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专利名称
快速定量检测蚊子组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的引物及其试剂盒和方法
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发明者
奚志勇, 朱俭
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公开日
2012年3月21日
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申请日期
2011年12月7日
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优先权日
2011年12月7日
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申请人
广州沃巴克生物科技有限公司
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文档编号
C12N15/11GK102382898SQ20111040491
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关键字
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权利要求
1.一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的Real-time PCR引物，其特征在于，包括根据蚊子的看家基因设计的引物作为内参引物和根据沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的特异性基因设计的引物作为检测引物2.根据权利要求1所述的Real-timePCR引物，其特征在于，所述的蚊子的看家基因为核糖体S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因为表面蛋白 (WSP)基因3.根据权利要求2所述的Real-timePCR引物，其特征在于，所述的根据核糖体 S6蛋白(rpS6)基因设计的引物作为内参引物，当蚊子为埃及伊蚊时，其引物序列为 RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG 和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC ；或当蚊子为斯氏按蚊(Anopheles stephensi)时，其引物序列为 Asrps6_RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC， Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计的引物作为检测引物，其引物序列为恥-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG和 Wb-RTR AACTGCACTAGCTTCTG4.一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的Real-time PCR试剂盒，包括内参引物、检测引物和Real-time PCR常规试剂，其特征在于，所述的内参引物是根据蚊子的看家基因设计的引物，所述的检测引物是根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因设计的引物5.根据权利要求4所述的Real-timePCR试剂盒，其特征在于，所述的蚊子的看家基因为核糖体S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因为沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因6.根据权利要求5所述的Real-timePCR试剂盒，其特征在于，所述的根据核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计的引物作为内参引物，当蚊子为埃及伊蚊时，其引物序列为 RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG 和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,当蚊子为斯氏按蚊(Anopheles stephensi)时，其引物序列为 Asrps6_RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC, Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计的引物作为检测引物，其引物序列为恥-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG和 Wb-RTR AACTGCACTAGCTTCTG7.一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的方法，其特征在于，包括以下步骤获取蚊子的组织，提取组织中的DNA，以根据蚊子的看家基因设计的引物作为内参引物，根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因设计的引物作为检测引物，按照常规的Real-time PCR方法对蚊子组织中的沃尔巴克氏体(Wolbachia)进行定性定量分析8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的蚊子的看家基因为核糖体S6 蛋白(rpS6)基因，所述的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因为沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的根据核糖体S6蛋白(rpS6) 基因设计的引物作为内参引物，当蚊子为埃及伊蚊时，其引物序列为RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG 和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,当岐子为斯氏按岐 (Anopheles stephensi)时，其引物序列为 Asrps6_RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计的引物作为检测引物，其引物序列为恥-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG和 Wb-RTR AACTGCACTAGCTTCTG
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技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的引物及其试剂盒和方法
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背景技术
