专利名称：一种耐高糖高酸的乳酸杆菌的制作方法乳酸是自然界中最小的手性分子，其结构中含有I个不对称碳原子，因此具有旋光性，按构型可分为D-乳酸和L-乳酸。L-乳酸为哺乳动物代谢的中间产物，由于人体只能代谢L-乳酸，因此在用于食品及医药エ业时必然要用L-乳酸代替D，L-乳酸。而L-乳酸最具应用潜カ的是生产聚乳酸(PLA)，制造生物可降解塑料。近年来，人们对D-乳酸、L-乳酸及其衍生物的理化性能和生理活性有了深入的了解，在手性药物、手性溶剤、生物农药及功能性材料等领域拓宽了乳酸对映体的应用范围，市场对高光学纯度的乳酸需求也不断増加。微生物发酵法是目前乳酸生产的主要方法。虽然发酵法乳酸生产技术在日益进歩，但是仍存在乳酸发酵糖转化率低，发酵周期长，生成乳酸浓度低，光学纯度不够等，这与乳酸发酵菌在高糖高酸条件下发酵效能低有夫。“高产L-乳酸干酪乳杆菌的选育及发酵条件研究”(秦浩、张伟国、葛向阳、康传利《食品エ业科技》2011年07 Si)记载以ー株产L-乳酸的干酪乳杆菌G-02为出发菌，采用硫酸ニこ酯(DES)和亚硝基胍(NTG)进行诱变，选育出一株L-乳酸发酵活力较强的菌株G-04。实验结果表明在适当的发酵条件下，该菌株可积累L-乳酸浓度达到188g/L，糖转化率大于90%，发酵周期小于44h。但是该菌种糖转化率仍然偏低，影响产品的质量，发酵周期偏长，设备的利用率不高。CN02145142 发明公开了一 种嗜热乳酸杆菌(Lactobacillusthermophilus)(SNGBL100),保藏号为CGMCC No. 0784和采用该菌种发酵生产L-乳酸的方法，此发明的菌种(SNGBL100)，L-乳酸的转化率在93_95%，L-乳酸的纯度在97_99%。该发明中L-乳酸的转化率偏低，光学纯度偏低。
本发明的目的在于提供一种耐高糖高酸的乳酸杆菌，能有效地提高乳酸的光学纯度及糖转化率和产酸率，并缩短发酵周期。本发明的目的是通过以下措施实现的 ー种乳酸杆菌，其分类命名为Lactobacillus sp.，保藏登记号为CCTCC NO: M2012090。形态特点细胞杆状，(2. 0-9. O) umX (O. 5-0. 8)um,单个或者短链，琼脂平板上菌落小，扁平。生理理化特点革兰氏阳性，不运动，能利用葡萄糖等单糖生成L-乳酸，生长温度为 52-55 0C ο上述乳酸杆菌采用如下方法制备将德氏乳酸杆菌作为出发菌进行诱变育种，高糖高酸条件下筛选驯化，得到所述乳酸杆菌。上述诱变育种是指采用6tlCtl r射线诱变德氏乳酸杆菌。上述的高糖高酸是指酸的浓度为17g/l -21g/l，糖的浓度为150g/l_220g/l。上述乳酸杆菌能利用单糖生产L-乳酸。上述乳酸杆菌，其特征在于所述单糖为葡萄糖。上述乳酸杆菌可应用于发酵生产乳酸。 本发明的乳酸杆菌Lactobacillus sp.的保藏日期是 2012年3月23日，保藏编号是CCTCC NO M 2012090，保藏单位是中国典型培养物保藏中心。有益效果 本发明提供的乳酸杆菌在特定的高酸，高糖的环境下经过反复驯化筛选，对高酸高糖环境具备了良好的耐受性，体内积累了能够抵御高酸高糖环境的特殊物质，用以调节体内的渗透压以维持菌体的完整，并对菌体自身的生理调节机制产生特定的影响，避免乳酸根离子对菌种本身生长的抑制，从而提高糖转化率和乳酸生成率，并改善L-乳酸的光学纯度，其中糖转化率不低于95 %，L-乳酸的光学纯度不低于99. 3 %，且缩短发酵周期，节约时间和成本。本发明的乳酸杆菌在大规模生产时仍能保持良好的生理生化功能和高发酵效，适合于工业化生产。
1.菌种德氏乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)(实验室保藏菌种，自命名F-AlO)
