基于p-硝基苯丙氨酸插入法构建的骨质疏松疫苗的制作方法[0002]骨质疏松症主要是一种表现为骨量的减少、骨骼微细结构的破坏，使得骨骼的承受力和强度降低，易于发生脆性骨折一类全身性骨代谢障碍疾病，也是多种骨破坏性疾病共有的病理损害。骨质疏松发病率高，且有逐年增高趋势。骨质疏松性骨折严重影响患者的生活质量，威胁患者的生命安全，同时也带来沉重的经济负担。目前治疗骨质疏松性疾病的药物包括钙剂、维生素D3、双膦酸盐等药物，每种治疗手段都有其局限性。比如，随着双磷酸盐类药物的广泛应用，其长期使用所引起的一些副作用(下颌骨坏死、食道炎以及最近报道的食道癌病例)也不容忽视。因此，仍迫切地需要探索更加有效、安全、简便和经济的治疗手段。[0003]骨骼的强度和完整性，依赖于骨骼内骨吸收和骨形成之间的动态平衡，主要体现在对成骨细胞和破骨细胞之间数量和功能状态的精细调节。破骨细胞活动的过度增强是导致骨质疏松的主要 病理机制。0PG/RANKL-RANK信号通路(0PG:骨保护素；RANKL:破骨细胞分化因子受体配体；RANK:破骨细胞分化因子受体)是机体控制破骨细胞分化成熟和功能的关键信号通路，通过阻断这一关键信号通路，可以抑制破骨细胞的分化和破骨活性，将实现对骨吸收作用的有效控制，以及对骨质疏松症等骨吸收性疾病的治疗。抗RANKL抗体可以特异性阻断RANKL与其受体的结合，从信号转导途径的上游有效地阻断破骨分化信号的发放，实现对骨质疏松的治疗。目前由美国Amgen公司研制的人源化抗RANKL抗体(商品名denosumab)治疗骨质疏松症的II期临床已经完成，安全性和疗效都得到充分的肯定，但是人源化抗体生产的高额成本使价格问题成为其市场化的一大障碍。[0004]骨质疏松疫苗就是通过主动免疫手段，诱导机体产生针对RANKL的特异性中和抗体，实现对骨质疏松良好的治疗，同时克服或绕过工业化生产抗体的高额成本问题。目前，研制自体蛋白疫苗面临的一个共同技术挑战是如何克服机体对自体蛋白的免疫耐受。目前尚无能够克服机体对自体蛋白RANKL的免疫耐受，从而达到对骨质疏松产生治疗效果的疫苗。
[0005]为了解决中所存在的问题，本发明提供了一种基于P-硝基苯丙氨酸插入法构建的骨质疏松疫苗，可以有效地克服自体蛋白RANKL的免疫耐受，从而实现对骨质疏松的治疗。[0006]本发明采用的技术方案是:[0007](I)RANKL重组表达载体的构建。从骨髓基质细胞中提取RNA，通过RT-PCR扩增RANKL基因编码区，将胞外段克隆入表达载体，构建重组表达载体。
[0008](2)非天然氨基酸P-硝基化苯丙氨酸编码序列的定点插入/置换。通过基于PCR的体外突变技术定点将RANKL基因编码酪氨酸或苯丙氨酸的密码子置换成能被非天然氨基酸P-硝基化苯丙氨酸反密码子特异识别的琥珀突变密码子TAG。也可突变其他位点，或增加突变位点，或不同突变组合的复合突变体。
[0009](3) P-硝基化苯丙氨酸-RANKL蛋白的重组表达与纯化。在共转化表达琥珀突变抑制子tRNA (mutRNACUA)和p-硝基苯丙氨酸_tRNA合成酶的大肠杆菌内表达插入p_硝基化苯丙氨酸RANKL突变体，纯化重组蛋白。
[0010](4)动物免疫与筛选。用纯化的蛋白皮下注射免疫雌性C57BL/6小鼠，通过ELISA检测血清中抗体的产生，并测定滴度。筛选出能够产生高滴度RANKL抗体的突变蛋白。
[0011](5)基于血清中和检测及破骨细胞形成分析后的筛选。建立RANKL和RANK体外结合实验，通过竞争性结合分析检测RANKL突变体免疫小鼠的抗血清对RANKL和RANK结合的中和效应。选择能诱导小鼠产生高滴度、良好中和效应的P-硝基化苯丙氨酸RANKL突变体。大量表达和纯化重组蛋白，即可作为候选疫苗。
