专利名称：生殖保健用脐带间充质干细胞技术的制作方法近年来，生殖健康的重要性正受到越来越多人的关注，因为生殖系统活动不仅影响目前的社会，还直接影响人类社会的未来。所以，生殖系统健康已不单纯是一个医学范畴的课题，而是人类社会生存、发展与进步的永恒主题。一直以来，人们常把生殖系统健康简单地归之于妇科方面，然而事实上，生殖系统健康不是只对女性而言的，男性的生殖系统的保健也同样非常重要。生殖系统的健康不仅仅是指没有生殖系统活动的异常和疾病，还表现在生理、心理及社会各方面的完全良好状态。生殖系统分为男性生殖系统和女性生殖系统两种。男性生殖系统主要是由睾丸、附睾、输精管和精囊腺组成，其中睾丸是男性的性腺，也叫主要性器官，产生精子和雄性激素，附睾主要为储存睾丸产生的精子。睾丸产生的精子，就是一个雄的生殖细胞。女性生殖系统则包括卵巢、子宫、输卵管和阴道，其中卵巢是女性的性腺，也是生殖系统的主要性器官，产生卵子和雌性激素。输卵管连接卵巢与子宫，后者是接受受精卵长成一个初生婴儿的地方。人的生殖系统成熟较晚，但却是最先开始衰老的。女性的生殖机能从30岁开始下滑，到35岁以后呈直线衰退，如果没有保养好，之后女性就将过早的面临痛苦而漫长的更年期，衰老也更快的来临。随着年龄的增大，分娩、性生活、雌激素下降等因素的影响，生殖机能日渐衰退，直接导致自身免疫能力下降，各种细菌病毒乘虚而入引发各种生殖疾病。同时，由于卵巢功能衰退，性激素分泌必然减少，包括雌激素，这样导致神经介质功能失衡，从而植物神经功能紊乱，机体的行为和情绪也都受到显著影响。生殖保养就是为了提高生殖机能，增强生殖自身对疾病 的抵抗力。男性生殖机能与女性不同，男性到35岁左右生殖机能开始下降，到了 55岁以后则急剧下降，往往会出现阳痿、早泄、性欲低下等症状。同时，男性有面对经济和社会的巨大压力，又由于生物学上的差异，男性为地位、权力奋斗成为自身的心理奖赏，比女性付出和消耗更多的生物性能量。但是，成功和满意的男性只是少数，其余的男性容易有抑郁和失落心理却又不愿承认。同时，与女性相比，男性的健康意识还是很淡薄。男性健康意识的淡薄和不健康的生活方式(吸烟、酗酒、无规律的生活、经常熬夜、久坐等)，对男性健康也形成了巨大的危害。客观地说，所有男人都比女人更需要医学保健。然而，目前用于生殖系统保健有中医药保健法，营养保健法，理疗保健法等，这些保健方法均存在缺陷。干细胞(Stem Cell, SC)是一类具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，它能产生表现型和基因型与自己完全相同的子代干细胞，也能在一定条件下分化成为各种功能的细胞。根据其发育阶段，可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是指来源于胚胎组织的具有多分化潜能且可发育成机体的各种组织脏器的细胞。人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell, HESC)的来源主要有三种:(1)从人工受精中捐献的多余膈胎中获取；(2)从死亡胎水尸体的原始生殖组织分离；(3)从体细胞核转移术所创造的胚胎中分离。成体干细胞可分为造血和非造血干细胞，非造血干细胞包括脂肪干细胞、神经干细胞、皮肤干、肝脏干、心脏干、生殖干、肌肉干等，造血干细胞包括骨髓干、外周干、脐带血干细胞、胎肝血干细胞。胚胎干细胞具有全能性，能分化为各个胚层来源的细胞，但是存在免疫排斥、致瘤性和伦理等问题，因此胚胎干细胞的应用受到限制。成体干细胞避免了上述胚胎干细胞的缺点，且具有多向分化的潜能，在一定条件下也能分化为各个胚层来源的细胞，甚至能分化为多能干细胞、胚胎样干细胞。目前，干细胞移植不仅在血液病、实体瘤、遗传性疾病方面取得了良好的临床疗效，而且在神经系统疾病、骨关节疾病、心血管疾病、代谢性疾病如糖尿病、自身免疫性疾病，以及在亚健康治疗、抗衰老、美容等方面都有很好的应用。人类胳带间充质干细胞(humanumbilical mesenchymal stem cells, HUMSC)来源于妇女分娩时的脐带组织。脐带是指胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含二条脐动脉、一条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织-华尔通氏胶(Whartonps Jelly),从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cell, HUMSC)。研究表明，HUMSC 具有多向分化潜能和可塑性，可分化成三个胚层来源的组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、神经细胞、心肌细胞、生殖细胞(如精原细胞、卵母细胞等)。脐带间充质干细胞用于移植有如下优点:(1)来源丰富，(2)采集时对新生儿和母体无任何伤害和痛苦，(3)以实物储存用时即可将细胞复苏或培养扩增，而且体外扩增能力强，(4)用于移植时无需组织配型、不发生移植物抗宿主病(GVHD、无巨细胞病毒(CMV)感染等。HUMSC的这些特点以及可分化为生殖细胞的潜能为人类的生殖保健带来了福音。