2.培养基配方和培养条件
分离检测培养基一GYP培养基葡萄糖I. 0g，酵母膏I. Og,蛋白胨O. 5 g,肉汁浸膏
O.2g, NaAc ·3Η20 O. 2g，MgS047H20 20mg，MnS044H20 lmg, FeS047H20 lmg，NaCl lmg，吐温80分析纯0. 5ml,琼脂I. 2g，CaCO30 0. 5g,水100ml ;培养条件温度121 °C，培养时间20min。种子培养基配方(单位g/l):葡萄糖50，酵母膏10，蛋白胨10，肉汁浸膏O. 2，NaAc · 3H20 O. 5，MgS047H20 O. 2，MnS044H20 O. 01，FeS047H20 0. 01 NaCl 0. 01 ;培养条件PH=4. 0-5. 0，温度 121 °C，培养时间 20min。发酵培养基配方(单位g/l):葡萄糖200，硫酸铵I. 44，磷酸氢二钾O. 08，磷酸二氢钾O. 08，酵母膏O. 2 ;培养条件PH=4. 0-5. 0，温度121°C，培养时间20min。耐高酸酸性培养基配方(单位g/l):在GYP培养基的基础上，添加如下浓度的L-乳酸(g/1) 17,18,19,20,21,22o3. 葡萄糖浓度和L一乳酸的测定采用山东科学院生物研究所研制的BA — 40Ε生物传感仪测量。体积是有电子液位计显示。转化率的计算体积X产酸+葡萄糖量X 100%。L-乳酸的光学纯度采用ΧΤΥ-ΑΗ3000高效液相色谱检测仪检测。二.制备方法
I.将德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(实验室保藏菌种,自命名F-A10)，制成菌种悬浮液(菌种含量为IX IO6个/ ml)4. 5ml,加入硫酸二乙酯O. 5% (体积t匕)于45°C下震荡处理5min，再加入75 %硫代硫酸钠10 ml反应lOmin，稀释10倍后涂布于含有CaCO3的GYP平板，于54 °C恒温培养20h ；
GYP平板培养基葡萄糖I.0g，酵母膏I.0g，蛋白胨0.5 g，肉汁浸膏0.2g，NaAc · 3H20 O. 2g, MgS047H20 20 mg，MnS044H20 I mg, FeS047H20 lmg, NaCl I mg,，吐温80 分析纯 0. 5ml,琼脂 I. 2 g, CaCO30 0. 5g,水 100ml ；
2.挑选单个，菌落小而透明圈大的菌落接种于麦芽汁CaCO3试管斜面上54°C培养；
3.将培养好的试管菌种制成悬浮液(含量为10个/ml) 20ml,置于25ml比色管中于6tlCtl r射线下照射，剂量为800-1200Gy，照射后的悬浮液稀释成10_4，取O. Iml涂平板，于54°C温度下培养12-16h，该平板为不同乳酸浓度的CaCO3的GYP培养基平板；
4.4-1.耐高酸菌种的选育
将经过诱变后的菌株F-AlO用种子培养基活化18h后，于无菌环境下进行梯度稀释并涂布于不同乳酸浓度的GYP培养基上，54°C培养20h。结果如表I。由表I可知，出发菌株经过诱变后，在不同乳酸浓度的酸性培养基中表现出不同的生长情况，随着乳酸浓度的递增，培养基上的菌落逐渐减少，21%的乳酸浓度是诱变后菌株的临界乳酸耐受浓度，在21%的酸性平板上挑选优势菌落作为目的菌落。表I


本发明提供了一种耐高糖高酸的乳酸杆菌，其在高糖高酸环境下仍能保持高发酵效能，进而提高糖转化率和乳酸生成率，并改善L-乳酸的光学纯度，且缩短发酵周期，节约时间和成本。当应用于工业化进行大规模生产时，本发明的乳酸杆菌仍能保持良好的生理生化功能和高发酵效，适合于工业化生产。