[0012](6)动物实验:观察P-硝基苯丙氨酸-RANKL重组蛋白对骨质疏松的防治效果，挑选证实对骨质疏松有良好治疗效果的重组蛋白，大量表达纯化，作为骨质疏松疫苗。
[0013]该方法有效突破机体对自体蛋白的免疫耐受,通过主动免疫手段,诱导机体产生针对RANKL的特异性中和抗体，实现对骨质疏松良好的防治；同时克服或绕过工业化生产抗体的高额成本问题。



[0014]图1是本发明基于P-硝基苯丙氨酸插入法构建骨质疏松疫苗的流程图
[0015]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行进一步地描述。
[0016]实施例1:p-硝基化苯丙氨酸置换型RANKL疫苗的构建与筛选
[0017](I) RANKL重组表达载体的构建
[0018]购取RANKL cDNA克隆，通过PCR扩增RANKL胞外段编码序列，将PCR产物用限制性双酶切，连入同样经过上述双酶切处理的载体(如pET28a等)，构建相应的重组表达载体(如pET28a-RANKL重组表达载体)。通过双向测序确认序列的正确性。
[0019](2) RANKL基因的定点突变(以突变编码酪氨酸的位点为例)
[0020]①RANKL蛋白的三维结构分析，确定突变/置换的酪氨酸残基。从蛋白数据库中调取RANKL的晶体结构数据，用Cn3D4.1软件对蛋白结构进行检查分析，并逐个检查蛋白序列中酪氨酸在三维结构中的位置。分析结果表明，RANKL胞外段有8个酪氨酸残基，其中Y187，Y234，Y240，Y272和Υ306 (Y为酪氨酸)暴露于球蛋白结构表面，可以作为抗原表位的候选位点。
[0021] ②定点突变:通过基于PCR的体外突变技术将上述编码酪氨酸残基的密码子序列突变成琥珀突变密码子TAG。方法参照【Chiu J，March PE, Lee R，TillettD.Site-directed,Ligase-1ndependent Mutagenesis(SLIM):a single-tube methodologyapproachinglOO % efficiency in4h.Nucleic Acids Res.2004Dec7 ;32 (21):el74.】。
a.设计突变引物。b.设立突变PCR反应:方法以Y187N02F突变为例:配制两管50μ I高保真PCR反应(含20ng pET28a-RANKL质粒)，按照下列组合添加引物:管1:20pmolY187N02F-FL+Y187N02F-RS，管 2:20pmol Y187N02F-FS+Y187N02F-RL。加入 2U 高保真 DNA聚合酶(iProof，BIORAD)，进行 PCR 扩增反应:98°C 2min —(进入循环)98°C 20s ^ 55V30s —72°C 5min(20个循环)一72°C IOmin0 (取ΙμL PCR产物进行琼脂糖电泳分析，判定扩增效果。如果产物条带特异，则进行下述实验；如果无扩增产物或条带不特异，则需要优化PCR反应，如采用热启动、改变退火温度和时间等)。退火反应:从管I和管2各取20 μ I PCR反应产物，在一个新的PCR管混合，在PCR仪上进行退火反应:98°C 5min —85°C5min — 80 °C 5min — 75 °C 5min — 70 °C 5min — 65 °C 5min — 60 °C 5min — 55 °C5min — 50°C IOmin.用PCR产物纯化试剂盒将退火反应产物纯化，Dpn I酶切8hr (去除野生型)，直接转化大肠杆菌，挑取四个克隆，提取质粒，通过序列测定进行鉴定。对正确突变克隆，再做反向测序进行确认。
[0022](3)野生型与P-硝基苯丙氨酸-RANKL蛋白的重组表达与纯化
