基于光敏感基因的细胞分泌物生产系统和方法

卢恬, 张奕, 王立平

2012年6月27日

2011年12月27日

中国科学院深圳先进技术研究院

C12M1/36GK102517195SQ20111044555

分泌物 基因 敏感 基于 细胞 生产

1.一种细胞分泌物生产系统，其特征在于，包括生物反应器、光源和控制装置，所述生物反应器用于收容表达光敏感基因的分泌细胞，所述光源用于对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激，所述控制装置与所述光源相连控制所述光源发光2.根据权利要求1所述的细胞分泌物生产系统，其特征在于，所述光源耦合于所述生物反应器上3.根据权利要求1或2所述的细胞分泌物生产系统，其特征在于，所述光源为LED灯阵列，所述生物反应器包括一层将细胞培养基与LED灯阵列隔离开的透光材料4.根据权利要求1所述的细胞分泌物生产系统，其特征在于，所述控制装置包括捕获所述分泌细胞电位变化信息的记录微电极，所述控制装置根据所述电位变化信息控制所述光源发光5.根据权利要求4所述的细胞分泌物生产系统，其特征在于，所述控制装置还包括处理器、控制所述光源发光强度的功率控制器及控制所述光源发光频率的脉冲控制器，所述处理器与所述记录微电极、功率控制器及脉冲控制器相连，所述功率控制器及脉冲控制器与所述光源相连，所述处理器根据所述电位变化信息通过所述功率控制器及脉冲控制器控制所述光源的发光频率和强度6.一种细胞分泌物生产方法，其特征在于，包括如下步骤将光敏感基因导入分泌细胞中；将表达光敏感基因的分泌细胞置于生物反应器中；对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激，使光敏感通道蛋白开放，细胞去极化， 促进所述分泌细胞分泌生物活性物质7.根据权利要求6所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，采用病毒载体、物理方法或化学方法将所述光敏感基因导入分泌细胞中8.根据权利要求7所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，所述病毒载体采用慢病毒载体9.根据权利要求6所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，所述分泌细胞为基因工程细胞或骨髓瘤细胞10.根据权利要求9所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，编码光敏感基因或其功能片段的多核苷酸序列可操作地连接一个细胞特异的启动子，从而靶向性的在基因工程细胞或骨髓瘤细胞中表达，使非光敏感细胞转变为光敏感细胞，在光照刺激下将光信号转变为电信号11.根据权利要求10所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，编码的光敏感基因或其功能片段的多核苷酸序列可操作地连接抗性基因和各种标签12.根据权利要求6所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，所述光敏感基因为编码兴奋型通道蛋白ChR2的基因、ChR2-310、Chop2或者Chop2_310蛋白的基因13.根据权利要求6所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，所述生物反应器为转基因动物生物反应器14.根据权利要求6所述的细胞分泌物生产方法，其特征在于，所述对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激的步骤包括如下步骤检测分泌细胞电位变化信息；根据所述电位变化信息控制光照刺激的强度和频率

