专利名称：用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法人类表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是HER/ErbB家族成员之一，因此又名HERl或ErbBl。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号，经过细胞质中衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或其配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。美国食品药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康(Aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼(Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)，我国也与2005年2月批准了吉非替尼进入临床。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功能区的ATP结合位点，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。美国哈佛医学院的研究人员Lynch等率先报道，肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18 21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80%以上。这种现象可能是由于EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。研究表明，美国非小细胞肺癌患者中只有约10%有EGFR基因突变，然而在亚洲人中，约30%的非小细胞肺癌患者有EGFR基因突变。临床运用的结果表明，EGFR基因外显子18 21的突变(体细胞突变)是患者对此类靶向药物有效的必要前提，如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率熔解曲线法。直接测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。因此，如何快速准确的检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变，就成为人们亟待解决的问题。
为了克服现有技术检测能力的不足，本发明提供一种检测人类EGFR基因29种突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。本发明的目的是这样实现的 一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，包括下列5组引物和探针中的至少一组 (1)5’ - ggtgacccttgtctctgtgttcttgtcc-3’ SEQ ID NO: I 5’ - gtgccgaacgcaccggatg -3’SEQ ID NO: 2 5， - gtgccgaacgcaccggagtt -3，SEQ ID NO: 3 5’ - gccgaacgcaccggagga -3’SEQ ID NO: 45， - FAM/ccttcaagatcctcaagagagcttggttggg/BHQl-3， SEQ ID NO: 5
(2)5， - gggcagcatgtggcaccatct-3’SEQ ID NO: 6 5’ - ccttgttggctttcggagatgtcttg -3’ SEQ ID NO: 7
5’ - tccttgttggctttcggttccttg -3’SEQ ID NO: 8
5’ - tccttgttggctttcggagatattttg -3’ SEQ ID NO: 9
5’ - ccttgttggctttcggagccttg -3’SEQ ID NO: 10
5’ - ccttgttggctttcggagattgct -3’SEQ ID NO: 11
5’ - tggctttcggagatgttggttcct -3’SEQ ID NO: 12
5’ - ccttgttggctttcggagattcctt -3’ SEQ ID NO: 13
5’ - gttggctttcggagatggttccttg -3’ SEQ ID NO: 14
5， - FAM/tctcaccttctgggatccagagtccctatga/BHQl-3， SEQ ID NO: 15
(3)5， - cccgtatctcccttccctgattacctt -3， SEQ ID NO: 16 5’ - gcacacaccagttgagcaggtact -3’ SEQ ID NO: 17
5’ - cctccaccgtgcagctcatcct -3’SEQ ID NO: 18
5， - caggaagcctacgtgatggccct -3，SEQ ID NO: 19
5’ - cagcgtggccagcgtggac -3’SEQ ID NO: 20
5’ - tgatggccagcgtggacggt -3’SEQ ID NO: 21
5’ - agcgtggacaacccccaccac -3’SEQ ID NO: 22
5， - FAM/cccttcggctgcctcctggactatgt/BHQl-3， SEQ ID NO: 23
(4)5， - cacagcagggtcttctctgtttca -3，SEQ ID NO: 24 5’ - gcacccagcagtttggcac -3’ SEQ ID NO: 25
5’ - tggtattctttctcttccgcacccaggt -3’ SEQ ID NO: 26
5， - FAM/ tcttgacatgctgcggtgttttcaccagtac/BHQl-3， SEQ ID NO: 27
(5)5， - cttccagtttgccaaggcacgag -3，SEQ ID NO: 28 5’ - cctctgcacataggtaatttccaaattcc -3’ SEQ ID NO: 29
5， - JOE/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQl-3， SEQ ID NO: 305， - FAM/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQl-3， SEQ ID NO: 31。一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤(1)提供上述5组引物和探针的至少一组；
(2)待测样品的处理和模板的提取；
(3)配制荧光定量PCR反应体系；
(4)用步骤(I)的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列； (5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果JOE是内标信号，用于检测上样的DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(CT值大于18);FAM是检测信号，用于检测是否存在突变位点；在内标信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于32为阳性，CT值大于35为阴性，CT值在32和35之间为弱阳性。所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其中步骤(2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。优选地，所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其中荧光定量PCR反应体系为
I X PCR缓冲液
MgCl2 2. 0 5. OmmoldNTP :0. 2 0. 8mmol各条引物0. I I. 0 u mol各条探针0. I l.Ou molTaq 酶I 2Units模板:4 6 V- I总体积:20^30 u I。优选PCR反应条件为
第一阶段94°C 5min ；
第二阶段94°C 10s,60°C 30s，40 个循环；
第二阶段40个循环时，收集FAM和JOE信号。另外，本发明还提供了一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，包括PCR反应缓冲液和上述的至少一组引物和探针。本发明经过大量试验、研究和分析成功地筛选出能够用于快速、灵敏、有效的检测EGFR基因基因突变的引物组合和探针组合，并利用这些引物和探针开发出具有这样的优点的用于检测EGFR基因基因突变的引物组合物、探针组合、试剂盒和方法。利用这些引物和探针可以检测出人7号染色体外显子18 21上常见的29种突变，包括点突变和缺失突变。这29种基因突变见下表。表I :EGFR基因常见基因突变
突变名称I基因突变I外显子I碱基变化
Ex18-ml G719A— 182156G>C
Exl8-m2~G719S— 182155G>A
Exl8-m3~ G719C— 182155G>T
Ex19-ml E746_A750del(l)— 192135—2249dell5
Exl9-m2~E746_A750del (2)— 192236—2250dell5
Exl9-m3 |L747_P753>S|l9丨2240—2257dell8


本发明提供一种用于检测EGFR基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。本发明的方法包括(1)提供引物和探针；(2)检测样本的处理和DNA提取；(3)荧光定量PCR反应体系的成分；(4)待检测的EGFR突变基因的靶序列；(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因，反应结果通过FAM和JOE的荧光强度来判断。本发明所提供的引物、探针及检测方法可同时检测EGFR基因上的29种突变，灵敏度高，特异性强，检测速度快，整个检测过程只需要60分钟。