本发明利用志愿者 的脐带分离纯化，并在特定的培养体系中进行扩增培养，在干细胞总数达到一定数目后，通过静脉输注，保养生殖系统。脐带间充质干细胞具有来源丰富、以实物储存用时即可将细胞复苏或培养扩增、体外扩增能力强、用于移植时无需组织配型、不发生移植物抗宿主病(GVHD、无巨细胞病毒(CMV)感染、无毒副作用和不良反应等优点。HUMSC的这些特点以及可分化为生殖细胞的潜能为人类生殖保健提供了良好方法。具体实施例方式通过本实施例来具体说明本发明生殖保健用脐带间充质干细胞技术。脐带是连接胎盘与胎儿的组织，在胎儿出生的时候将其剪下，其中含有大量的间充质干细胞，增殖能力强，用于移植时无需配型。本发明操作步序如下:(I)干细胞 采集和加工，签订产妇脐带和脐带血捐献同意书，在产房无菌条件下取得产妇脐带血和脐带，36小时内在GMP车间的100级层流罩内分离脐带血:留取适当样品做质检(HBsAg、HCV-Ab, TP-Ab, HIVl/2-Ab、CMV-1gM)，700 转 / 分钟离心 10 分钟后去除脐带血红细胞，混匀后2800转/分钟离心25分钟后用压浆机去除血浆。在此过程中注意尽可能多地保留单核细胞。此脐血含有单核细胞、红细胞和血浆。脐带组织的处理:在与脐血同样条件的厂房中去除脐带中的血管和外膜，组织剪成Imm3大小。(2)脐带间充质干细胞培养及传代，脐带组织加工完后接种于T75细胞培养瓶，DMEM完全培养液并添加营养因子，S卩10ng/ml ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)，100u/ml青霉素，100u/ml 链霉素，20ng/ml of rEGF, 20ng/ml of rPDGF-bb, lOng/ml of LIF, 20ng/mlof bFGF。同时加入20%的分离纯化的脐带血干细胞，放置于37°C、5% C02培养箱中饱和湿度培养7-10天后，间充质干细胞从组织块边缘长出，换液，并补充营养因子。间充质干细胞汇合度达80%时，上清液取出(过滤以去除死亡的细胞及细胞碎片，待用)并用DMEM培养液洗涤间充质干细胞，用0.25%胰酶-0.1 %胶原酶消化15分钟，轻叩培养瓶使干细胞脱落(除去成纤维细胞等)。细胞悬液经100目滤网过滤以去除组织块，后用800r/min离心6min,以过滤的原培养液重悬,传代于T175ml培养瓶(Pl代，培养瓶用10ug/ml的纤粘素包被)，原培养液、分离的脐带血和DMEM新鲜的完全培养液各三分之一体积并补充间充质干细胞营养因子，37°C、5% C02培养箱中饱和湿度培养，每3-4天换液一次，之后的传代按照I: 3比例传。(3)脐带间充质干细胞特异诱导，P3代HUMSC上清液除去，经0.25%胰酶-0.1%胶原酶消化15分钟后，800r/min离心6min重悬,并接种于经10ug/ml纤粘素包被的IOOmm的培养皿，以DMED完全培养液并增补20ng/ml of rEGF、20ng/ml of bFGF和20m U/ml人绒毛膜促性腺激素，37°C>5% C02培养箱中饱和湿度培养48小时为男性生殖系保健移植之用；培养液增补20ng/ml of rEGF、20ng/ml of bFGF和15%浓度的卵泡液，37°C、5% C02培养箱中饱和湿度培养48小时为女性生殖系保健移植之用。(4)间充质干细胞移植，将扩增的干细胞进行质检:经体外处理的P3代HUMSC上清液收集做质检(革兰氏菌涂片、厌氧菌、需氧菌培养、真菌和霉菌)，HUMSC经0.25%胰酶-0.1 %胶原酶消化后800r/min离心6min重悬，用DMED基础培养液洗涤三次并进一步质检如有核细胞计数及活力观察、流式检测(CD44，CD73，CD90和CD105)、克隆集落形成实验。干细胞移植前告知患者或签订知情者同意书。脐带间充质干细胞经质检合格后，以3.7X105/KG的干细胞剂量经手背静脉输注以生殖保健。剩余的干细胞冻存(将制备好的自体干细胞加入10% DMSO和1%· BSA，存入-196°液氮罐保存)。
一种利用志愿者的脐带分离培养出能够用于生殖保健用脐带间充质干细胞，涉及基础医学、生殖保健医学领域。从志愿者的脐带组织中分离纯化出干细胞，并在特定的培养体系中进行扩增培养，在干细胞总数达到一定数目后，通过静脉输注，保养生殖系统。本间充质干细胞可用于生殖系统保养及功能障碍治疗，具有来源丰富、以实物储存用时即可将细胞复苏或培养扩增、体外扩增能力强、用于移植时无需组织配型、不发生移植物抗宿主病(GVHD、无巨细胞病毒(CMV)感染等优点。用于保健或治疗，无毒副作用和不良反应。