本发明涉及生物技术，尤其是涉及一种细胞分泌物生产系统和方法背景技术细胞分泌活动是生物体信息传递和实现细胞功能的基本过程之一，涉及一系列复杂的分子活动和信号传导过程，分泌的物质包括各种激素、细胞因子、酶类、神经递质、血清蛋白、抗体以及细胞外基质成分等等许多疾病的发生与细胞分泌产物含量异常密切相关， 如胰岛素缺乏或相对缺乏导致糖尿病，俗称呆小病的先天性甲状腺功能减低症是由甲状腺激素分泌不足引起的因此许多疾病都通过增补一种或多种分泌物质来进行治疗目前临床上使用的许多细胞分泌物如激素、细胞因子、酶类和抗体等药物都是通过基因工程技术生产的应用基因工程技术研制和开发的药物称为基因工程药物生产基因工程药物的基本方法是将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞(微生物如大肠杆菌、酵母，哺乳动物细胞或人体组织靶细胞)，使目的基因在靶细胞中得到表达，通过发酵或细胞繁殖来生产出足够量多肽或蛋白质，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗；若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达， 就成为基因治疗据估计，大约有2000种药物是用基因工程技术生产的，其中包括蛋白质药物和非蛋白质药物基因工程药物产业发展很快，如美国目前每年投入到基因工程药物的研究经费不少于100亿美元截止2005年，美国已批准了 120多种基因工程药物上市， 还有近400种处于临床研究阶段，约3000种处于临床前研究阶段，基因工程药物的产值和销售额已超过200亿美元抗体对于宿主属于体液免疫的效应分子，行使多种重要功能识别并特异性结合抗原是抗体分子的主要功能，许多生物学技术正是基于抗体的特异识别功能，利用抗体来鉴定特异蛋白因此针对各种抗原分子的抗体的生产需求强烈抗体的生产除了上述基因工程抗体外，还有多克隆抗体和单克隆抗体单克隆抗体具有特异性高、亲和力强、效价高、 血清交叉反应少的优点，应用于临床的抗肿瘤、抗感染、解毒、抗器官移植排斥反应等一般用杂交瘤(hybridoma)的鼠生产，所以称为鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体是用动物鼠来生产的，先制备鼠杂交瘤细胞系，然后在体内或体外生产抗体杂交瘤细胞系的制备工艺包括免疫动物、亲本细胞的制备、细胞融合、培养筛选与鉴定、克隆化等过程单克隆抗体药物具有药效精确可控、副作用小的优点，可应用于癌症、关节炎、免疫系统疾病等治疗，是制药行业的发展热点单克隆抗体药物被称为最有前途的抗癌药，美国已批准上市了二十余种单克隆抗体抗癌药传统的细胞分泌物生产方法中，产量不高，导致单位产品的成本较高发明内容有鉴于此，有必要提供一种提高产量的细胞分泌物生产系统此外，还有必要提供一种提高产量的细胞分泌物生产方法一种细胞分泌物生产系统，包括生物反应器、光源和控制装置，所述生物反应器用于收容表达光敏感基因的分泌细胞，所述光源用于对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激，所述控制装置与所述光源相连控制所述光源发光在优选的实施例中，所述光源耦合于所述生物反应器上在优选的实施例中，所述光源为LED灯阵列，所述生物反应器包括一层将细胞培养基与LED灯阵列隔离开的透光材料在优选的实施例中，所述控制装置包括捕获所述分泌细胞电位变化信息的记录微电极，所述控制装置根据所述电位变化信息控制所述光源发光在优选的实施例中，所述控制装置还包括处理器、控制所述光源发光强度的功率控制器及控制所述光源发光频率的脉冲控制器，所述处理器与所述记录微电极、功率控制器及脉冲控制器相连，所述功率控制器及脉冲控制器与所述光源相连，所述处理器根据所述电位变化信息通过所述功率控制器及脉冲控制器控制所述光源的发光频率和强度一种细胞分泌物生产方法，包括如下步骤将光敏感基因导入分泌细胞中；将表达光敏感基因的分泌细胞置于生物反应器中；对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激，使光敏感通道蛋白开放，细胞去极化，促进所述分泌细胞分泌生物活性物质在优选的实施例中，采用病毒载体、物理方法或化学方法将所述光敏感基因导入分泌细胞中在优选的实施例中，所述病毒载体采用慢病毒载体在优选的实施例中，所述分泌细胞为基因工程细胞或骨髓瘤细胞在优选的实施例中，编码光敏感基因或其功能片段的多核苷酸序列可操作地连接一个细胞特异的启动子，从而靶向性的在基因工程细胞或骨髓瘤细胞中表达，使非光敏感细胞转变为光敏感细胞，在光照刺激下将光信号转变为电信号在优选的实施例中，编码的光敏感基因或其功能片段的多核苷酸序列可操作地连接抗性基因和各种标签在优选的实施例中，所述光敏感基因为编码兴奋型通道蛋白ChR2的基因、 ChR2-310、Chop2 或者 Chop2_310 蛋白的基因在优选的实施例中，所述生物反应器为转基因动物生物反应器在优选的实施例中，所述对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激的步骤包括如下步骤检测分泌细胞电位变化信息；根据所述电位变化信息控制光照刺激的强度和频率上述细胞分泌物生产系统和方法中，利用光照刺激，促进分泌细胞去极化，进而引起Ca2+内流，增强细胞分泌功能，从而增加基因工程药物和单克隆抗体的产量

