专利名称：：能同时检测铜绿假单胞菌等6种水产病原菌的检测试剂盒的制作方法：铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均为水生动物常见的病原菌。监测养殖动物和养殖水体中这些病原菌的存在是防治相关水产动物疾病的重要措施。目前鉴定上述细菌的技术有1、细菌快速自动鉴定系统，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；2、基于核酸的检测技术，虽然具有快速、简洁和灵敏的特点，但该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；3、经典的生理生化鉴定方法，该法虽然经典、准确，但是不同的科属的鉴定指标有所区别，但基本上都是糖类发酵、酶测定、生化测定盐类利用、色素产生、动力试验等10多大类，光糖类发酵就有40多种，酶测定有20多种，因此繁琐、耗时、且要求操作人员有良好的专业素质。由于铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌六种细菌分属2大类，铜绿假单胞菌为非发酵型革兰氏阴性杆菌，假单胞菌属；嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌为发酵型革兰氏阴性杆菌，其中嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌为弧菌科细菌，迟钝爱德华氏菌为肠杆菌科细菌。按照经典的生理生化鉴定方法，如需鉴定上述六种水产病原细菌，则需分别进行鉴定，且鉴定的指标差别较大，指标多，操作很繁琐。目前还未见能简单、同时检测铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水产病原菌试剂盒的相关报道。
本发明的目的是提供一种快速、简易、能够同时检测铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水产病原菌的检测试剂盒。本发明人针对上述6种水产常见病原菌，研究分析水产常见病原菌不同生理生化特性，通过归纳分类、筛选和试验验证，选定其中的16种指标，利用这16种指标能够快速，简易的将待测菌进行分类，从而实现了本发明的目的。本发明的同时检测铜绿假单胞菌等6种水产病原菌的检测试剂盒，由下列试剂组成(1)氧化酶试纸、(2)硫化氢培养基、(3)嗜盐性鉴定试剂、(4)邻硝基酚β-D-半乳糖苷培养基(ONPG)、(5)阿拉伯糖培养基、(6)乳糖培养基、(7)蔗糖培养基、(8)葡萄糖培养基、(9)甘露糖培养基、(10)纤维二糖培养基、(11)葡萄糖氧化发酵鉴定试剂、(12)精氨酸双水解酶鉴定试剂、(13)鸟氨酸鉴定试剂、(14)赖氨酸鉴定试剂、(15)氨基酸脱羧鉴定试剂和(16)吲哚鉴定试剂。所述的氧化酶试纸是用于检查细菌中是否含有细胞色素氧化酶。所述的硫化氢培养基是用于检查细菌能否产生硫化氢，该培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨2%，牛肉膏粉0.5%，氯化钠0.3%，硫代硫酸钠0.02%，硫酸亚铁0.02%，琼脂0.6%，余量为水，PH7.4。所述的嗜盐性鉴定试剂用于检查细菌对盐类的耐受性，该培养基优选由两个培养基组成，分别为无盐胨水(0%NaCl)培养基按质量分数100%计，含有胰蛋白胨1%，余量为水，PH7.7-7.8；盐胨水(6%NaCl)培养基按质量分数100%计，含有胰蛋白胨1%，氯化钠6%，余量为水，PH7.7-7.8；所述的邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)培养基是用于检查细菌产生β-半乳糖苷酶的能力，该培养基优选配方为按质量分数100%计，含有邻硝基酚β-D-半乳糖苷0.15%,0.Olmol/LPH7.5磷酸缓冲液25%，蛋白胨0.75%，余量为水，ΡΗ7.5。所述的阿拉伯糖培养基、乳糖培养基、蔗糖培养基、葡萄糖培养基、甘露糖培养基、纤维二糖培养基，这些糖类分解培养基是用作检查细菌对糖类发酵的特性，观察被检细菌的产酸能力。阿拉伯糖培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，阿拉伯糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。乳糖培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，乳糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。蔗糖培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，蔗糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。葡萄糖培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，葡萄糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。