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具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制实施例1 对人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的埃及伊蚊的中肠、唾液腺、卵巢组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的定量测定1、含沃尔巴克氏体(Wolbachia)的蚊子组织样本的获取用CO2麻醉待测蚊子(人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的埃及伊蚊)，在解剖镜下用针头解剖分离待测的蚊子组织(中肠、唾液腺、卵巢)，用STE缓冲液漂洗分离组织3次后置于50 μ LSTE缓冲液中 所述的STE缓冲液属于现有技术的缓冲液，其配方为IOOmM NaCl, IOmM Tris-Cl,pH 8. O和 ImM EDTA, ρΗ 8. O2、组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组的提取将含有蚊子组织的50 μ LSTE 缓冲液置于勻浆器中，碾磨大约45秒后加入2μ L蛋白激酶!((Proteinase K) (10mg/mL), 置反应液于30分钟，随后置反应液于95°C 5分钟终止反应，将其作为待测样品基因组 DNA3、Real-time PCR对沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组DNA的定量测定分别克隆内参照基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia)特异性基因的一段序列，制备Real-time PCR 定量测定的标准曲线采用埃及伊蚊(Ae. Aegypti)的核糖体S6蛋白(rpS6)基因作为内参照，沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白基因作为检测目标基因分别提取埃及伊蚊(Ae. Aegypti)的基因组和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的基因组根据的核糖体S6 蛋白(rpS6)基因设计克隆引物 HindIII-RPS6S-F GATAAGCTTTCGTACCGGAGAGCGCAAGCGTAAG(SEQ ID NO. 1 所示)和 BglII-RPS6S_R GATAGATCTTGGCGCAGCCTTCTTCTCGACCTTC(SE Q ID NO. 2所示)进行PCR扩增反应，扩增的片段纯化后用HindIII和BglII酶切后定向克隆入PSL1180质粒中根据的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计克隆引物 BioI-WbF ATCTCGAGACATTTGCTCCAACAACTG(SEQ ID NO. 3 所示)和 XbaI-WbR CTTCTAGAAACTGCACTAGCTTCTG (SEQ ID NO. 4所示)进行PCR扩增反应，扩增的片段纯化后用 XhoI和^CbaI酶切后定向克隆入pSL1180质粒中测序鉴定克隆的序列正确根据的核糖体 S6 蛋白(rpS6)基因设计 Real-time PCR 弓丨物，RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG(SEQ ID NO. 5 所示)和 RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC(SEQ ID NO. 6 所示)；根据的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计Real-time PCR引物，(SEQ ID NO. 4所示) Wb-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG (SEQ ID NO. 7 所示)和 Wb-RTR AACTGCACTAGCTTCTG(SEQ ID NO. 8所示)计算上述克隆得到的埃及伊蚊的核糖体S6蛋白(rpS6)基因克隆和沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因克隆的拷贝数，并进行梯度稀释，以梯度稀释的埃及伊蚊的核糖体S6蛋白(rpS6)基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因分别作为模板在荧光定量PCR管中加入10 μ mol/L forward和reverse引物(RPS6-RTF和 RPS6-RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4 μ L、生物用水 8. 2 μ L 和 STOR Green Realtime PCR Master Mix IOyL0各反应管中加入模板基因组DNA (核糖体S6蛋白(rpS6)基因克隆；或表面蛋白(WSP)基因克隆)各lyL，总反应体系为20 μ L，每个样品重复3次完成上述步骤后，把加好样品的荧光定量PCR反应管放在real-time quantity PCR仪上进行反应反应条件为95 °C预变性15分钟；95 °C变性15秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，40个循环 数据读取由荧光定量PCR仪自动完成，由此制作好标准曲线在荧光定量PCR管中加入10 μ mol/L forward和reverse弓丨物(RPS6-RTF和 RPS6-RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4μ L、生物用水 8. 2μ L 和 STOR Green Realtime PCR Master MixlO μ L各反应管中加入待测样品基因组DNA各1 μ L，总反应体系为20 μ L， 每个样品重复3次完成上述步骤后，把加好样品的荧光定量PCR反应管放在real-time quantity PCR仪上进行反应反应条件为95°C预变性15分钟；95°C变性15秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸30秒，40个循环数据读取由荧光定量PCR仪自动完成根据标准曲线算出具体的待测样品中内参照基因和目标基因的拷贝数，用内参照基因的拷贝数对目标基因的拷贝数进行标准化，最终结果定量测定结果以目标基因拷贝数/内参照基因拷贝数表示结果如图1所示卵巢、中肠和唾液腺中都可检测到沃尔巴克氏体(Wolbachia)的存在，其中以卵巢中沃尔巴克氏体(Wolbachia)最为丰富，约 85ffolbachia/rps6实施例2 对人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的中肠、唾液腺、卵巢、脂肪体和睾丸组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的定量测定1、含沃尔巴克氏体(Wolbachia)的蚊子组织样本的获取用CO2麻醉待测蚊子(人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的斯氏按蚊)，在解剖镜下用针头解剖分离待测的蚊子组织(中肠、唾液腺、卵巢、脂肪体和睾丸)，用STE缓冲液漂洗分离组织3次后置于50 μ L STE缓冲液中所述的STE缓冲液属于现有技术的缓冲液，其配方为IOOmM NaCl, IOmM TrisCl,pH 8.0 禾口 ImM EDTA，pH 8.02、组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组的提取将含有蚊子组织的50 μ LSTE 缓冲液置于勻浆器中，碾磨大约45秒后加入2 μ L蛋白激酶K (Proteinase K) (10mg/mL)，置反应液于55°C 30分钟，随后置反应液于95°C 