专利名称：富含γ-氨基丁酸和植物乳杆菌的发酵型果蔬粉的制备方法由于GABA具有重要的生理功能，所以产GABA的植物乳杆菌在开发功能性谷物品、饮料及保健品等方面有很好的应用潜力，这些产品不仅含有GABA，还含有丰富的益生菌。如文献报导植物乳杆菌添加到酱油后酵过程中，可以生产富含GABA和植物乳杆菌的功能型酱油。利用奶酪生产使奶酪中GABA的含量达到了 383 mg/kg。Park从泡菜中筛选出短乳杆菌发酵得到GABA产量达到2. 5 g/L,并使用发芽大豆提取物和牛奶为发酵材料，加入混合菌体进行发酵制作酸奶，得到酸奶中GABA含量为424. 67 u g/g。 对于富含Y-氨基丁酸功能性食品的开发日本研究的工作较多，已有一些实现了商品化生产，如日本的佳叶龙茶，奥里扎公司生产的富含GABA米胚芽提取物，法凯尔公司的发芽糙米，还有大洋香料公司以牛乳和天然谷氨酸为主要原料经乳酸发酵生产的GABA富集食品“佳巴拉克托”，风味良好，适合制成功能饮料和食品。而我国在这方面处于起步阶段，目前，我国浙江益万生物技术有限公司成功生产富含GABA米胚芽和安徽来福高科股份有限公司生产的GABA食品添加剂等。目前我国南方的果蔬资源丰富，价格低廉，且果蔬加工业严重滞后于种植业的发展，每年存在大量的残次果蔬和无法销售的剩余果疏，如果利用植物乳杆菌制作富含GABA的果蔬粉产品，不仅提高了果蔬粉的营养，而且是果蔬加工的技术延伸，增加果蔬附加值的一个重要方向。如今GABA及植物乳杆菌已被中华人民共和国卫生部批准为新资源食品，因此利用植物乳杆菌发酵制备富含GABA的果蔬粉更具有现实意义和广阔的前景。
本发明目的是提供一种富含Y -氨基丁酸(GABA)和植物乳杆菌的发酵型果蔬粉的生产工艺。本发明采用的技术方案是—种富含Y -氨基丁酸和植物乳杆菌的发酵型果蔬粉的制备方法，所述方法包括(I)将原料果蔬去皮压榨，加入纤维素酶和果胶酶(酸性果胶酶)复合酶粉进行酶处理，再离心过滤取上清液得到果蔬汁；(2 )将果蔬汁稀释至含糖量为2 50g/L，再添加酵母膏20 g/L,乙酸钠2 g/L，谷氨酸钠2 50 g/L，调节pH值为6. 6 6. 8 (用柠檬酸、盐酸或氢氧化钠进行调配)，得到发酵培养基；需根据果蔬汁中的糖含量的不同进行调配，一般需稀释2 10倍使含糖量大致在2 50g/L，以减少高含糖量对产GABA的抑制作用；(3)发酵培养基经灭菌后,接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCTCCNO M 2011364，在30 35°C下厌氧静置培养80 200h，得到发酵液；菌株在接种至发酵培养基之前通常需要进行种子扩大培养，所用种子培养基为MRS培养基，初始pH值为6. 2 6. 4，培养条件为30 35°C下厌氧培养18 24h，获得种子液再以2 5%体积比接种量接种至发酵培养基；发酵结束后，采用高效液相色谱法可以较准确得出发酵后果蔬粉中的GABA的含量，同时采用不同的稀释度涂布于固体果蔬汁发酵培养基上即可得出菌落数；(4)发酵液浓缩(一般浓缩至固含量3(T40%即可)、喷雾干燥，即得所述发酵型果蔬粉。所述原料果蔬为下列之一柑桔、苹果、葡萄、草莓、番茄、西瓜。优选的，所述步骤(I)中纤维素酶和果胶酶酶粉用量以酶活计为1:1(本发明中，所用纤维素酶酶粉的酶活为10000U/g，果胶酶酶粉的酶活为30000U/g，两者质量比为3:1)。复合酶总添加量为2飞万U/kg果蔬汁。 所述步骤(2)中添加了谷氨酸或谷氨酸钠，本发明植物乳杆菌CCTCC NO M2011364能在以谷氨酸或谷氨酸钠为底物的培养基中生产GABA。