甘露糖培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，甘露糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。纤维二糖培养基的配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，纤维二糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。所述的葡萄糖氧化发酵鉴定试剂是用于检查细菌是氧化型还是发酵型或产碱型的细菌，该鉴定试剂优选包括葡萄糖氧化发酵培养基和矿物油，所述的葡萄糖发酵培养基的配方为按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，葡萄糖1%，琼脂0.6%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4。为鉴定细菌是氧化型还是发酵型或产碱型的细菌，一般准备两瓶葡萄糖发酵培养基以及矿物油。所述的精氨酸双水解酶鉴定试剂是用于检查细菌产生精氨酸双水解酶的能力，为了鉴定精氨酸双水解酶，优选包括精氨酸双水解酶鉴定培养基和精氨酸双水解酶对照培养基。所述的精氨酸双水解酶鉴定培养基的配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨0.1%,氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.03%，酚红0.001%，L-精氨酸盐1%，余量为水，PH7.4。所述的精氨酸双水解酶对照培养基的配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨0.1%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.03%，酚红0.001%，余量为水，PH7.4。为了检查细菌产生精氨酸双水解酶的能力，所述的精氨酸双水解酶鉴定试剂包括两瓶精氨酸双水解酶鉴定培养基和两瓶精氨酸双水解酶对照培养基以及矿物油。所述的鸟氨酸鉴定试剂是用于检查细菌产生鸟氨酸水解酶的能力，该试剂的优选配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，D-葡萄糖0.05%，溴甲酚紫0.001%，甲酚红0.0005%，吡哆醛0.0005%，鸟氨酸1%，余量为水，PH6.0-6.3。为鉴定该项指标还有矿物油。所述的赖氨酸鉴定试剂是用于检查细菌产生赖氨酸水解酶的能力，该试剂的优选配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%,D-葡萄糖0.05%，溴甲酚紫0.001%，甲酚红0.0005%，吡哆醛0.0005%，赖氨酸1%，余量为水，PH6.0-6.3。为鉴定该项指标还有矿物油。所述的氨基酸脱羧鉴定试剂是用于检查细菌产生相应氨基酸脱羧酶的能力，该氨基酸脱羧鉴定试剂包括氨基酸脱羧对照培养基，该培养基的优选配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，D-葡萄糖0.05%，溴甲酚紫0.001%,甲酚红0.0005%，吡哆醛0.0005%，余量为水，PH6.0-6.3。为鉴定该项指标还有矿物油。所述的吲哚鉴定试剂是用于检查细菌能否通过胞内酶将色氨酸氧化分解，生成靛基质代谢物。该鉴定试剂包括吲哚鉴定培养基和吲哚试剂(Kovacs试剂)，该吲哚鉴定培养基的配方为按质量分数100%计，含有蛋白胨1%，氯化钠0.5%，余量为水，PH7.3-7.5。吲哚试剂(Kovacs试剂)的配方为戊醇或异戊醇150ml，对二甲基苯甲醛10g，纯浓盐酸50ml。因此本发明的同时检测铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水生动物病原菌的试剂盒优选包括鉴定瓶1-氧化酶试纸鉴定瓶2-无盐胨水培养基胰蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，PH7.7-7.8。鉴定瓶3_60g/l的盐胨水培养基胰蛋白胨10g，氯化钠60g，蒸馏水1000ml，PH7.7-7.8。鉴定瓶4-邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)培养基=ONPG0.6g，0.01mol/LPH7.5磷酸缓冲液100ml，蛋白胨(PH7.5)300ml。鉴定瓶5-硫化氢培养基蛋白胨20g，牛肉膏粉5g，氯化钠3g，硫代硫酸钠0.2g，硫酸亚铁0.2g，琼脂6g，蒸馏水1000ml,PH7.4。鉴定瓶6-阿拉伯糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，阿拉伯糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶7-乳糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，乳糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶8-蔗糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，蔗糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶9-葡萄糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml。