病毒粒子总重的2%。牛流行热病毒有RNA聚合酶蛋白(L，180KDa)、糖蛋白(G，ISlKDa)、核蛋白(N，52KDa)、基质蛋白l(Ml，43KDa)、基质蛋白2(M2，129KDa)即磷酸蛋白(NS)等5种结构蛋白。本病为非接触性传染病，主要由吸血昆虫进行传播，按蚊和库蠓是牛流行热的媒介昆虫。在非洲肯尼亚本病流行地区的库蠓体内曾经分离到过病毒，在澳大利亚证明班按蚊和短跗库蠓也能携带病毒。这两个地区的流行毒株有相近的血清学关系。本病一般流行于夏末秋初，并受当地气候、河流和降雨量的影响。多发于吸血昆虫大量孳生的季节，采取灭蠓、灭蚊措施的牛场，牛的发病率明显低于不采取灭蠓灭蚊措施的牛场。根据临床症状和流行病学资料，对于本病不难作出初步诊断。牛流行热发生于夏末秋初，短期内广泛传播，但只发生于牛，特别是黄牛和奶牛。病牛明显发热，跛行或卧地不起，并有严重的呼吸困难，皮下常见气肿。为了确诊，可采病牛急性期血液或血沉管内的白细胞层，脑内接种乳鼠、乳仓鼠，常能分离到病毒。连续传代常可使潜伏期不断缩短第一代约6 10天；第二代5天左右；至第6 8代，仅2 3天即可使乳鼠全部发病死亡。分离到病毒以后，即可应用乳鼠或细胞培养物与已知标准免疫血清进行中和试验鉴定之。血清学检查应用以感染鼠脑或经BHK-21细胞传代的病毒制造的抗原，检测病畜急性期和恢复期的双份血清做中和试验或补体结合试验或间接免疫突光试验。Zakrzewski等(1994年)建立的检测牛流行热病毒特异性抗体的阻断ELISA法，由于采用针对该病毒糖蛋白Gl抗原位点的单克隆抗体，只对牛流行热病毒发生结合反应，而与相关病毒(如Berrimah, Kimberley病毒等)无交叉反应，因此与病毒中和试验相比，敏感性更高，操作更简单。是目前诊断及检测临床牛流行热的方法之一。分子生物学检测方法由于快速简便，已经开始应用于牛流行热的快速诊断和检测，特别是荧光RT-PCR检测技术更为快速和特异，在牛流行热的快速诊断方面具有独特优势。本研究为保证方法的通用性，保证探针的匹配性，我们在大量序列分析基础上，在国内首次设计MGB修饰的短探针用于检测牛流行热病毒，缩短了探针的核苷酸数量，并提高了方法的灵敏度
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测牛流行热病毒核苷酸序列，包括引物序列和基于MGB修饰的短探针序列。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于MGB修饰的检测牛流行热病毒的检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择牛流行热病毒G蛋白基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为23个碱基左右，GC含量为50% — 60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。探针的长度为16个简并碱基。一组检测牛流行热病毒的核苷酸序列，如下1)5’ -GAT CAA ATG TCC ACA ACG TTT RA-3’ (SEQ ID NO 1)2)5，-TGT TCA TCC TTT GCA AGA TTA TGA-3’ (SEQ ID NO 2)3)5，-[FAM]-TTR TCA CTT CAR GCC C_[MGB]_3，(SEQ ID NO :3)其中R代表A或G ;序列I)和2)分别为检测牛流行热病毒G基因的正义引物和反义引物，序列3)为检测牛流行热病毒G基因的MGB修饰的荧光短探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM (6-carboxy-荧光素)，3’端标记淬灭基团MGB。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了牛流行热病毒检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。检测牛流行热病毒检测试剂盒，由以下组分组成I)裂解液购自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反应液，表I为反应液配方；表I反应液配方本发明公开了检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒，该检测牛流行热病毒的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1至SEQIDNO3所示，其中序列SEQIDNO1和SEQIDNO2分别为检测牛流行热病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO3为检测牛流行热病毒的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物的检测牛流行热病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好、不易污染的特点。