[0023]①野生型RANKL蛋白的重组表达:将表达载体转化BL_21 (DE3)大肠杆菌。挑取单个克隆，接种至5ml含有相应抗生素的LB液体培养基，37°C震荡培养过夜，然后转接入2L含有上述三种抗生 素的2 X YT液体培养基(30g胰蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl，IL双蒸水，121°C消毒lhr)，37°C震荡培养8hr，菌液0D600为0.6-1时加入IPTG至终浓度为
0.2mM，继续培养7小时。离心收集菌体，取其中少量(约Iml菌液)用于检测蛋白的表达，其余_80°C冻存备用。
[0024]②P-硝基化苯丙氨酸mRANKL突变体的表达:将携带p_硝基化苯丙氨酸RANKL突变体的表达质粒与表达琥珀突变抑制子tRNA (mutRNACUA)和p-硝基苯丙氨酸-tRNA合成酶的质粒(mutN02PheRS)共转化BL-21 (DE3)大肠杆菌，在同时含有氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的琼脂培养基上筛选阳性转化子。挑取单个阳性克隆，接种至5ml含有相应抗生素和ImM P-硝基苯丙氨酸的培养液，37°C震荡培养IOhr后，转接入2L上述培养液，继续37°C震荡培养至0D600 = 0.5，加入0.02%阿拉伯糖，半小时后加入ImM IPTG，10-37。。持续震荡培养4-16hr。离心收集菌体，取其中少量(约Iml菌液)用于检测蛋白的表达，其余-80°C冻存备用。
[0025]③重组蛋白的纯化(野生与突变蛋白纯化方案类同):A.细胞裂解。IL菌液收集的菌体以50ml T-150(20mM Tris.HCl pH8.0，150mM氯化钠1，10%甘油)洗涤、离心沉淀后，用50ml冰冷的裂解缓冲液(20mM Tris.HCl pH8.0，150mM氯化钠，10%甘油，0.5%TritonX-100，5mMe-巯基乙醇，5mM咪唑，复合蛋白酶抑制剂(Roche))重悬，放置于冰上超声破菌(20s x5,功率200W，间隔30s)。B.亲和层析初步纯化(常压)将细胞裂解液50000g离心20min,将上清转移至新的50ml塑料离心管,加入3ml镍亲和层析基质,4°C上下颠倒旋转2hr，然后将混悬液加入5ml玻璃层析柱，利用重力除去液体。以IOml细胞裂解液洗涤柱体，再以 50ml T-400 缓冲液洗涤(20mM Tri s.HCl ρΗ8.0，600mM 氯化钠，10% glycerol，80mM咪唑)，然后以IOml含复合蛋白酶抑制剂剂的T-150缓冲液平衡。最后，以IOml洗脱缓冲液(20mM Tris.HCl pH8.0，150mM氯化钠，10%甘油，300mM咪唑，复合蛋白酶抑制剂)将蛋白洗脱，取5 μ I通过12% SDS-PAGE电泳鉴定纯度和估计产率。C.离子交换层析(FPLC)将洗脱蛋白溶液以10倍20Mm T150缓冲液稀释，同过超级上样环(Super Loop)上样至经过T150缓冲液平衡过的5mi SOURCE-Q阴离子交换柱，以T150作为基本缓冲液，氯化钠梯度洗脱(150-1000mM)，分段收集，从各个洗脱组分中取5 μ I进行12% SDS-PAGE电泳分析，确定蛋白分离纯化。D.根据蛋白经过B或C步骤纯化的具体情况设计增加后续的纯化方式。备选方案:高分辨率的Mono-Q和S ;另外B和C的先后可做不同组合。Ε.蛋白的浓缩与保存洗脱的蛋白溶液经过凝胶过滤除盐，BCA kit (Sigma)定量，冻干，_20°C保存备用。
[0026](4)确定P-硝基苯丙氨酸的置换与活性分析