许多分泌现象都与细胞去极化密切相关，多数是由于去极化引起电压门控Ca2+通道开放，Ca2+内流引起细胞分泌的如神经兴奋引起腮腺和肾上腺髓质细胞分泌，血浆中的葡萄糖促进胰岛细胞的分泌都是通过细胞膜的去极化，让钙离子进入细胞而引起的有人认为激素引起分泌也通过钙离子起作用细胞膜与分泌泡膜的融合也与钙离子引起脂双层的相变有关有人认为一定浓度的钙离子(10_2 I(T1M)使液态脂双层中的局部地区产生结晶态，在这过程中，它一面放出热量，一面引起膜结构的不连续性，形成一个不稳定的透性很高的区域，从而有利于相似的脂膜相互融合在分泌泡膜和细胞膜融合处，分泌泡膜中和细胞膜中的蛋白质颗粒必须从接触处移开，以便这两种膜中的脂类相互融合光敏感型通道蛋白(Charmelrhodopsin-2，ChR2)是一种微生物的视紫红质蛋白， 对470nm左右的蓝光敏感，而自然界中蓝光的强度还不足以激发表达ChR2基因细胞的活性蓝光G70nm左右波长)可激活ChR2通道，使Na+、Ca2+(少量)等阳离子进入细胞内而兴奋细胞利用光敏感型通道蛋白ChR2，将其导入分泌细胞(如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞等基因工程细胞，或骨髓瘤细胞)，使这些分泌细胞表达ChR2再使用光照刺激分泌细胞，促进生物活性物质的分泌，提高产量，降低成本如图1所示，其为一种细胞分泌物生产系统，包括生物反应器100、光源200和控制装置300生物反应器100用于收容表达光敏感基因(例如ChR2、ChR2-310、Chop2或者 Chop2-310等蛋白的基因)的分泌细胞，光源200用于对生物反应器100内的分泌细胞实施光照刺激，控制装置300与光源200相连控制光源200发光通过光照刺激分泌细胞，促进细胞因子、激素、酶类、抗体等生物活性物质的分泌，提高产量，降低成本根据生物反应器100结构特征，生物反应器100可分成釜式、管式、塔式、膜式等类型生物反应器100具体可以为塑料袋增殖器、机械搅拌发酵罐、转瓶培养器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器或气升式反应器机械搅拌发酵罐是好氧生物反应器的典型代表，其主要组成部分有壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、 测量系统和附属系统等采用流加或灌注培养方式如图2所示，在优选的实施方式中，将光源200耦合于生物反应器100上，耦合方式为将光源200在生物反应器100的周壁固定生物反应器100包括基体110和透光材料 120光源200优选为冷光源，以尽量减少光源200产热对生物反应器100中分泌细胞的影响光源200设置于基体110上，透光材料120将细胞培养基与光源200隔离开，可以避免细胞培养液对LED灯电路的影响，满足无菌培养的要求的同时进一步减少光源200产热对生物反应器100中分泌细胞的影响本实施方式中光源200采用LED灯阵列，LED为中心波长为470nm带宽的蓝光单色光源为减少产热，LED灯的功率应尽量低，以能引起细胞去极化为准对于体积较大的生物反应器以及非搅拌式生物反应器，为使尽可能多的分泌细胞能接受光照，可在反应器周壁安装多个LED灯阵列如图3所示，控制装置300包括记录微电极310、处理器320、控制光源200发光强度的功率控制器330及控制光源200发光频率的脉冲控制器340记录微电极310捕获分泌细胞的电位变化信息，控制装置300根据该电位变化信息控制光源200发光具体地，处理器320与记录微电极310、功率控制器330及脉冲控制器340相连，功率控制器330及脉冲控制器340与光源200相连，处理器320根据记录微电极310捕获的电位变化信息通过功率控制器330及脉冲控制器340控制光源200的发光频率和强度另外，处理器320还可与光源200的电源相连，控制电源的通断来开启或关闭光源；或者处理器320与外部程控器或者计算机相连，接收外部程控器或计算机的指令输入控制光源200发光外部程控器可以通过无线方式将程序输入到处理器320，处理器320 可以分别控制的电源开关、功率控制器330和脉冲控制器340，从而可以任意调节激光的强度、重复频率、脉冲个数及相对时间关系上述细胞分泌物生产系统中，激光通过耦合于生物反应器100的LED灯阵列施加于分泌细胞，通过促进分泌细胞去极化达到促进生物活性物质分泌的目的记录微电极310 位于生物反应器100中，与细胞培养液相接触记录微电极310能将捕获的细胞电位变化信息或蛋白质浓度等信息传递给处理器320，由处理器320调节激光产生参数，从而实现自动反馈调节激光频率和强度等这种电位变化的信息也可通过无线传入到外部计算机，通过配套软件进行测试分析此外，还提供了一种细胞分泌物生产方法，如图4所示，该方法包括如下步骤步骤S410，将光敏感基因导入分泌细胞中光敏感基因是一种视紫红质基因，其中一种是来源于藻类的 