5分钟终止反应，作为待测样品基因组DNA3,Real-time PCR对沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组DNA的定量测定分别克隆内参照基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia)特异性基因的一段序列，制备Real-time PCR定量测定的标准曲线采用斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖体S6蛋白(rpS6)基因作为内参照，沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白基因作为检测目标基因分别提取斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的基因组和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的基因组根据的的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计克隆引物As rps6_F ACGACCACAAGCTGCGTCAC (SEQ ID N0. 9 所示)，As rps6_R GTCAGCACACCCTGCTTCATG (SEQ ID NO. 10所示)进行PCR扩增反应，扩增的片段纯化A-T克隆入pGEM -T Easy Vector质粒中根据的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计克隆引物 XhoI-WbF ATCTCGAGACATTTGCTCCAACAACTG 和 XbaI-WbR CTTCTAGAAACTGCACTAGCTTCTG 进行PCR扩增反应，扩增的片段纯化后用BioI和^CbaI酶切后定向克隆入PSL1180质粒中 测序鉴定克隆的序列正确根据的核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计Real-time PCR引物，Asrps6-RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC, Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；根据的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计Real-time PCR弓丨物，Wb-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR AACTGCACTAGCTTCTG计算上述克隆得到的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖体S6蛋白(rpS6) 基因克隆和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因克隆的拷贝数，并进行梯度稀释，以梯度稀释的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖体S6蛋白(rpS6)基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因分别作为模板在荧光定量PCR管中加入 10 μ mol/L forward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6_RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4 μ L、生物用水 8· 2μ L和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10yL各反应管中加入模板基因组DNA(核糖体S6蛋白(rpS6)基因克隆；或表面蛋白(WSP)基因克隆)各 1 μ L，总反应体系为20 μ L，每个样品重复3次完成上述步骤后，把加好样品的荧光定量 PCR反应管放在real-time quantity PCR仪上进行反应反应条件为95°C预变性15分钟；95°C变性15秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，40个循环数据读取由荧光定量PCR 仪自动完成，由此制作好标准曲线在荧光定量PCR 管中加入 10 μ mol/L forward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6-RTR ；或Wb-RTF和Wb-RTR)各0. 4μ L、生物用水8. 2μ L和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix IOyL0各反应管中加入待测样品基因组DNA各1 μ L，总反应体系为20 μ L， 每个样品重复3次完成上述步骤后，把加好样品的荧光定量PCR反应管放在real-time quantity PCR仪上进行反应反应条件为95°C预变性15分钟；95°C变性15秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸30秒，40个循环数据读取由荧光定量PCR仪自动完成根据内参照和目标基因的标准曲线算出待测样品的内参照基因和目标基因的拷贝数，用内参照基因的拷贝数对目标基因的拷贝数进行标准化，最终结果定量测定结果以目标基因拷贝数/内参照基因拷贝数表示结果见图2所示在唾液腺、中肠、卵巢、脂肪体和睾丸中都可检测到沃尔巴克氏体(Wolbachia)的存在，其中以睾丸中沃尔巴克氏体 (Wolbachia)最为丰富，约 20Wolbachia/rps6实施例3 定量监测不同代系中沃尔巴克氏体(Wolbachia)在人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)组织分布1、含沃尔巴克氏体(Wolbachia)的蚊子组织样本的获取用(X)2麻醉待测蚊子 (不同代系的人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的斯氏按蚊)，在解剖镜下用针头解剖分离待测的蚊子组织(中肠、唾液腺、卵巢、脂肪体和睾丸)，用STE缓冲液漂洗分离组织3次后置于50 μ L STE缓冲液中所述的STE缓冲液属于现有技术的缓冲液，其配方为 IOOmMNaCl，IOmM Tris Cl,pH 8. O 禾口 ImM EDTA, ρΗ 8. O2、组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组的提取将含有蚊子组织的50 μ L STE缓冲液置于勻浆器中，碾磨大约45秒后加入2μ L蛋白激酶!