专利名称：可超分泌的肽及其制备方法和对一种或多种其他多肽的分泌形式的平行提高的制作方法考虑到经济生存能力，生产药物相关蛋白的方法必须使生物活性产物具有尽可能高的纯度。在此广泛使用酵母进行这些相关蛋白的表达。蛋白质如胰岛素、GM-CSF(Leukine?)和蛭素(Refludan?)的生产就是基于在酵母中合成特定蛋白或其前体的基因工程方法的成功开发实例。通常，酵母能够直接显著的合成蛭素，且产量很高，当使用多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)(Weydemann等，Appl.Microbiol Biotechnol.44377-385，1995)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(Rosenfeld等，Protein Expr.Purif4，476-82，1996)时，产量达到克级。EP-A 0 324 712描述了蛭素衍生物(Refludan?)，其N-端氨基酸为亮氨酸，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株Y79中组成型表达。EP-A0 347 781描述了一个小胰岛素原(mini-proinsulin)及其在例如面包酵母中的表达。Refludan?和胰岛素是通过两个单独的表达而生产的。令人惊讶的是，我们发现通过如下方式蛭素衍生物和小胰岛素原衍生物可以从共同的前体蛋白得到将前体蛋白通过一个碱性二肽，优选Lys-Arg融合到一段可作为分泌信号被酵母识别的信号或引导序列上，并同样地，在N-端的蛭素衍生物和小胰岛素原衍生物之间引入一个能被酵母内切蛋白酶所识别的切割位点。这里，也优选碱性二肽，例如Lys-Arg。表达后，在上清液中发现延伸有Lys-Arg的蛭素衍生物和以胰岛素B链的第一个氨基酸开始的小胰岛素原衍生物。令人惊讶的是，和直接的信号-小胰岛素原表达相比，用该种方法得到的小胰岛素原产量有了显著的提高，而蛭素衍生物的产量基本保持不变。令人惊讶的是，这样对于小胰岛素原的生产，蛭素起到一种增强肽的作用。能作为增强蛋白质的肽通常相对较小且能在短期内从例如腺组织中大量的、自然的分泌出来。这种类型的肽，包括例如蛇毒或eglin C或TAP(扁虱抗凝肽)可通过极好的输出相容性进行区分。本发明也涉及这样的蛋白。另一个优点是和已经用于药物的蛭素相比，此蛭素衍生物可具有相同的或更好的药用性质。对于这种情况，从一次相同的发酵中可能生产两种或甚至更多种的药物。这样，所需发酵容量就减少了。这直接对生产成本有利。然而，是否生产多种产品是可选择的。例如，对Refludan的需求量比胰岛素的小，这可导致将其中一种药学上感兴趣的物质丢弃的方法。为了提高产量，就像专利申请EP-A 0 200 655中所建议的那样，可以通过Lys-Arg在蛭素衍生物N-端前放置一短肽序列作为信号或引导序列的衔接物。对于本领域技术人员来说，很明显信号或引导序列的选择也直接影响感兴趣蛋白质的产量。这个序列的选择是进一步优化的主题。位于表达盒3’末端的序列也通过影响mRNA的稳定性而直接影响产量。这里，对本领域技术人员来说也很明显的是，可以针对每个待表达的感兴趣蛋白质优化上述序列。对于合适启动子的选择，这也是正确的，所述启动子可以具诱导活性或组成型活性。载体系统和宿主系统的选择对产量也同样重要。这样，除了已经举例利用的面包酵母外，也可使用酵母菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)或乳克鲁维酵母(K.lactis)以及载体或表达盒(在每种情况下其都针对不同的生理状况进行了优化)。允许分泌到培养基中的方法的另一个优点是感兴趣蛋白质的蛋白质-化学后处理较简单。令人惊讶的是，我们发现通过膜过滤，可在蛭素存在时将小胰岛素原浓缩，所用膜的排阻限是分子量大于10kDa的分子。这些分子被发现几乎都在存留物(retentate)中。对于本领域技术人员来说，很明显开发新的分离技术和新的方法步骤的组合总是可能达到对纯化过程的改进。这直接对产量并因此对生产成本有利。