[0027]将纯化的蛋白(野生型和各种突变体)进行:1) 一般的生化分析，如测定大小的变化、蛋白的稳定性；2)同时送样进行质谱分析，确定P-硝基苯丙氨酸的置换以及稳定性；3)受体结合活性分析。将野生型RANKL重组包被在ELISA用的96孔板底(10 μ g/ml溶于50mM碳酸氢钠缓冲液，pH = 8.5)，将小鼠血清用含有16ng/ml RANK-Fc重组蛋白(向国外实验室获得表达载体，本实验室表达纯化)和0.05%吐温-20的的PBS缓冲液做倍比稀释，然后加入包被有mRANKL蛋白的孔中(100 μ I/孔)，室温孵育2hr ;吸去上清，加入200 μ I含0.05%吐温-20的的PBS缓冲液洗涤3次。结合的RANK-FC用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体检测。
[0028]实施例2:ρ-硝基化苯丙氨酸-RANKL重组疫苗对骨质疏松小鼠的治疗效应
[0029]1)小鼠骨质疏松模型的制备根据相关文献，我们采用雌性C57BL/6小鼠行卵巢切除术模拟绝经后骨 质疏松症模型。
[0030]2)动物免疫与生物学效应观察:选取12周龄的雌性C57BL/6小鼠48只，随机分成四组(每组12只)，
[0031]一组:抗原免疫+卵巢切除手术
[0032]二组:抗原免疫+假手术
[0033]三组:PBS注射+卵巢切除手术
[0034]四组:PBS注射+假手术
[0035]实验动物均在25±2°C，通风良好条件下分笼饲养，配对摄食、饮水。一、二组小鼠分别在0，14，21，42和63天，靠近淋巴结附近皮下注射IOyg/只P-硝基化苯丙氨酸-RANKL重组疫苗；第二、三组注射无菌200 μ I PBS。第一次免疫后第28天，一、三组(免疫一组和对照组)施以卵巢完全切除术:用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(20mg/kg)，下腹部剪毛消毒后，剪开约Icm的正中切口，模型组行双侧卵巢结扎切除术，逐层缝合，术后肌注青霉素预防感染。假手术组除未行卵巢结扎切除外，其余步骤同模型组。术后12周测量各项指标。
[0036]3)各项骨代谢指标检测
[0037]①抗体产生与滴度(ELISA):处死动物，收集血液，分离血清，以野生型RANKL和作为抗原包被在96孔板底，用辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠IgG抗体进行ELISA实验，检测血清中抗体的产生,并测定滴度。
[0038]②钙代谢生物学指标的测定:血钙、磷测定，血中骨钙素的水平
[0039]③骨生物学参数的测定:Α.骨密度(bone mineral density, BMD)运用DPX L型(美国Lunar)双能X线骨密度检测仪，通过计算机系统软件测量每只小鼠双侧股骨的骨密度，测量数据以SPSSl1.5软件处理和分析数据；数据以x±s表示，组间比较采用t检验；B.通过立体结构/密度综合扫描，取小鼠右侧股骨，放入直径为60mm的装满PBS溶液的丙烯管内，用Micro-CT (GE Healthcare)围绕股骨分别进行纵轴旋转扫描和横切扫描(0.5度/层，共200度)，三维像素为33x33x33 μ m,依据仪器生产商提供的通用优化的阈值，对数据进行分析，获得骨结构和密度综合的评价数据，再以SPSS11.5软件处理和分析数据。
[0040]4)血清中和实验(通过竞争性结合分析检测RANKL突变体免疫小鼠的抗血清对RANKL和RANK结合的中和效应)将重组野生型mRANKL蛋白包被在ELISA用的96孔板底(10 μ g/ml溶于50mM碳酸氢钠缓冲液，pH = 8.5)，将小鼠抗血清用含有16ng/ml RANK-Fc重组蛋白(向国外实验室获得表达载体，本实验室表达纯化)和0.05%吐温-20的的PBS缓冲液做倍比稀释，然后加入包被有野生型mRANKL蛋白的孔中(100 μ I/孔)，室温孵育2hr ；吸去上清，加入200 μ I含0.05%吐温-20的的PBS缓冲液洗涤3次。结合的RANK-FC用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体检测。
