固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生产左旋氨基酸的方法

覃业亚

2001年8月1日

2000年1月18日

2000年1月18日

覃业亚

C12P13/00GK1306092SQ0011323

酰化 水解酶 固定化 消旋 拆分 氨基

1.一种固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸的方法，其特征是(1)弱酸性阴离子交换树脂经平衡后，装柱，将氨基酰化水解酶(市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g载体的流速匀速通过载体柱，进行酶的固定化，当固定化酶活力达到500～700μ/g载体时，固酶完毕(2)将D,L-N-乙酰基氨基酸配成5～10％(w/w)水溶液，用Na2CO3或NH3·H2O调整溶液PH为6.5～10.0(3)将D,L-N-乙酰基氨基酸水溶液在42～45℃保温状态下，以0.01～0.05ml/min·g载体的流速匀速通过酶柱，进行拆分(4)拆分液在60～70℃真空减压浓缩至原体积的1/2～1/4冷却至0～5℃，搅拌结晶，分离后经乙醇或甲醇洗涤，干燥得左旋氨基酸(5)调整结晶母液PH1.0～5.0，搅拌，结晶，分离，干燥，得D-N-乙酰基氨基酸(6)将D-N-乙酰基氨基酸制得D,L-N-乙酰基氨基酸2.如权利要求1所速，制备固定化氨基酰化水解酶的方法，其特征是采用弱酸性阴离子交换树脂作为固酶载体3.如权利要求1所述，制备固定化氨基酰化水解酶的方法，其特征是使用氨基酰化水解酶，并配成活力为1000～1500μ/mL酶液，用Na2CO3或NH3·H2O调整PH6.5～10.0，在42～45℃，以0.01～0.05mL/min.g载体匀速流过酶柱4.如权利要求1所述，制备固定化氨基酰化水解酶的方法，其特征是当酶被载体固定化后，用0.1～0.2M醋酸钠溶液进行洗涤5.如权利要求1所述，其特征是底物浓度为5～15％(w/w)，并用Na2CO3或NH4OH调整PH6.5～10.06.如权利要求1所述，其特征是拆分温度控制在42～45℃，底物按0.01～0.05mL/min·g载体匀速通过固定化氨基酰化水解酶柱7.如权利要求1所速，其特征是拆分液在真空状态下，60～70℃进行减压浓缩，浓缩比控制在2～4∶18.如权利要求1所述的D,L-N-乙酰基氨基酸的制取步骤，特征在于取一重量分D,L-氨基酸，置于搪玻璃反应釜中，加入1～5份水，在搅拌状态下，滴加其理论用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成温度为25～50℃，滴加完毕后，在25～50℃保温搅拌5～10小时，置于搪玻璃结晶釜中，冷却至0～5℃，加入结晶促进剂，搅拌结晶≥5小时，离心分离，得D,L-N-乙酰基氨基酸9.权利要求1所述的D-N-乙酰基氨基酸的回收方法，特征在于(1)将离心分离出L-氨基酸的结晶母液投入搪玻璃反应釜中，用10～20％浓度硫酸或25～30％浓度盐酸调整PH1.5～5，升湿至45±5℃(2)将上速溶液置于搪玻璃结晶釜中，冷却静置结晶，结晶温度0～5℃，结晶时间≥5小时(3)用离心机离心分离，40～100℃干燥，得D-N-乙酰基氨基酸10.权利要求1所述的D-N-乙酰基氨基酸外消旋，其特征是接如下步骤进行的(1)将D-N-乙酰基氨基酸在40～100℃条件下常压干燥其水份≤3％(2)将一重量份D-N-乙酰基氨基酸用1.5～3重量份水溶解，加入其理论用量1～3倍乙酸酐，升温至60～70℃，搅拌3～5小时，然后冷却至0～5℃，结晶≥5小时，离心脱水后，在40～100℃，干燥，得D,L-N-乙酰基氨基酸