ChR2 (Channelrhodopsin-2) 0光敏感基因可以是编码兴奋型通道蛋白ChR2的基因或其他形式蛋白的基因(如ChR2-310或者Chop2或者Chop2-310)光敏感基因或其功能片段被表达在细胞膜表面后，在特定波长的光的刺激下，可以引起光敏感通道蛋白的开放，引起离子的通透性增加以及膜电位的改变光敏感基因或其功能片段可以表达在基因工程细胞或骨髓瘤细胞等分泌细胞中，例如大肠杆菌、酵母菌、CHO细胞系、NSO细胞系、SP2细胞系等在本发明的某些方案中，编码光敏感基因或其功能片段的多核苷酸序列可操作地连接一个细胞特异的启动子，从而靶向性的在特定基因工程细胞或骨髓瘤细胞中表达，使非光敏感细胞转变为光敏感细胞，在光照刺激下将光信号转变为电信号在本发明的某些方案中，编码的光敏感基因或其功能片段的多核苷酸序列可操作地连接抗性基因(如新霉素抗性基因、neo基因)和各种标签(如HA、myC、HiS、Flag等)， 以利于稳定细胞株的筛选和表达产物的分离纯化可以采用病毒载体、物理方法或化学方法将光敏感基因或其功能片段编码序列导入分泌细胞中，并筛选出稳定表达光敏感基因的细胞株用于药物生产可选用各种病毒载体和质粒等作为基因转移载体病毒载体可以是乳多空病毒， 腺病毒，牛痘病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，和逆转录病毒因为慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，因此优选地，以HIV为基础构建慢病毒载体为基因转移载体在本实施方案中，对慢病毒载体进行了基因工程改造，使慢病毒的生活周期的复制能力失活图 5为携带ChR2和新霉素抗性基因neo序列的HIV-I型慢病毒载体，其结构包括LTR(l0ng terminal repeat)为长末端重复序列，RRE (Rev responsive element)为 Rev 蛋白反应兀件，cPPT(central polypurine tract)为中心聚嘌呤管道，WPRE为土拨鼠肝炎病毒调控因子可将编码光敏感基因或其功能片段的核酸序列的表达病毒载体置于可药用的悬液，溶液或乳剂中还可以使用非病毒载体系统包括物理方法(如显微注射、电穿孔、基因枪等)或化学方法(磷酸钙、阳离子、脂质体等)将携带ChR2的载体导入分泌细胞可以根据不同细胞的特性进行基因导入方式的选择携带有光敏感基因或其功能片段的慢病毒载体的给与可以通过其他送递手段实现只要该方式使得光敏感基因或其功能片段表达到一定程度，结合光照刺激，可以最大程度增加药物或抗体的产量即可本发明的某些实施方案，光敏感基因多核苷酸序列连接了抗性基因如neo基因， 可采用G418进行稳定株的筛选，从而筛选出ChR2编码序列整合入靶细胞染色体、能够长期稳定表达ChR2的细胞株如图6所示，通过G418筛选，细胞单克隆化并扩增培养，之后采用RT-PCR和Wfestern blot等方法筛选稳定株筛选过程为本领域已知HIV慢病毒基因序列整合入细胞染色体过程如图7所示步骤S420，将表达光敏感基因的分泌细胞置于生物反应器中生物反应器可以是上述细胞分泌物生产系统的生物反应器100，也可以是转基因动物生物反应器(如乳腺生物反应器)利用转基因动物生物反应器进行药物生产，可以同时将光敏感基因和药物基因，加上适当的调控序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物生产药物的效应器官既能表达光敏感基因，又能产生药物，利用光照刺激，促进靶器官产生药物步骤S430，对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激，使光敏感通道蛋白开放，细胞去极化，促进所述分泌细胞分泌生物活性物质生物活性物质可以是白细胞介素、 干扰素、生长因子等细胞因子，胰岛素、抗利尿激素、雌激素等内分泌或外分泌激素，还可以是各种单克隆抗体如采用上述细胞分泌物生产系统的生物反应器及控制装置，则所述对所述生物反应器内的分泌细胞实施光照刺激的步骤包括如下步骤检测分泌细胞电位变化信息；根据所述电位变化信息控制光照刺激的强度和频率上述细胞分泌物生产系统和方法中，利用光照刺激，促进分泌细胞去极化，进而引起Ca2+内流，增强细胞分泌功能，从而增加基因工程药物和单克隆抗体的产量以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准