鉴定瓶10-甘露糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，甘露糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶11-纤维二糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，纤维二糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶12，13-葡萄糖氧化发酵培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，琼脂6g，l%溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶14、16-精氨酸双水解酶鉴定培养基蛋白胨lg，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，L-精氨酸盐10g，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶15、17-精氨酸双水解酶对照培养基蛋白胨lg，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红O.Olg，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶18-鸟氨酸鉴定培养基蛋白胨5g，牛肉膏5g，D-葡萄糖0.5g，1.6%溴甲酚紫0.625ml,0.2%甲酚红2.5ml，吡哆醛0.005g，鸟氨酸10g，蒸馏水1000ml，PH6.0-6.3。鉴定瓶19-赖氨酸鉴定培养基蛋白胨5g，牛肉膏5g，D-葡萄糖0.5g，1.6%溴甲酚紫0.625ml,0.2%甲酚红2.5ml，吡哆醛0.005g，赖氨酸10g，蒸馏水1000ml，PH6.0-6.3。鉴定瓶20-氨基酸脱羧对照培养基蛋白胨5g，牛肉膏5g，D-葡萄糖0.5g，1.6%溴甲酚紫0.625ml,0.2%甲酚红2.5ml，吡哆醛0.005g，蒸馏水1000ml,PH6.0-6.3。鉴定瓶21-吲哚鉴定培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，PH7.3-7.5。试剂A-灭菌矿物油。试剂B-0.65%无菌生理盐水。试剂C-吲哚试剂(Kovacs试剂)戊醇或异戊醇150ml，对二甲基苯甲醛10g，纯浓盐酸50ml。上述各个鉴定瓶中的培养基以及试剂A、B和C中试剂组份都可以从现有产品中购买到，并可按照公知常规的方法进行配制。本发明能同时检测铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水产病原菌的检测试剂盒的鉴定细菌的使用方法是1、前期工作将待测细菌纯培养后，置于30°C士1°C培养1824h，革兰氏染色选择阴性待检菌。(纯菌于30°C士1°C培养1824h后直接进行接种检测)2、接种(在无菌条件下进行操作)用接种环挑取一小环细菌至试剂B内摇勻，制备成菌悬液，进行以下的操作(鉴定瓶1除外)鉴定瓶1:把瓶内试纸取出，用接种环挑取少许待测细菌涂抹至试纸上，1分钟内观察涂抹细菌的颜色变化。鉴定瓶2-12用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，套上胶塞(全加塞)，直立，于300C士1°C培养1824h，观察培养基的颜色变化。鉴定瓶13-20用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，除鉴定瓶14和鉴定瓶15外，其他均加入35滴试剂A覆盖培养基表面，套上胶塞(全加塞)，直立，于30°C士1°C培养1824h，观察培养基的颜色变化。鉴定瓶21:用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，套上胶塞(半加塞)，直立，于300C士1°C培养1824h，加入2滴试剂C，观察培养基的颜色变化。3、把待检菌各反应结果与细菌鉴定表(表1)对照，如果与鉴定表中的细菌结果一致，则可判断待测菌为相应的菌，因此可确定待检菌的分类位置。表1细菌鉴定表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明的能同时检测铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水产病原菌是在本发明人深入研究分析水产常见病原菌不同生理生化特性，通过归纳分类、筛选和试验验证，选定其中的16种指标，利用这16种指标能够快速，简易鉴定。待测细菌经纯培养后，24小时内就可检测出待测菌是否是上述水生动物的6种病原菌，鉴定结果灵敏、准确。