本发明涉及一种生化制品的生产方法，即固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生产左旋氨基酸的方法，D,L-N-乙酰基氨基酸的制取、固定化载体及固化方法、D-N-乙酰基氨基酸外消旋的方法氨基酸是指分子中既含有氨基又含有羧基的一类化合物的总称它是构成生物体蛋白的基本物质随着现代科学技术的发展，氨基酸已广泛应用于医药、生化农药、食品调味剂及强化营养剂、植物生长调节剂、皮革、日用化妆品、保健等领域，应用范围日益扩展自然界赋存的氨基酸一般为左旋体，存在于动植物体中，是具有生物活性的一类从以肽链形式结合的多种氨基酸构成的生物蛋白中提取左旋氨基酸，一方面组分复杂，分离纯化成单一结晶的氨基酸，工艺繁长，收率极低；另一方面，环境污染十分严重，因而为现代社会逐步淘汰人工合成氨基酸，产量大，收率高，但除甘氨酸外，均为左旋体与右旋体的混合物右旋体氨基酸往往对生物机能产生毒副作用或不具备生物活性，所以，对人工合成的氨基酸往往要进行左、右旋体的拆分，以达到一定的光学纯度左、右旋体氨基酸由于空间结构的不同，使平面偏振光发生相同角度、不同方向的偏转，表现出各异的生物性能，但由于分子结构一样，故而其物理性质没有明显的差异，而化学性质完全一样，分离左、右旋体十分困难本发明的目的是提供一种固定化氨基酰化水解酶高效拆分外消旋氨基酸生产左旋氨基酸的方法本发明的原理是1、D,L-N-乙酰基氨基酸的制取 2、D,L-N-乙酰基氨基酸酶拆分 CO2-CO2-OH3N-C-H++H-C-N-C-CH3RR HL-氨基酸D-N-乙酰基氨基酸3、D-N-乙酰基氨基酸外消旋 本发明推出的固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸的方法步骤如下(1)弱酸性阴离子交换树脂经平衡后，装柱将氨基酰化水解酶(市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶，在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g载体的流速匀速通过载体柱，进行酶的固定化当固定化酶活力达到500～700μ/g载体时，固酶完毕然后用0.15M醋酸钠溶液洗涤(2)将D,L-N-乙酰基氨基酸配成5～10％(w/w)水溶液，用Na2CO3或NH3·H2O调整溶液PH为6.5～10.0(3)将D,L-N-乙酰基氨基酸底物溶液在42～45℃保温状态下，以0.01～0.05mL/min·g载体的流速匀速通过酶柱，进行拆分(4)拆分液在60～70℃真空减压浓缩至原体积的1/2～1/4，冷却至0～5℃，搅拌结晶，分离后经乙醇或甲醇洗涤，干燥得左旋氨基酸(5)调整结晶母液PH1.0～5.0，搅拌升温后用硫酸或盐酸调整PH1.5～5.0，静置冷却结晶，分离干燥得D-N-乙酰基氨基酸(6)将D-N-乙酰基氨基酸用1.5～3重量份水溶解，加入其理论用量1～3倍乙酸酐，升温至60～70℃，搅拌3-5小时，然后冷却至0～5℃，结晶≥5小时，离心脱水后，在40～100℃干燥，得D,L-N-乙酰基氨基酸本方法中涉及的D,L-N-乙酰基氨基酸是按如下步骤制取的取一重量份的D,L-氨基酸，投入搪瓷反应釜中，加入1-5重量份水，在搅拌状态下，滴加其理论用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成温度为25～50℃，滴加完毕后，在25～50℃保温搅拌5～10小时，置于搪玻璃结晶釜中，冷却至0～5℃，加入结晶促进剂，搅拌结晶≥5小时，离心分离，得D,L-N-乙酰基氨基酸本发明所涉及的固定化载体及固化方法如下(1)固定化酶载体采用弱酸性阴离子交换树脂(2)将一重量份的树脂浸泡于3重量份0.2N NaoH溶液中，静置30小时，然后用去离子水漂洗至PH7～8，再浸泡于3重量份0.2N盐酸溶液中，静置30小时，然后用去离子水漂洗至PH5～6(3)将经上述处理的树脂装柱，恒温至43±1℃；将氨基酰化水解酶恒温至43土1℃，以0.01～0.05mL/min·g载体的流速匀速从载体柱底部向上通过；用43土1℃的去离子水通过酶柱，此时固定酶活力达到500～700μ/g载体，在43±1℃恒温备用本发明所涉及的D-N-乙酰基氨基酸外消旋是按如下步骤进行的(1)将D-N-乙酰基氨基酸在40～80℃条件下常压干燥其水份≤3％(2)将一重量份经干燥后的D-N-乙酰基氨基酸投入搪玻璃反应釜中，加入1.5～3倍重量份的水溶解(3)加入其理论用量1～3倍乙酸酐，升温至60～70℃，搅拌3～5小时(4)在搅拌状态下，冷却至0～5℃，结晶≥5小时(5)离心脱水，然后在40～100℃干燥，得D,L-N-乙酰基氨基酸本发明的优点是载体便宜，容量大，固定化酶活力高达500～700μ/g载体·h，半衰期长达240天，固定化酶再生容易；运用本发明可拆分一切α-氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸，缬氨酸等α