本发明因此涉及下面形式的DNA分子(可替代的术语表达盒)Px-Sx-Bn-(ZR)-转运肽-(Z1Z2)-蛋白(Y)-(Z1Z2)-蛋白(Ym)-T；其中表达盒编码转运肽，该转运肽通过序列Z1Z2和第二蛋白相连，该蛋白又通过Z1Z2和蛋白Y1相连，Y1或者和Y相对应或者和Y不同，且转运肽提高了Y和/或Ym的分泌速率，其中Px是以可得到感兴趣蛋白的最优产量的方式选择的任何启动子DNA序列；Sx是可允许得到最优产量的任何信号或引导序列的相应编码DNA；Bn是1-15个可遗传编码的氨基酸或是化学键；Z是选自Lys和Arg的氨基酸的密码子；Z1是选自Lys和Arg的氨基酸的密码子；Z2是选自Lys和Arg的氨基酸的密码子；R是Arg密码子；转运肽是编码能有效运输并能够穿过细胞膜的肽例如蛭素或蛭素衍生物的DNA序列；蛋白Y是编码能够被酵母菌生产和分泌的任何蛋白的DNA序列；蛋白Ym是编码能够被酵母菌生产和分泌的任何蛋白的DNA序列(m＝1-5)或者是化学键(m＝0)；T是对表达有利的非翻译DNA序列。本发明的另一个实施方案是上述任何一个DNA分子所编码的融合蛋白。
本发明的另一个实施方案是含有上述DNA分子的多拷贝载体和质粒。
本发明的另一个实施方案是宿主细胞，其含有作为宿主细胞染色体的一部分、作为微型染色体的一部分或以染色体外方式存在的上述DNA分子或上述多拷贝载体或质粒，其中所述宿主细胞优选是酵母细胞，特别是选自酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳克鲁维酵母、多形汉逊氏酵母和巴斯德毕赤酵母的酵母细胞。
本发明的另一个实施方案是上述蛋白的发酵方法，其中
(a)使上述DNA分子、多拷贝载体或质粒在上述宿主细胞中表达且(b)从细胞培养物的上清液中分离表达的蛋白，其中特别是在发酵完成后，将pH调节到2.5-3.5以便使不需要的蛋白质沉淀，然后将所表达的蛋白从沉淀物的上清液中分离出来。
本发明的另一个实施方案是上述方法，其中在将发酵上清液与宿主细胞分开后，将宿主细胞重新在新鲜培养基中培养，并将所释放的融合蛋白从每次培养得到的上清液中分离出来。
本发明的另一个实施方案是上述方法，其中用于沉淀后浓缩上清液中的表达蛋白的步骤选自微量过滤、疏水作用层析和离子交换层析。
本发明的另一个实施方案是制备胰岛素的方法，其中(a)使胰岛素原在上述方法中作为上述表达盒的蛋白质(Y)表达；(b)分离步骤(a)的胰岛素原并用胰蛋白酶和羧肽酶B处理；且(c)将胰岛素从步骤(b)的反应混合物中分离出来，特别地，其中的转运肽是蛭素或蛭素衍生物，在步骤(a)或(b)后其被破坏或其生物活性丧失。
本发明的另一个实施方案是一种蛋白，它是在C-末端有两个碱性氨基酸残基的蛭素衍生物。
蛭类(Hirudo)中的水蛭已经形成了例如各种凝血酶抑制剂蛭素同工型。已经通过人工改造如改变N-末端的氨基酸对蛭素进行了优化以符合制药要求(例如EP 0 324 712)。本发明包括蛭素和蛭素变体的使用。本发明特定的实施方案使用一种天然蛭素同工型(所有这些天然同工型总称作“蛭素”)。天然同工型有，例如Val-Val-蛭素或Ile-Thr-蛭素。本发明的其他实施方案使用天然蛭素同工型的变体。变体来自天然蛭素同工型但含有，例如，和天然同工型相比，额外的氨基酸和/或氨基酸缺失和/或氨基酸改变。蛭素变体可以含有交替的天然蛭素同工型肽片断和新的氨基酸。蛭素变体是已知的并在例如DE 3 430 556中描述。蛭素变体可通过商业途径以蛋白质的形式得到(Calbiochem Biochemicals，cat.no.377-853，-950，-960)。术语“蛭素衍生物”指和天然蛭素至少40％同源的序列。
表达盒优选导入酵母菌如酿酒酵母，乳克鲁维酵母，多形汉逊氏酵母或巴斯德毕赤酵母中。上述表达盒可以以一个或多个拷贝稳定整合到特定酵母基因组中或可以存在于染色体外的多拷贝载体中。对于本领域技术人员，很明显该技术也可应用于其他系统如动物细胞培养物和植物细胞。这也是本发明的一个主题。
下面所述的表达系统用作例子。对于本领域技术人员，很明显的是为了将表达盒导入上述所选的系统中，必须依据所选宿主系统的类型，制作合适的重组DNA构建体。因此，可根据所选的宿主/载体系统优化工业发酵。因此，下面的实施例并非限定性的。