所用原料为柑桔时，由于柑桔含有大量苦味物质，主要成分是柚皮苷，因此在厌氧发酵后期需要进行酶法脱苦处理，以除去其中苦味物质，可有效降低发酵液的苦味，具体为在步骤(3)厌氧发酵至60 150 h时加入50(Tl200U/L发酵培养基的柚皮苷酶(即脱苦酶)进行同步脱苦，所述柚皮苷酶由黑曲霉(Aspergillus niger)CCTCC NO M 206047经发酵获得，具体菌株信息及发酵方法参见CN101089175A。本发明还涉及过程所用的菌株-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZOlI，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期 2011 年 10 月 24 日，保藏编号 CCTCC No M 2011364。所述步骤(4)喷雾干燥条件为进料温度35°C，进口温度140°C，出口温度55°C，进风气压0. 25 0. 3MPa，离心转盘转速保持在20000 r/min。所得产品出料水分含量彡6%，冷却后密封，置于4°C干燥处保藏。本发明利用已筛得的能产GABA的植物乳杆菌为发酵菌株，以果蔬为基本原料，通过代谢控制厌氧发酵与低温干燥，得到果蔬发酵液中的GABA和乳杆菌活菌数含量高，GABA可达6. 9 g/L,活菌数可达5X 108cfu/ml，果蔬粉的收率为8% 20%。利用植物乳杆菌制作富含GABA和植物乳杆菌的果蔬粉产品，不仅提高果蔬粉的营养，而且是果蔬粉加工的技术延伸，增加果蔬粉附加值具有现实意义和广阔的前景。(二)桔汁培养基成分调配与发酵工序(I)向上述稀释桔汁再添加酵母膏20 g/L,乙酸钠2 g/L，谷氨酸钠15 g/L ;将培养基pH调至6. 4 6. 6，100°C灭菌20min，冷却至室温。(2)菌种的保藏与培养方法I)菌种Lactobacillus plantarum WZOll (即 CCTCC No M 2011364)；2)培养基与培养条件种子培养基(MRS培养液)蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠 5 g/L，柠檬酸二铵 2 g/L，磷酸氢二钾 2 g/L，吐温-80 I mL/L, MnSO4*4H200.25 g/L, MgSO4*7H20 0. 58 g/L，溶剂为水，pH 6. 2 6. 4。斜面培养基同种子培养基(外加琼脂20g/L)。种子培养250 mL三角瓶中装入50 mL MRS培养液，挑取纯化的乳酸菌入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30°C厌氧静置培养18 ho(3)发酵条件种子液接种量(v/v)为4%，桔汁发酵培养基在35°C下厌氧静置培养12011，初始？11=6.4 6.6。厌氧发酵至80 h时加入700 U/L发酵培养基的柚皮苷酶进行同步脱苦(由黑曲霉(Aspergillus niger) CCTCC NO M 206047经发酵获得，柚皮苷酶活力为 20000U/g)。(4) 35°C静置培养120 h后，采用液相色谱法测定桔汁培养基中的GABA含量，得出GABA产量达6. 9 g/L。再采用涂布桔汁固体发酵培养基法测得桔汁发酵液中植物乳杆菌活菌数达5X 108cfu/ml，谷氨酸钠利用率达87. 9%。(H)后处理对桔汁培养基的浓缩液进行喷雾干燥加工，进料浓度约40%，进料温度35°C，进口温度140°C，出口温度55°C，进风气压0. 25 0. 3MPa，离心转盘转速保持在20000 r/min。干燥后柑桔果粉得收率为15%，水分含量彡4%。活菌数达4. 3 X IO9 cfu/g, GABA含量为6. 2%。实施例2 (一)原料准备以11月份采摘的栊柑为原料，进行去皮榨汁，取50kg浆汁加入纤维素酶和果胶酶质量比3:1的复合酶粉(纤维素酶10000u/g，酸性果胶酶酶活30000u/g，购自无锡雪梅制剂科技有限公司)共120g进行酶处理，得到粗桔汁，然后进行离心过滤，以除去皮囊、核仁等残渣，然后用保鲜膜封好放入4°C的冰箱内冷藏备用。