本发明与现有技术的一些鉴定方法相比较具有以下优点1、本发明的试剂盒能够同时检测铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水产病原菌，而不需要像传统的生理生化鉴定方法一样，需根据不同科属的细菌选择众多的试剂(细菌不同，造成很多的试剂也不同)，造成工作量大、时间长，且不能应用统一、简单的试剂同时鉴定上述6种水生动物病原菌的缺点，应用本发明的试剂盒只需一些鉴定的鉴定试剂，就能快速、简易、准确的同时鉴定出铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌6种水产病原菌。2、本发明的试剂盒试剂构成简单、配制方法简单、使用方法也简单、且成本低，不像细菌快速自动鉴定系统和基于核酸的检测技术一样，需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员。因此本发明的试剂盒适用于水产动物常见病原菌初步检测，特适合于众多一线水产推广站的人员使用，能及时为渔农排忧解难。具体实施例方式以下是对本发明的进一步阐述，而不是对本发明的限制。一、试剂盒的配制按照下述鉴定瓶中的组份，常规方法配制各个鉴定瓶中的试剂鉴定瓶1-氧化酶试纸鉴定瓶2-无盐胨水(0%NaCl)培养基胰蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，PH7.7-7.8。鉴定瓶3_60g/l的盐胨水(6%NaCl)培养基胰蛋白胨10g，氯化钠60g，蒸馏水1000ml,PH7.7-7.8。鉴定瓶4-邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)培养基=ONPG0.6g，0.01mol/LPH7.5磷酸缓冲液100ml，蛋白胨(PH7.5)300ml。鉴定瓶5-硫化氢培养基蛋白胨20g，牛肉膏粉5g，氯化钠3g，硫代硫酸钠0.2g，硫酸亚铁0.2g，琼脂6g，蒸馏水1000ml,PH7.4。鉴定瓶6-阿拉伯糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，阿拉伯糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶7-乳糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，乳糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶8-蔗糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，蔗糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶9-葡萄糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml。鉴定瓶10-甘露糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，甘露糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶11-纤维二糖培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，纤维二糖10g，溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶12，13-葡萄糖氧化发酵培养基牛肉膏粉5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，琼脂6g，l%溴百里酚蓝水溶液3ml，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶14、16_精氨酸双水解酶鉴定培养基蛋白胨lg，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，L-精氨酸盐10g，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶15、17-精氨酸双水解酶对照培养基蛋白胨lg，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红O.Olg，蒸馏水1000ml，PH7.4。鉴定瓶18-鸟氨酸鉴定培养基蛋白胨5g，牛肉膏5g，D-葡萄糖0.5g，1.6%溴甲酚紫0.625ml,0.2%甲酚红2.5ml，吡哆醛0.005g，鸟氨酸10g，蒸馏水1000ml，PH6.0-6.3。鉴定瓶19-赖氨酸鉴定培养基蛋白胨5g，牛肉膏5g，D-葡萄糖0.5g，1.6%溴甲酚紫0.625ml,0.2%甲酚红2.5ml，吡哆醛0.005g，赖氨酸10g，蒸馏水1000ml，PH6.0-6.3。鉴定瓶20-氨基酸脱羧对照培养基蛋白胨5g，牛肉膏5g，D-葡萄糖0.5g，1.6%溴甲酚紫0.625ml,0.2%甲酚红2.5ml，吡哆醛0.005g，蒸馏水1000ml,PH6.0-6.3。鉴定瓶21-吲哚鉴定培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，PH7.3-7.5。试剂A-灭菌矿物油。试剂B-0.65%无菌生理盐水。试剂C-吲哚试剂(Kovacs试剂)戊醇或异戊醇150ml，对二甲基苯甲醛10g，纯浓盐酸50ml。将上述试剂灭菌后装瓶备用。