实施例1构建编码蛭素(Refludan)-Lys-Arg-小胰岛素原的酵母表达质粒起始材料为质粒pK152(PCT/EP00/08537)、pSW3(EP-A 0 347 781)和编码牛白介素2的重组酵母质粒衍生物(Price等Gene 55，1987)。此酵母质粒可通过它在酵母ADH2启动子控制下带有α因子引导序列这一事实来分辨。该序列后面通过一KpnI限制酶识别位点连接牛白介素2 cDNA序列，该cDNA序列在操作后在非翻译3’末端含有一个NcoI限制酶识别位点，该位点在载体中是独一无二的。这样，可容易的通过KpnI/NcoI切割将此cDNA序列从质粒中除去。由于报道的表达产量不错，可认为剩余的3’白介素2序列(像T)具有使mRNA稳定的作用，不需要被删除或被酵母终止序列所代替。质粒pK 152带有编码Leu-蛭素(Refludan)的DNA序列，质粒pSW3带有编码小胰岛素原的DNA序列。编码蛭素-LysArg-小胰岛素原的基因序列首先通过PCR技术制备。为此，用ExpediteTmDNA合成系统制备4个引物。
i.hir_insfkr(SEQ ID NO1，编码的蛋白片断SEQ ID NO2)I P E E Y L Q K R F V N Q H L C5′-ATCCCTGAGGAATACCTTCAGAAGCGATTTGTTAACCAACACTTGTGTGG-3′59 60 61 62 63 64 65 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7ii.hir_insrevkr(SEQ ID NO3)5′-CCTCACAAGTG TTGGTTAACA AATCGCTTCT GAAGGTATTC CTCAGGGAT-3′iii.hirf1(SEQ ID NO4，编码的蛋白片断SEQ ID NO5)L T Y T D C5′-TTTTTTTGGATCCTTTGGATAAAAGACTTACGTATACTGACTGCACiv.insncolrev(SEQ ID NO6)5′-TTTTTTCCAT GGGTCGACTATCAG引物hir_insfkr描述了蛭素末端氨基酸(59-65)密码子和胰岛素序列B1-B7之间通过Lys-Arg衔接物进行的连接。引物hir_insrevkr是其100％互补物。引物hirf1编码延伸到KpnI切割位点的蛭素基因起始部分(见EP-A 0 324 712中的描述)。
引物insncolrev显示根据EP-A 0 347 781的合成小胰岛素原的3’端。用引物对hirf1/hir_insrevkr及作为模板的质粒pK 152的DNA和引物对hir_insfkr/insncolrev及作为模板的质粒pSW3的DNA进行两个标准的聚合酶链式反应。反应在100μl PCR缓冲液中进行，在每种情况下缓冲液中含有200nmol引物，1μl聚合酶和100ng载体。步骤1是在95℃孵育2分钟。然后接着进行25轮每一轮为95℃30秒，55℃30秒和72℃30秒的循环。最后一次循环后在72℃孵育3分钟，然后停止反应。
由于引物hir_insrevkr和hir_insfkr 100％的互补，两个DNA产物根据上述序列相重叠，以致在第三个反应中，使用前两个反应的产物作为模板并使用引物hirf1和insncolrev所生成的DNA片断编码由Lys-Arg分开的蛭素和小胰岛素原。PCR片断用酶KpnI和NcoI消化后用T4连接酶反应将其插入用Kpn1/NcoI切开的pαADH2载体中。和EP-A 0 347 781的实施例7相似，用连接混合物转化感受态大肠杆菌菌株MM294。然后从两个克隆中分离质粒DNA并通过DNA序列分析表征。确定了插入的DNA序列后，根据所述实施例，将质粒DNA制备物用于转化面包酵母菌株Y79细胞。然而，和所述实施例不同，当使用pαADH2载体时，导入载体后进行trp1-1突变互补的选择。对于另一个对照，从酵母转化体中重新分离质粒DNA并通过限制性分析手段进行分析。构建的表达载体表示为pADH2Hir_KR_Ins。根据实施例4进行表达。
实施例2编码蛭素(Refludan)-Lys-Arg-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链的酵母表达质粒的构建专利申请EP-A 0 195 691描述的胰岛素原衍生物可以含有二肽XY，其中X和Y每一个各对应于Lys或Arg，该二肽作为胰岛素B和A链的衔接物。下面的实施例描述了用于这种胰岛素原衍生物的表达载体的制备方法。例如，选择编码B链-Lys-Arg-A链形式的胰岛素原衍生物的DNA序列并据此进行合成。
根据实施例1进行基因片断的合成。所用寡核苷酸序列为hirf1和insncolrev。寡核苷酸B_KR_Af1和B_KR_Arev1从头合成。