桔汁的调配稀释桔汁稀释之前葡萄糖含量为56 g/L，稀释5倍后，糖含量为10. llg/L。(二)桔汁培养基成分调配与发酵工序(I)向上述稀释桔汁再添加酵母膏20 g/L，乙酸钠2 g/L，谷氨酸15 g/L。将培养基pH调至6. 4 6. 6。100°C灭菌为20min，冷却至室温。(2)菌种的保藏与培养方法I)菌种Lactobacillus plantarum WZOll2)培养基与培养条件种子培养基(MRS培养液)蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠 5 g/L，柠檬酸二铵 2 g/L，磷酸氢二钾 2 g/L，吐温-80 I mL/L, MnSO4*4H200.25 g/L, MgSO4*7H20 0. 58 g/L，溶剂为水，pH 6. 2 6. 4。斜面培养基同种子培养基(外加琼脂20g/L)。种子培养250 mL三角瓶中装入50 mL MRS培养液，挑取纯化的乳酸菌接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30°C厌氧静置培养18 ho(3)发酵条件种子液接种量(v/v)为4%，桔汁发酵培养基在35°C下厌氧静置培养130h，初始pH=6. 4 6. 6。厌氧发酵至70 h时加入1100 U/L发酵培养基的柚皮苷酶进行同步脱苦(柚皮苷酶活力为20000U/g)。
(4)35°C厌氧静置培养130 h后，采用液相色谱法测定桔汁培养基中的GABA含量，得出GABA产量达3. 8 g/L。再采用涂布桔汁固体发酵培养基法测得桔汁发酵液中植物乳杆菌活菌数达2 X IO8 cfu/ml，谷氨酸钠利用率达70. 9%。(H)后处理对桔汁培养基的浓缩液进行喷雾干燥加工，进料浓度约40%，进料温度35°C，进口温度140°C，出口温度55°C，进风气压0. 25 0. 3MPa，离心转盘转速保持在20000 r/min。干燥后柑桔果粉得收率为10%，水分含量彡4%。活菌数达I. 5 X IO9 cfu/g, GABA含量为3. 1%。实施例3 (一)原料准备以11月份采摘的栊柑为原料，进行去皮榨汁，取50kg浆汁加入纤维素酶和果胶酶质量比3:1的复合酶粉(纤维素酶10000u/g，酸性果胶酶酶活30000u/g，购自无锡雪梅制剂科技有限公司)共120g进行酶处理，得到粗桔汁，然后进行离心过滤，以除去皮囊、核仁等残渣，然后用保鲜膜封好放入4°C的冰箱内冷藏备用。桔汁的调配稀释桔汁中没稀释时葡萄糖含量为20. 5 g/L，稀释6倍，糖含量为3. 35g/L。(二)桔汁培养基成分调配与发酵工序(I)向上述稀释桔汁再添加酵母膏20 g/L，乙酸钠2 g/L，谷氨酸钠15 g/L。将培养基pH调至6. 4 6. 6，100°C灭菌20min，冷却至室温。(2)菌种的保藏与培养方法同实施例I。(3)发酵条件种子液接种量(v/v)为4%，桔汁发酵培养基在35°C下厌氧静置培养10011，初始？11=6.4 6.6。厌氧发酵至80 h时加入500 U/L发酵培养基的柚皮苷酶进行同步脱苦(柚皮苷酶活力为20000U/g)。(4) 35°C静置培养100 h后，采用液相色谱法测定桔汁培养基中的GABA含量，得出GABA产量达4. 677 g/L。再采用涂布桔汁固体发酵培养基法测得桔汁发酵液中植物乳杆菌活菌数达3X 108cfu/ml，谷氨酸钠利用率达72. 3%。(H)后处理对桔汁培养基的浓缩液进行喷雾干燥加工，进料浓度约40%，进料温度35°C，进口温度140°C，出口温度55°C，进风气压0. 25 0. 3MPa，离心转盘转速保持在20000 r/min。干燥后柑桔果粉得收率为9%，水分含量彡4%。活菌数达2. 5 X IO9 cfu/g, GABA含量为4. 5%实施例4:(一)原料准备