((Proteinase K) (lOmg/ mL)，置反应液于55°C 30分钟，随后置反应液于95°C 5分钟终止反应，作为待测样品基因组 DNA3,Real-time PCR对沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组DNA的定量测定分别克隆内参照基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia)特异性基因的一段序列，制备Real-time PCR定量测定的标准曲线采用斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖体S6蛋白(rpS6)基因作为内参照，沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白基因作为检测目标基因分别提取斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的基因组和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的基因组根据的的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计克隆引物As rps6_F ACGACCACAAGCTGCGTCAC, As rps6_R GTCAGCACACCCTGCTTCATG 进行 PCR 扩增反应，扩增的片段纯化A-T克隆入pGEM -T Easy Vector质粒中根据的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计克隆引物 XhoI-WbF ATCTCGAGACATTTGCTCCAACAACTG 和 XbaI-WbR CTTCTAGAAACTGCACTAGCTTCTG 进行PCR扩增反应，扩增的片段纯化后用BioI和^CbaI酶切后定向克隆入PSL1180质粒中 测序鉴定克隆的序列正确根据的核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计Real-time PCR引物，Asrps6-RTF ACGACCACAAGCTGCGTCAC, Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；根据的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计Real-time PCR弓丨物，Wb-RTF ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR AACTGCACTAGCTTCTG计算上述克隆得到的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖体S6蛋白(rpS6) 基因克隆和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因克隆的拷贝数，并进行梯度稀释，以梯度稀释的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的核糖体S6蛋白(rpS6)基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因分别作为模板在荧光定量PCR管中加入 10 μ mo 1/Lforward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6_RTR ；或 Wb-RTF 和 Wb-RTR)各 0. 4 μ L、生物用水 8· 2μ L 和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μ L各反应管中加入模板基因组DNA(核糖体S6蛋白(rpS6)基因克隆；或表面蛋白(WSP)基因克隆)各 1 μ L，总反应体系为20 μ L，每个样品重复3次完成上述步骤后，把加好样品的荧光定量 PCR反应管放在real-time quantity PCR仪上进行反应反应条件为95°C预变性15分钟；95°C变性15秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，40个循环数据读取由荧光定量PCR仪自动完成，由此制作好标准曲线在荧光定量PCR 管中加入 ΙΟμπιοΙ/L forward 和 reverse 引物(Asrps6_RTF 和 Asrps6-RTR ；或Wb-RTF和Wb-RTR)各0. 4μ L、生物用水8. 2μ L和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix IOyL0各反应管中加入待测样品基因组DNA各1 μ L，总反应体系为20 μ L， 每个样品重复3次完成上述步骤后，把加好样品的荧光定量PCR反应管放在real-time quantity PCR仪上进行反应反应条件为95°C预变性15分钟；95°C变性15秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸30秒，40个循环数据读取由荧光定量PCR仪自动完成根据内参照和目标基因的标准曲线算出待测样品的内参照基因和目标基因的拷贝数，用内参照基因的拷贝数对目标基因的拷贝数进行标准化，最终结果定量测定结果以目标基因拷贝数/内参照基因拷贝数表示结果见图3 沃尔巴克氏体(Wolbachia)的存在于连续的代系的卵巢、中肠、唾液腺、脂肪体和睾丸中，脂肪体中沃尔巴克氏体(Wolbachia) 随着代系的增加有增加的趋势，而睾丸中沃尔巴克氏体(Wolbachia)随代系的增加有减少的趋势综上所述，利用本发明的引物和试剂盒，采用Real-time PCR定量检测，能够快速有效的检测到蚊子组织中沃巴克氏体(Wolbachia)的存在
专利名称：快速定量检测蚊子组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的引物及其试剂盒和方法沃尔巴克氏体(Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。在沃尔巴克氏体(Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和 (Cytoplasmic ^compatibility，Cl)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。近期研究发现，沃尔巴克氏体(Wolbachia) 不仅具有上述的特性外，同时它还能在蚊子体内与蚊子携带的一些重要的病原生物(如登革病毒，疟原虫等)相互作用，抑制它们在蚊子体内的增值和扩散从而在阻断这些病原生物传播于人类。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的这种抑制作用与它在蚊子体内组织的分布相关，所以，了解沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子体内组织分布有助于快速筛选出传播阻断效果最好的沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的蚊子，也有助于监测沃尔巴克氏体 (Wolbachia)在蚊群中的垂直传播，同时也有利于高效率地监测大规模大地域范围的沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子组织中的感染情况。目前，在蚊子体内组织中检测沃尔巴克氏体(Wolbachia)的方法以采用针对沃尔巴克氏体(Wolbachia)表面蛋白的抗体进行Wfestern-blotting来检测。此方法需要有沃尔巴克氏体(Wolbachia)表面蛋白的抗体，这种抗体还没有商业化，需要实验室自己制备。 制备抗体不仅耗费也耗时，一般制备特异性不高的抗体(多克隆抗体)最少需要2-3月，若要制备特异性高的抗体(单克隆抗体)需要时间更长。同时，这种检测条件限制很强，不能同时检测多样品，因而不能进行大批量检测。另外，此方法最大的缺点在于它不能对沃尔巴克氏体(Wolbachia)进行定量分析。
