烧伤组合物、制备方法及其应用的制作方法【技术领域】，具体涉及一种烧伤组合物、其制备方法及其应用，尤其是防治烧伤脓毒症肠屏障损伤方面的应用。[0002]烧伤可引起局部和远隔器官的损伤，因此烧伤的治疗不仅需要针对创面损伤进行治疗，同时应考虑到全身多器官进行保护。目前造成重症烧伤患者死亡的最主要的原因是烧伤后脓毒症的发生，进一步发展可导致多器官功能损伤(MODS)甚至多器官功能衰竭(M0F)，这是ICU病房最主要的死亡原因，所以对于重症烧伤患者应重点防治烧伤脓毒症。[0003]在烧伤脓毒症的发病机制中，肠源性感染目前受到广泛的关注。肠道是人体最大的细菌及内毒素的存库，在正常情况下肠道具有屏障功能，可以防止内生固有菌群通过肠黏膜继而浸入淋巴及血液循环，造成远隔器官的感染。在外伤，缺血性休克等因素刺激下，肠通透性增高，肠内大量的细菌及内毒素移位进入血液，这一过程称之细菌移位，是导致脓毒症感染的重要途径之一，因此保护肠屏障功是防治脓毒症关键环节之一。[0004]目前对烧伤脓毒症的治疗多是综合疗法，如液体复苏、抗感染、皮质醇激素类药物，缩血管药物等等 ，但疗效不佳，国外流行病学数据显示其死亡率在30%~70%之间，特别对与烧伤脓毒症肠屏障功能损伤目前尚没有针对性的治疗药物。因此从中医药中寻找经济、有效的治疗的药物可能为该病的治疗提供新的思路和治疗方法。
[0005]本发明要解决的技术问题在于提供一种烧伤组合物，用于治疗烧伤脓毒症，尤其是用于治疗烧伤脓毒症肠屏障损伤。[0006]本发明是通过以下技术方案来实现的。
[0007]烧伤组合物，其组成为:大黄、地榆、五倍子、炉甘石、赤石子、黄蜡、麻油，冰片。上述的烧伤组合物，由大黄、地榆、五倍子、炉甘石、赤石子、黄蜡、麻油、冰片按照1:1:1:1:1:1:12~18:0.1~0.2比例制备而成。
[0008]上述组合物采用如下制备方法，制备成膏剂:
[0009]①将地榆、五倍子、炉甘石、赤石子研磨成药粉，混合；
[0010]②麻油加热至沸腾；
[0011]③将黄蜡加至沸腾的麻油中，搅拌至黄蜡完全溶化，停止加热；
[0012]④将预混的药粉逐步加入至麻油中，搅拌混合，直至药粉均匀分布；
[0013]⑤冷却后，加入冰片，搅拌混匀，即得。
[0014]本发明的烧伤组合物，适用于治疗治疗烧伤脓毒症，尤其适用于治疗烧伤脓毒症肠屏障损伤。



[0016]a.肾脏病理图b.肝脏病理图；A:对照组；B:造模组；C:烧伤组；D:CLP组；E: sCLP组；F:烧伤组合物(0.048g/cm2) ;G:烧伤组合物(0.024g/cm2) ;H:烧伤组合物(0.012g/cm2)ο
[0017]图2是烧伤组合物对烧伤脓毒症“二次打击”大鼠肠形态学的影响；
[0018]A:对照组；B:造模组；C:烧伤组；D:CLP组；E:sCLP组；F:烧伤组合物(0.048g/cm2) ；G:烧伤组合物(0.024g/cm2) ；H:烧伤组合物(0.012g/cm2)。
[0019]图3是免疫组化法观察烧伤组合物对烧伤脓毒症“二次打击”大鼠肠Occludin-1表达的影响；A:对照组；B:造模组；C:烧伤组；D:CLP组；E:sCLP组；F:烧伤组合物(0.048g/cm2) ；G:烧伤组合物(0.024g/cm2) ；H:烧伤组合物(0.012g/cm2)。
[0020]图4是免疫组化法观察烧伤组合物对烧伤脓毒症“二次打击”大鼠肠HMGBl表达的影响；A:对照组；B:造模组；C:烧伤组；D:CLP组；E:sCLP组；F:烧伤组合物(0.048g/cm2)；G:烧伤组合物(0.024g/cm2) ；H:烧伤组合物(0.012g/cm2)。
[0021]图5是Western Blot法观察烧伤组合物对烧伤脓毒症“二次打击”大鼠肠HMGBl以及TGF-β I表达的影响；Α:对照组；Β:造模组；C:烧伤组；D:CLP组；E:sCLP组；F:烧伤组合物(0.048g/cm2) ；G:烧伤组合物(0.024g/cm2) ；H:烧伤组合物(0.012g/cm2)。

[0022]以下结合实施例 对本发明进一步加以说明。
[0023]实施例1:烧伤组合物制备
[0024]I号软膏:取大黄、地榆、五倍子、炉甘石、赤石子、黄腊各500g、麻油7.5kg,冰片50g ；
[0025]2号软膏:取大黄、地榆、五倍子、炉甘石、赤石子、黄腊各500g、麻油6kg,冰片100g ；
[0026]3号软膏:取大黄、地榆、五倍子、炉甘石、赤石子、黄腊各500g、麻油9kg,冰片75g ；
[0027]制备步骤:
[0028]①将地榆、五倍子、炉甘石、赤石子研磨成药粉，混合；
[0029]②麻油加热至沸腾；
[0030]③将黄蜡加至沸腾的麻油中，搅拌至黄蜡完全溶化，停止加热；
[0031]④将预混的药粉逐步加入至麻油中，搅拌混合，直至药粉均匀分布；
[0032]⑤冷却后，加入冰片，搅拌混匀，即得。
[0033]实施例2:烧伤组合物治疗烧伤脓毒症肠屏障损伤的动物研究
[0034]我们将实施例1制备获得的I号烧伤组合物进行动物实验。动物实验的对象选取为烧伤脓毒症“二次打击”模型大鼠。实验使用了包括:
[0035]a实验小鼠选用SD大鼠48只，；
[0036]b试剂选用TNF-a试剂盒；IL_1 β试剂盒试剂盒:；DA0试剂盒；D_LA试剂盒；AST 试剂盒；ALT 试剂盒:；IL-10 试剂盒；HMGBl: JGF-βΙ: ； β -actin: ；SuperSignaling West Femto kit ；[0037]实验方法为:将48只随机分为正常组(Control),模型组(Model, Burn+盲肠结扎穿孔CLP)、CLP组、烧伤组(Burn)、假手术组(sCLP)、烧伤组合物高、中、低剂量组(0.048g/cm2、0.024g/cm2、0.012g/cm2),每组6只。盲肠结扎穿孔CLP术后24h,水合氯醒麻醉大鼠。分别于门静脉和腹主动脉收集血液于肝素抗凝管中，3000g/min离心10min后得血浆，分装，_80°C保存。分别取肝、肾、肠标本于10%中性甲醛中固定或冻存于液氮中。
[0038]烧伤脓毒症“二次打击”模型大鼠造模方法:
[0039]1.实验前一天大鼠水合氯醛麻醉，背部及腹部脱毛。
[0040]2.大鼠水合氯醛麻醉后，背部脱毛部分浸入沸水中10s，造成20%体表面积的烫伤(20%TBSA)，烫伤后立即注射IOml生理盐水抗休克。
[0041]3.烫伤后48h，大鼠建立盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症模型，具体方法如下:实验前一天禁食，水合氯醛麻醉。大鼠在超净工作台中做腹正中切口(l-2cm)，于下腹部取出回盲部，勿损伤肠系膜及肠管。小心分离回盲部与小肠之间的系膜，勿损伤血管，以3号丝线距离盲端0.5-lcm处进行结扎后，取7号针头于肠系膜对穿结扎部位，挤出粪便少许，然后回纳肠管，逐层关腹。术毕腹腔注射2ml生理盐水。烧伤组合物治疗组分别于背部涂抹不同剂量烧伤组合物。
[0042]指标检测如下:
[0043]大鼠肠黏膜通透性检测:采用荧光探针异硫氰酸荧光素-葡聚糖示踪法检测肠通透性，具体方法如下:预先用PBS溶液制备20mg/ml FITC-D，大鼠处死前，于麻醉状态下开腹，丝线结扎距回盲部Icm的末段IOcm回肠两端，向该段肠腔注入FITC-D溶液0.5ml。30min后立即取门静脉血Iml,肝素抗凝,3000g/min离心10min,分离血衆。取血衆200 μ I,加入1.8ml PBS,用型突光分光光度计测定其突光强度,激发光波长于发射光波长分别为480nm和520nm。根据标准曲线计算门静脉血FITC-D的含量(μ g/ml)。
[0044]标准曲线的配制:以20mg/ml FITC-D溶液为母液，分别配制浓度为5、2.5,1.25、0.625,0.3125,0.15625,0.078125 μ g/ml的FITC-D溶液，按上述方法处理后测荧光强度，绘制标准曲线。
[0045]生化指标:ALT、AST、DAO、D-LA,TNF- α、IL-1 β、HMGBl 及 IL-10 按试剂盒说明书的具体步骤进行
[0046]组织病理学和免疫组化学观察:肝、肾，肠组织于10%福尔马林固定液中固定24h，用水冲洗后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋处理后切成4μπι厚的薄片，HE染色观察病理切片；采用免疫组化S-P法显色系统，按照试剂盒说明依次切片脱蜡和水化、抗原修复、滴加一抗、37°C孵育、DAB显色，最后二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察蛋白表达情况；
[0047]Western Blot检测肠组织中HMGBl以及TGF-β I的表达:根据常规的方法制胶、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、二抗、显影，拍照观察。
[0048]统计学分析:采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，多样本的均数比较采用单因素方差分析，组间比较用One-Way ANOVA检验。
[0049]实验结果如下:
[0050](1)烧伤组合物对烧伤脓毒症“二次打击”模型大鼠肝、肾组织学及血浆ALT、
[0051]AST的影响[0052]模型组CLP术后24h血浆中AST、ALT水平较正常组显著升高(P〈0.05)，提示模型组有肝功能损伤。烧伤组合物(0.048g/cm2、0.024g/cm2、0.012g/cm2)干预后血浆AST、ALT较模型组明显下调(P〈0.05)，提示烧伤组合物对烫伤脓毒症”二次打击”模型大鼠具有保护作用。肝、肾HE染色提示模型组肝、肾组织有大量炎性细胞浸润，但未见明显的组织坏死和结构改变，烧伤组合物干预后，
[0053]炎性细胞浸润程度明显减轻，见表1和附图1。
[0054]表1.烧伤组合物对烧伤脓毒症“二次打击”模型大鼠AST、ALT的影响(N=6，
[0055]—土S )
[0056]