B_KR_Af1的序列为(SEQ ID NO7)5′CTTCTACACTCCAAAGACGAAACGCGGTATCG-3′B_KR_Arev1的序列为(SEQ ID NO8)5′CAACATTGTTCAACGATACCGCGTTTCGTCTTT-3′
两个引物中用黑体表示的部分显示了部分重叠的序列。除了6个带下划线的核苷酸外，两个引物都和EP-A 0 347 781中的小胰岛素原序列精确配对。带下划线的部分和Lys及Arg密码子对应。根据实施例1构建的质粒pADH2Hir_KR_Ins的DNA在PCR中用作模板。
如实施例1中所描述的，用引物对hirf1/B_KR_Arev和insncolrev/B_KR_Af1进行两个聚合酶链式反应。每个反应中的模板都是实施例1中构建的质粒pADH2Hir_KR_Ins DNA。在第三PCR中，引物对为hirf1和insncol，前两个反应的产物作为模板。第三PCR的反应产物用NcoI/Sall切割并插入到打开的pαADH2载体中。序列和限制性分析后，将正确的质粒称为pADHHirKR_B_KR_A。
实施例3编码蛭素-Lys-Arg-猿胰岛素原的酵母质粒的构建专利申请EP-A 489 780描述了一个质粒pINT90d，它含有猿胰岛素原的cDNA(Wetekam等，Gene 19，p.179-183，1982)。所述质粒和质粒pK152的DNA用作模板。使用实施例1中描述的引物hirf1，并合成另外三个引物。
引物insncorev与克隆在pINT90d中的胰岛素基因的3’区反向结合，其序列为5′-TTTTTTCCATGGTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3′(SEQ ID NO9)有下划线的序列表示限制性内切酶NcoI的识别位点。
引物hir_insfkr序列为5′-ATCCCTGAGG AATACCTTCA GAAGCGATTT GTGAACCAGC ACCTGTGCGG C-3′(SEQ ID NO10)这里用黑体所示的核苷酸表示蛭素和胰岛素原之间的Lys-Arg衔接物。
引物hir_insrevkr和引物hir_inskr完全互补，其序列为5′-GCCGCACAGG TGCTGGTTCA CAAATCGCTT CTGAAGGTAT TCCTCAGGGA T-3′(SEQ ID NO11)类似于实施例1，进行两个聚合酶链式反应。引物对hirf1/hir_insrevkr和质粒pK152 DNA反应，引物对hir_insfkr/insncorev和质粒pINT90d DNA反应。如实施例1所描述的，两个反应的产物用作第三PCR的模板，引物对为hirf1/insncorev。本反应的DNA产物包括蛭素-Lys-Arg-胰岛素原的序列。之后将其用酶NcoI和KpnI切割，并类似于实施例1，将其插入质粒pαADH2中。由此可以构建任何天然胰岛素原衍生物的表达载体。
实施例4重组产物的表达将表达分为两个阶段。首先，在酵母基本培养基中进行预培养。每升培养基中含有下面的成分6.7g -酵母氮源(yeast nitrogen base)(无氨基酸)5.0g -酪蛋白氨基酸(无维生素)0.008％-腺嘌呤0.008％-尿嘧啶2％-葡萄糖主要培养基或表达培养基用预培养物试样接种。
主要培养基每升含有10g-酵母抽提物20g-蛋白胨0.008％-腺嘌呤0.008％-尿嘧啶4％-葡萄糖使用上述培养基在摇瓶中用下面的方法进行表达将过夜培养的预培养物0.3ml用80ml预热的培养基稀释并在30℃剧烈摇动下孵育约24小时。在每种情况下，测定光密度后将用这种方法所产生的1毫升培养物离心，除去细胞后，将上清液冻干并通过SDS-PAGE进行分析。具生物活性的蛭素的含量通过凝血酶抑制分析进行测定。
一个备选的发酵方案用于通过过滤或小心离心而移出的细胞。在从培养基中分离感兴趣蛋白的同时，将移出的细胞放入含有醇和不超过0.5％的葡萄糖作为碳源的新鲜预热主要培养基中，这样发酵可以继续进行而不中断。这一步可以重复多达5次。
实施例5凝血酶抑制试验按照Grieβbach等的方法测定蛭素的浓度(Thrombosis Research 37，pp.347-350，1985)。为此，在测定时包括特定量的Refludan标准以建立校准曲线，以mg/l表示的产量可直接由该曲线确定。