-氨基酸同时，运用本发明生产左旋氨基酸可以简化反应产物的提纯步骤，而且收率也比可溶性自由酶高；生产过程中酶的成本大大下降；应用本发明生产过程可以实现自动化控制节省劳力；利用固定化氨基酰化水解酶连续生产的总成本约是利用水溶性酶的分批拆分方法的80％实施例1D,L-乙酰基丝氨酸的合成将100kgD,L-乙酰基丝氨酸投入到搪玻璃反应釜中，加入100kg水，搅拌、保温至60℃，滴加130kg醋酐，保持合成液温度为60±5℃，滴加完毕，在60℃保温搅拌8小时，再置于搪玻璃结晶釜中，冷却至0～5℃，加入结晶促进剂，静置结晶8小时，离心分离，干燥，得D,L-乙酰基丝氨酸133kg，收率90％实施例2D,L-乙酰基蛋氨酸的合成将100kgD,L-蛋氨酸投入到搪玻璃反应釜中，加入250kg水，搅拌，在60℃滴加95kg醋酐，滴加完毕，在65℃保温搅拌6小时再置于搪玻璃结晶釜中，冷却至0～5℃，加入结晶促进剂，静置结晶8小时，离心分离，干燥，得D,L-乙酰基蛋氨酸122kg，收率95％实施例3D,L-乙酰基精氨酸的合成将100kgD,L-精氨酸投入到搪玻璃反应釜中，加入100kg水，搅拌至全溶，在60℃滴加85kg醋酐，滴加完毕，在65℃保温搅拌10小时，再置于搪玻璃结晶釜中，冷却至0～5℃，加入结晶促进剂，静置6～8小时，离心分离，干燥，得D,L-乙酰基精氨酸115kg，收率93％实施例4固定化氨基酰化水解酶的制备取10kg弱酸性阴离子交换树脂，置于50L容器中，加入0.2N NaoH溶液30L，浸泡30小时，然后用去离子水漂洗至PH7～8，加入30L0.2N盐酸溶液，浸泡30小时，用去离子水漂洗至PH6.0将经上述处理的树脂装入直径140m/m，高800m/m的夹层玻璃柱中，恒温至43±1℃将氨基酰化水解酶制成1000～1500μ/mL酶液，恒温至43±1℃，以500mL/min的流速匀速从载体柱底部向上通过，然后用43±1℃50升0.2N醋酸钠溶液和50升去离子水通过酶柱，此时，固定化酶活力达到580μ/g，载体在43±1℃恒温备用实施例5固定化氨基酰化水解酶拆分D,L-N-乙酰基丝氨酸生产L-丝氨酸将130kgD,L-乙酰基丝氨酸溶解于1800L水中，用Na2CO3调整PH8.0，恒温至43±1℃，将恒温液以125L/h流速从固定化酶柱匀速通过，流出液置于真空浓缩蒸发器中，在-0.07MPa、65℃下浓缩至原体积的30％，将浓缩料投入搪玻璃结晶釜中，于0～5℃冷却结晶8小时，离心分离，结晶体用50升乙醇浸洗，离心，在100±5℃下干燥4小时，得L-丝氨酸产品44kg，收率95％结晶母液用20％浓度盐酸调PH1.5，在搪玻璃结晶釜中，0～5℃冷却结晶15小时，离心分离，干燥得D-乙酰基丝氨酸61kg，收率94％将经干燥的D-N-乙酰基丝氨酸60kg，投入搪玻璃反应釜中，加入120kg水和100kg乙酸酐，升温至60℃，搅拌5小时后，冷却至0～5℃，结晶8小时，离心脱水，在70℃干燥4小时，得D,L-N-乙酰基丝氨酸55kg，收率91.7％，转入固定化酶拆分实施例6固定化氨基酰化水解酶拆分D,L-N-乙酰基蛋氨酸生产L-蛋氨酸将120kgD,L-乙酰基蛋氨酸溶解于1200L水中，用NH4OH调整PH9.2，恒温至43±1℃，将恒温液以100L/h流速从固定化酶柱匀速通过，流出液置于真空浓缩蒸发器中，在-0.065MPa、60℃下浓缩至原体积的35％，将浓缩料投入搪玻璃结晶釜中，于0～5℃冷却结晶8小时，离心分离，结晶体用70升甲醇浸洗，离心，在100±5℃干燥6小时，得L-蛋氨酸产品45kg，收率96％结晶母液用20％浓度盐酸调PH1.8，在搪玻璃结晶釜中，0～5℃冷却结晶15小时，离心分离，50℃±5℃干燥8小时得D-乙酰基蛋氨酸58kg，收率97％将经干燥的D-乙酰基蛋氨酸58kg，投入到搪玻璃反应釜中，加入130kg水及100kg乙酸酐，升温至65℃，搅拌8小时，然后冷却0～5℃，结晶12小时，离心脱水，在60℃干燥4小时，得D,L-N-乙酰基蛋氨酸54kg，收率92％，转入固定化酶拆分实施例7固定化氨基酰化水解酶拆分D,L-N-乙酰基精氨酸生产L-精氨酸将110kgD,L-乙酰基精氨酸溶解于1000升水中，用NH4OH调整PH9.5，恒温至43±1℃，将恒温液以100L/h流速从固定化酶柱中匀速通过，流出液置于真空浓缩蒸发器中，在-0.07MPa、60℃下浓缩至原体积的25％，将浓缩料投入搪玻璃结晶釜中，于0～5℃冷却结晶8小时，离心分离，结晶体用80升甲醇浸洗，离心，在95±5℃干燥5小时，得L-精氨酸产品42.5kg，收率96％结晶母液用20％浓度盐酸调PH2.0，在搪玻璃结晶釜中，0～5℃冷却结晶12小时，离心分离，60℃±5℃干燥10小时，得D-乙酰基精氨酸52kg，收率94％将经干燥的D-乙酰基精氨酸52kg投入到搪玻璃反应釜中，加入100kg水及100kg乙酸酐，升温至60℃，搅拌6小时，然后冷却至0～5℃，结晶10小时，离心脱水，在60℃干燥6小时，得D,L-N-乙酰基精氨酸48kg，收率92％，转入固定化酶拆分