实施例12007年9月，从广州花都某养殖场发病的罗非鱼肾脏分离细菌，取优势单菌落进行纯化培养，革兰氏染色阴性。1、接种(在无菌条件下进行操作)用接种环挑取一小环细菌至试剂B内摇勻，制备成菌悬液，进行以下的操作(鉴定瓶1除外)鉴定瓶1把瓶内试纸取出，用接种环挑取少许细菌涂抹至试纸上，1分钟内观察涂抹细菌的颜色变化。鉴定瓶2-12用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，套上胶塞(全加塞)，直立于内托的凹槽内，于30°C士1°C培养1824h，观察培养基的颜色变化。鉴定瓶13-20用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，除鉴定瓶14和鉴定瓶15外，其他均加入35滴试剂A覆盖培养基表面，套上胶塞(全加塞)，直立于内托的凹槽内，于300C士1°C培养1824h，观察培养基的颜色变化。鉴定瓶21:用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，套上胶塞(半加塞)，直立于内托的凹槽内，于30°C士1°C培养1824h，加入2滴试剂C，观察培养基的颜色变化。结果如下TSA培养基颜色变绿；用接种环挑取少许细菌涂抹至试纸上，1分钟内观察涂抹细菌呈紫红色；鉴定瓶2培养基变混浊，鉴定瓶3不混浊；鉴定瓶4培养基无色；鉴定瓶5内无黑色；鉴定瓶6-11培养基呈紫色；鉴定瓶12呈黄色，13不变色；鉴定瓶14呈红色，15为黄色；鉴定瓶18、19呈蓝绿色，20为黄色；鉴定瓶21无红色(不变色)。与细菌鉴定表(表1)对照，结果判定为铜绿假单胞菌。应用法国梅里埃ATB半自动细菌鉴定仪对细菌进行鉴定，结果也为铜绿假单胞菌，由此可见应用本发明的试剂盒对铜绿假单胞菌进行判定是可行的。实施例2:从下述来源取表2中的细菌，活化培养后。按照下述方法进行鉴定试验表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1、接种(在无菌条件下进行操作)用接种环挑取一小环细菌至试剂B内摇勻，制备成菌悬液，进行以下的操作(鉴定瓶1除外)鉴定瓶1:把瓶内试纸取出，用接种环挑取少许细菌涂抹至试纸上，1分钟内观察涂抹细菌的颜色变化。鉴定瓶2-12:用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，套上胶塞(全加塞)，直立于内托的凹槽内，于30°C士1°C培养1824h，观察培养基的颜色变化。鉴定瓶13-20:用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，除鉴定瓶14和鉴定瓶15外，其他均加入35滴试剂A覆盖培养基表面，套上胶塞(全加塞)，直立于内托的凹槽内，于300C士1°C培养1824h，观察培养基的颜色变化。鉴定瓶21:用吸管各吸取12滴菌悬液加入鉴定瓶内，套上胶塞(半加塞)，直立于内托的凹槽内，于30°C士1°C培养1824h，加入2滴试剂C，观察培养基的颜色变化。根据上述反应的结果，与鉴定表(表1)进行对照，根据对照结果进行分类，结果如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>续表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>试验用菌株，包括从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购置的标准菌株，均应用法国梅里埃ATB半自动细菌鉴定仪进行鉴定。应用本发明的试剂盒和法国梅里埃ATB半自动细菌鉴定仪对细菌进行鉴定，结果一致。因此应用本发明的试剂盒对铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌进行判定是可行的。权利要求一种能同时检测铜绿假单胞菌等6种水产病原菌的检测试剂盒，其特征在于，由下列试剂组成(1)氧化酶试纸、(2)硫化氢培养基、(3)嗜盐性鉴定试剂、(4)邻硝基酚β-D-半乳糖苷培养基、(5)阿拉伯糖培养基、(6)乳糖培养基、(7)蔗糖培养基、(8)葡萄糖培养基、(9)甘露糖培养基、(10)纤维二糖培养基、(11)葡萄糖氧化发酵鉴定试剂、(12)精氨酸双水解酶鉴定试剂、(13)鸟氨酸鉴定试剂、(14)赖氨酸鉴定试剂、(15)氨基酸脱羧鉴定试剂和(16)吲哚鉴定试剂。2.根据权利要求1所述的能同时检测铜绿假单胞菌等6种水产病原菌的检测试剂盒，其特征在于，该能同时检测铜绿假单胞菌等6种水产病原菌的检测试剂盒，具体由下列鉴定瓶组成鉴定瓶1-氧化酶试纸；鉴定瓶2-无盐胨水培养基按质量分数100%计，含有胰蛋白胨1%，余量为水，ΡΗ7.7-7.8；鉴定瓶3-60g/l的盐胨水培养基按质量分数100%计，含有胰蛋白胨1%，氯化钠6%，余量为水，PH7.7-7.8；鉴定瓶4-邻硝基酚β-D-半乳糖苷培养基按质量分数100%计，含有邻硝基酚3-0-半乳糖苷0.15%，0.0111101/1PH7.5磷酸缓冲液25%，蛋白胨0.75%，余量为水，ΡΗ7.5；鉴定瓶5-硫化氢培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨2%，牛肉膏粉0.5%，氯化钠0.3%，硫代硫酸钠0.02%，硫酸