实施例6巴斯德毕赤酵母系统中蛭素-Lys-Arg-小胰岛素原融合蛋白的克隆和表达Invitrogen?出售用巴斯德毕赤酵母作为宿主系统制备重组蛋白的克隆和表达试剂盒。为此，提供了关于制备和随后表达巴斯德毕赤酵母系统以生产所需重组蛋白的详细技术方案，因此在使用所述方案时，只需对编码所需蛋白的表达载体的构建进行描述即可。使用了EasySelectTMPichia表达试剂盒(目录号K1740-01)。
pPICZαA载体是试剂盒的一部分。通过限制性酶XhoI和SacII将载体打开使得可以与实施例1类似地将感兴趣蛋白添加到α因子引导序列上并检测蛋白分泌到上清液中的情况。克隆需要两个引物。引物pichia_H_If1(SEQ ID NO12)序列为5′-TTTTTTTCTCGAGAAAAGA CTTACGTATACTGAC-3′XhoI Hir1Hir2等引物pichia_H_Irev2(SEQ ID NO13)序列为5′-TTTTTGGCGCCGAATTCACTATTAGTTACAGTAGTTTTCC-3′SacII EcoRI A21所用模板是质粒pADH2Hir_KR_Ins的DNA。用这两个引物进行标准PCR，所得DNA产物含有被XhoI和SacII整合位点延长的蛭素-Lys-Arg-小胰岛素原序列。适当地切割DNA产物及分离片断后，所述片断可以通过T4 DNA连接酶反应插入到打开的载体DNA中。和厂家方案稍有不同，实施例1中所描述的大肠杆菌株MM294通过连接混合物转化，重组菌落通过zeocine选择平板进行筛选。从克隆中重新分离质粒DNA，然后通过限制性和DNA序列分析进行鉴定。按照厂家的方案，用以此方式构建的质粒制备用于生产所述肽的巴斯德毕赤酵母表达克隆。
实施例7小胰岛素原和蛭素的纯化纯化需要在早期分离这两个蛋白质。表达完成后，通过分析性RP-HPLC对培养基进行分析。和大多数其他因为酵母细胞的自发溶解或者分泌而在上清液中出现的多肽不同，这两个蛋白，蛭素和小胰岛素原在pH2.5-3时并不发生沉淀。因此将培养基适度酸化，然后在沉淀完成后通过离心除去沉淀物和细胞。离心后，调节培养基到pH3.5-7，通过疏水作用层析，例如通过利用装有Diaion HP20?材料的层析柱将蛭素和小胰岛素原这两个级分互相分开。然后可根据EP-A 0 549 915将蛭素从含蛭素的级分中分离出来，根据EP-A 0 347 781将胰岛素从含小胰岛素原的级分中分离出来。
实施例8从小胰岛素原制备胰岛素在表达期结束时，将培养基调节至pH6.8，搅拌下加入胰蛋白酶使其终浓度为4-8mg/l孵育约4小时后，将用这种方法处理的发酵培养液调节至pH2.5-3。沉淀1-6小时后，除去沉淀物。然后通过离子交换层析，例如通过在含有50mM乳酸和30％异丙醇的缓冲液(pH3.5)中在S-Sepharose?上进行层析，分离所形成的单-Arg-胰岛素。洗脱使用的NaCl梯度为0.05-0.5M。将含有产物的级分用水进行1∶1稀释后加入ZnCl2以形成0.1％强度的ZnCl2溶液。单-Arg-胰岛素在pH6.8沉淀，然后例如可以根据EP-A 0 324 712将其转化为胰岛素。
实施例9过滤后从小胰岛素原制备胰岛素在表达期结束时，通过在pH2.5到3沉淀，移出细胞和上清液组分。然后用排阻限为10kDa的膜进行过滤以浓缩培养基。和蛭素衍生物相似，小-胰岛素原大量出现在存留物中，然后可根据实施例8将其加工成胰岛素。
序列表序列表<110>安万特医药德国有限公司<120>可超分泌的肽及其制备方法和对一种或多种其他多肽的分泌形式的平行提高<130>DEAV2001/0007<140>10108100.6<141>2001-02-20<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述hir_insfkr<400>1atccctgagg aataccttca gaagcgattt gttaaccaac acttgtgtgg50<210>2<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述蛋白hir_insfkr<400>2Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys1 5 10 15<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列
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本发明涉及形式为P