[0041]5)破骨细胞形成抑制分析
[0042]根据已建立的PTHrP刺激破骨细胞细胞生成系统和M-CSF+RANKL刺激破骨细胞生成系统，在破骨细胞形成分析的基础之上加入免疫小鼠抗血清，观察小鼠抗血清对破骨细胞形成的抑制效应。
[0043]①PTHrP刺激法。取C57BL/6小鼠股骨和胫骨，用a MEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，在含10%胎牛血清和45ng/mlPTHrP+100100y I免疫小鼠血清的a MEM培养液中培养6-8天(3天更换新鲜培养液以及所有上述添加蛋白)固定细胞，用TRAP染色试剂盒(Sigma诊断试剂盒)检测酒石酸抗性酸性磷酸酶(破骨细胞标志)，显微镜下计破骨细胞数。以OPG作为阳性对照，不加免疫小鼠血清的PTHrP组为阴性对照。
[0044]②M-CSF+RANKL刺激法。取C57BL/6小鼠股骨和胫骨，用a MEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，在含10%胎牛血清和100ng/ml M-CSF的a MEM培养液中培养3天。0.02% EDTA消化收集悬浮生长的细胞，在10%胎牛血清的a MEM培养液中，每孔7.5 X 105细胞密度，加入30ng/ml M-CSF+1 μ g/ml商品化RANKL蛋白+100 μ I免疫小鼠血清，在48孔培养板内培养6-8天(3天更换新鲜培养液以及所有上述添加蛋白)。固定细胞，用TRAP染色试剂盒(Sigma诊断试剂盒)检测酒石酸抗性酸性磷酸酶(破骨细胞标志)，显微镜下计破骨细胞数。以OPG作为阳性对照，不加免疫小鼠血清的商品化RANKL组为阴性对照。
[0045]实施例3 =RANKL重组疫苗安全性的观察
[0046]主要观察P-硝基化苯丙氨酸-RANKL重组疫苗对免疫系统和体温调节功能的影响
[0047]1)全血细胞的组成:血细胞计数仪检测红、白细胞、淋巴细胞和血小板的数量/比例；流式细胞仪检测分析淋巴细胞的组成(B淋巴细胞、T淋巴细胞(⑶4+和⑶8+)有无改变)。
[0048]2)淋巴结和脾组织切片:从每个分组小鼠中抽样选取3个小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏以10%福尔马林固定，石蜡包被，切成5μπι的组织切片。脱石蜡，分别进行HE染色和用抗⑶3抗体作免疫组化染色，观察P-硝基化苯丙氨酸-RANKL重组疫苗免疫小鼠主要淋巴组织结构有无异常改变。
[0049]3)免疫功能分析:天然免疫和抗原特异性免疫反应功能的完整性(脂多糖LPS刺激，检测TNF- a，IL- 6，IL_1，和IFN- α反映天然免疫的功能；乙肝表面抗原疫苗，检测特异性抗体产生反映抗原特异性免疫反应功能。)[0050]4)测定免疫小鼠的基础体温，以及脂多糖刺激后体温(炎症引起的发热反应)，采用微型红外测温仪测定耳廓温度。
[0051]5) 停止免疫后I，3，6个月，分别用ELISA检测抗体的滴度变化。
[0052]6)其它:骨和肾组织切片，通过免疫组织化学检测有无抗原抗体
[0053]对骨质疏松具有良好防治效果、安全性好的p-硝基苯丙氨酸-RANKL重组蛋白即为所需的骨质疏松疫苗。
[0054]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。