亚铁0.02%，琼脂0.6%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶6-阿拉伯糖培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，阿拉伯糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶7-乳糖培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%,磷酸氢二钾0.2%，乳糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶8-蔗糖培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，蔗糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4;鉴定瓶9-葡萄糖培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，葡萄糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶10-甘露糖培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，甘露糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶11-纤维二糖培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，纤维二糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶12，13-葡萄糖氧化发酵培养基按质量分数100%计，含有牛肉膏粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，葡萄糖1%，琼脂0.6%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶14、16_精氨酸双水解酶鉴定培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨0.1%,氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.03%，酚红0.001%，L-精氨酸盐1%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶15、17_精氨酸双水解酶对照培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨0.1%,氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.03%，酚红0.001%，余量为水，PH7.4；鉴定瓶18-鸟氨酸鉴定培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%,D-葡萄糖0.05%,溴甲酚紫0.001%,甲酚红0.0005%，吡哆醛0.0005%，鸟氨酸1%，余量为水，PH6.0-6.3；鉴定瓶19-赖氨酸鉴定培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%,D-葡萄糖0.05%,溴甲酚紫0.001%,甲酚红0.0005%，吡哆醛0.0005%，赖氨酸1%，余量为水，PH6.0-6.3；鉴定瓶20-氨基酸脱羧对照培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，D-葡萄糖0.05%，溴甲酚紫0.001%,甲酚红0.0005%，吡哆醛0.0005%，余量为水，PH6.0-6.3；鉴定瓶21-吲哚鉴定培养基按质量分数100%计，含有蛋白胨1%，氯化钠0.5%，余量为水，PH7.3-7.5；试剂A-灭菌矿物油；试剂B-0.65%无菌生理盐水；试剂C-吲哚试剂=Kovacs试剂。全文摘要本发明公开了一种快速、简易、能够同时检测铜绿假单胞菌等6种水产病原菌的检测试剂盒。它包括氧化酶试纸、硫化氢培养基、嗜盐性鉴定试剂、邻硝基酚β-D-半乳糖苷培养基、阿拉伯糖培养基、乳糖培养基、蔗糖培养基、葡萄糖培养基、甘露糖培养基、纤维二糖培养基、葡萄糖氧化发酵鉴定试剂、精氨酸双水解酶鉴定试剂、鸟氨酸鉴定试剂、赖氨酸鉴定试剂、氨基酸脱羧鉴定试剂和吲哚鉴定试剂。本发明的试剂盒试剂构成、配制方法、使用方法简单、成本低，不像细菌快速自动鉴定系统和基于核酸的检测技术一样，需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员。适用于水产动物常见病原菌初步检测，特适合一线水产推广人员使用，及时为渔农排忧解难。文档编号C12Q1/04GK101818189SQ20101015445公开日2010年9月1日申请日期2010年4月16日优先权日2010年4月16日发明者卢迈新,姜兰,彭华林,梁爱玲,王伟利,罗理,谭爱萍,赵飞,邹为民,陆小萏申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所