微生物催化制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株制作方法

林志坚, 沈寅初, 郑仁朝, 郑裕国

2012年11月14日

2010年6月21日

2010年6月21日

浙江工业大学

C12R1/365GK102776252SQ20121023945

氨基 催化 制备 微生物

1.一种微生物催化法制备2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈为底物，以小球诺卡氏菌(Nocardia globerula) CCTCC NoM209214发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述反应在水或pH6.(TlO. O的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为O.03、. 3Μ4.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述腈水合酶来自小球诺卡氏菌CCTCCNoΜ209214经发酵获得的含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5 50g/L5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到 (1)将经斜面活化的小球诺卡氏菌CCTCCNo M209214接入种子培养基中，于2(T40°C下培养24 48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉 2 8. Og/L，蛋白胨 Γ4. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, K2HPO4O. 5 I. 5g/L, NaClO. 5 3. 0g/L,己内酰胺 0. 5 2. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. θΓθ. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L，溶剂为水，pH 6. 0 8· O ； (2)将种子液以1 10%体积比接入产酶培养基中，于2(T40°C下培养48 96h，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组成如下蔗糖5. (TlO. 0g/L,柠檬酸钠2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L,氯化钠0. 5 2. 0g/L,磷酸二氢钾 0. 5 2. 5g/L，氯化钴 0. 005^0. 01g/L,氯化铁 0. 005^0. 01g/L,氯化锰O. 005 O. 01g/L，诱导剂I. 0 3· 0g/L，溶剂为水，ρΗ6· 0 8· O ;所述诱导剂为下列之一谷氨酸钠、2，2-二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后，悬浮于水或pH6. (TlO. O的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈至底物浓度为0. 03 0. 3Μ，于15 40°C、10(T200rpm下反应l(T60min ;反应结束后，转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下反应结束后，取转化液12000rpm离心IOmin,收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤，得到脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0. IMpa，水浴加热温度4(T60°C、转速6(Tl00rpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺粗品；将2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺粗品溶于2(T65°C的乙酸乙酯，加入体积为乙酸乙酯体积10%盐析剂正己烧，于0 4°C保温结晶；过滤，取滤渣用正己烧洗漆，干燥得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺晶体8.小球诺卡氏菌(Nocardiagloberula)ZJB_09141，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo M209214，保藏日期2009年9月27曰

本发明涉及一种微生物催化法制备2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，以及在生产过程中用到的新菌株