以11月份采摘的栊柑为原料，进行去皮榨汁，取50kg浆汁加入纤维素酶和果胶酶质量比3:1的复合酶粉(纤维素酶10000u/g，酸性果胶酶酶活30000u/g，购自无锡雪梅制剂科技有限公司)共120g进行酶处理，得到粗桔汁，然后进行离心过滤，以除去皮囊、核仁等残渣，然后用保鲜膜封好放入4°C的冰箱内冷藏备用。桔汁的调配稀释桔汁中没稀释时葡萄糖含量为35. 5 g/L，稀释6倍，糖含量为5. 35g/L。(二)桔汁培养基成分调配与发酵工序(I)向上述稀释桔汁再添加酵母膏20 g/L，乙酸钠2 g/L，谷氨酸钠8 g/L。将培养基pH调至6. 4 6. 6，100°C灭菌20min，冷却至室温。(2)菌种的保藏与培养方法同实施例I。(3)发酵条件种子液接种量(v/v)为4%，桔汁发酵培养基在35°C下厌氧静置培 养12011，初始？11=6.4 6.6。厌氧发酵至80 h时加入650 U/L发酵培养基的柚皮苷酶进行同步脱苦(柚皮苷酶活力为20000U/g)。(4) 35°C静置培养120 h后，采用液相色谱法测定桔汁培养基中的GABA含量，得出GABA产量达5. 337 g/L。再采用涂布桔汁固体发酵培养基法测得桔汁发酵液中植物乳杆菌活菌数达3. 9 X IO8 cfu/ml，谷氨酸钠利用率达60. 9%。(H)后处理 对桔汁培养基的浓缩液进行喷雾干燥加工，进料浓度约40%，进料温度35°C，进口温度140°C，出口温度55°C，进风气压0. 25 0. 3MPa，离心转盘转速保持在20000 r/min。干燥后柑桔果粉得收率为11%，水分含量< 4%。活菌数达3. I X IO9 cfu/g, GABA含量为5. 0%。实施例5 (一)原料准备以10月份采摘的番茄为原料，进行去皮榨汁，取50kg浆汁加入纤维素酶和果胶酶质量比3:1的复合酶粉(纤维素酶10000u/g，酸性果胶酶酶活30000u/g，购自无锡雪梅制剂科技有限公司)共120g进行酶处理，得到粗番茄汁，然后进行离心过滤，以除去皮囊、核仁等残渣，然后用保鲜膜封好放入4°C的冰箱内冷藏备用。番茄汁的调配稀释番茄汁中没稀释时糖含量为20. 5 g/L,稀释4倍，糖含量为5. 15g/L。(二)番茄汁培养基成分调配与发酵工序(I)向上述稀释番茄汁再添加酵母膏20 g/L，乙酸钠2 g/L，谷氨酸钠15 g/L。将培养基pH调至6. 4 6. 6，100°C灭菌时间20min，冷却至室温。(2)菌种的保藏与培养方法同实施例I。(3)发酵条件种子液接种量(v/v)为4%，番茄汁发酵培养基在35°C下厌氧静置培养 120h，初始 pH=6. 4 6. 6。(4)35°C静置培养120 h后，采用液相色谱法测定番茄汁培养基中的GABA含量，得出GABA产量达5. 224 g/L。再采用涂布计数法测得番茄汁发酵液中植物乳杆菌活菌数达4. 5 X IO8 cfu/ml，谷氨酸钠利用率达80. 9%。(H)后处理
对番茄汁培养基的浓缩液进行喷雾干燥加工，进料浓度约40%，进料温度35°C，进口温度140°C，出口温度55°C，进风气压0. 25 0. 3MPa，离心转盘转速保持在20000 r/min。
干燥后番茄粉得收率为10%，水分含量彡4%。活菌数达4 X IO9 cfu/g, GABA含量为5%。


本发明提供了一种富含γ-氨基丁酸(GABA)和植物乳杆菌的发酵型果蔬粉的生产工艺。本发明利用已筛得的能产GABA的植物乳杆菌为发酵菌株，以果蔬为基本原料，通过代谢控制厌氧发酵与喷雾干燥，得到果蔬发酵液，所含GABA和乳杆菌活菌数含量高， GABA达6.9 g/L以上，活菌数达5×109 cfu/ml以上，果蔬粉的收率为8%～20%。本发明利用植物乳杆菌制作富含GABA和植物乳杆菌的果蔬粉产品，不仅提高果蔬粉的营养，而且是果蔬粉加工的技术延伸，增加果蔬粉附加值，具有现实意义和广阔的应用前景。