本发明的第一个目的是提供一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的 Real-time PCR 引物。本发明首先分离获取含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的不同组织，提取沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组DNA ；采用沃尔巴克氏体(Wolbachia)特异性的PCR引物对沃尔巴克氏体(Wolt3aChia)DNA进行Real-time PCR检测，从而实现本发明的目的。本发明的快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的Real-time PCR引物，其特征在于，包括根据蚊子的看家基因设计的引物作为内参引物和根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因设计的引物作为检测引物。所述的蚊子的看家基因优选为核糖体S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的特异性基因优选为表面蛋白(WSP)基因。优选，所述的根据核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计的引物作为内参引物，当蚊子为埃及伊蚊时，其引物序列为RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC ；或当蚊子为斯氏按蚊(Anopheles stephensi)时，其引物序列为 Asr ps6-RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计的引物作为检测引物，其引物序列为 Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。本发明的第二个目的是提供一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体 (ffolbachi a)的Real-time PCR试剂盒，包括内参引物、检测引物和Real-time PCR常规试剂，其特征在于，所述的内参引物是根据蚊子的看家基因设计的引物，所述的检测引物是根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因设计的引物。所述的蚊子的看家基因优选为核糖体S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的特异性基因优选为沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因。优选，所述的根据核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计的引物作为内参引物，当蚊子为埃及伊蚊时，其引物序列为RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,当蚊子为斯氏按蚊(Anopheles stephensi)时，其引物序列为 Asrps6-RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计的引物作为检测引物，其引物序列为 Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。本发明的第三个目的是提供一种快速定量检测蚊子体内组织中沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的方法，其特征在于，包括以下步骤获取蚊子的组织，提取组织中的DNA，以根据蚊子的看家基因设计的引物作为内参引物，根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的特异性基因设计的引物作为检测引物，按照常规的Real-time PCR方法对蚊子组织中的沃尔巴克氏体(Wolbachia)进行定性定量分析。所述的蚊子的看家基因优选为核糖体S6蛋白(rpS6)基因，所述的沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的特异性基因为沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因。优选，所述的根据核糖体S6蛋白(rpS6)基因设计的引物作为内参引物，当蚊子为埃及伊蚊时，其引物序列为RPS6-RTF CGTCGTCAGGAACGTATCCG和RPS6-RTR TCTTGGCAGCCTTAGCAGC,当蚊子为斯氏按蚊(Anopheles stephensi)时，其引物序列为 Asrps6-RTF :ACGACCACAAGCTGCGTCAC，Asrps6-RTR GTCAGCACACCCTGCTTCATG ；所述的根据沃尔巴克氏体(Wolbachia)的表面蛋白(WSP)基因设计的引物作为检测引物，其引物序列为 Wb-RTF :ACATTTGCTCCAACAACTG 和 Wb-RTR :AACTGCACTAGCTTCTG。本发明避开了对费时费力的沃尔巴克氏体(Wolbachia)特异性抗体的依赖，在基因水平上进行检测。本方法能对不同的组织中的沃尔巴克氏体(Wolbachia)进行快速高效率的定量分析，这是现有的方法所不能比拟的。整个方法操作简便，可控性强，非常容易在很短的时间内检测大量的含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的组织样品，从而节省了时间和费用，提高的工作效率。本发明的这一特性对于高效快速大规模地监测大地域范围的沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子组织中的分布具有巨大价值。因此本发明利用本发明的引物和试剂盒，采用Real-time PCR定量检测蚊子组织中沃巴克氏体(Wolbachia)的方法是一种快速高效率的方法，本发明的实现有利于大量、 迅速地定量分析含沃巴克氏体(Wolbachia)的组织样品，从而使我们能方便地大规模监测大地域范围的沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子组织中的分布。图1为人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的埃及伊蚊的中肠、唾液腺、卵巢组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的定量测定结果；图2为对人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的中肠、唾液腺、卵巢、脂肪体和睾丸组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的定量测定结果，其中S为唾液腺，M为中肠，O为卵巢，F为脂肪体，T为睾丸；图3为定量监测不同代系中沃尔巴克氏体(Wolbachia)在人工转染B型沃尔巴克氏体(Wolbachia)的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)组织分布，其中S为唾液腺，M为中肠，O为卵巢，F为脂肪体，T为睾丸，G7为第7代，G9为第9代，Gll为第11代。
本发明公开了一种快速定量检测蚊子组织中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的引物及其试剂盒和方法。本发明首先分离获取含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的不同组织，提取沃尔巴克氏体(Wolbachia)基因组DNA；采用沃尔巴克氏体(Wolbachia)特异性的PCR引物对沃尔巴克氏体(Wolbachia)DNA进行Real-time PCR检测。本发明的实现有利于大量、迅速地定量分析含沃巴克氏体(Wolbachia)的组织样品，从而使我们能方便地大规模监测大地域范围的沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子组织中的分布。
