专利名称：类HRG的七鳃鳗Lj-RGD3全RGD缺失突变体Lj-112在抗肿瘤药物中的应用的制作方法血管新生是指在生长因子诱导下的从预先存在的血管或血管内皮前期细胞形成新的血管的过程。原发性实体瘤的生长与发展高度依赖于血管的生成作用。无血管肿瘤很少有生长超过2 3mm3的。一旦肿瘤变成血管化，则瘤体就会迅速增长。在临床前期模型中，以肿瘤血管系统为靶向的抗血管新生药物都已显示出了阻碍或推迟肿瘤生长，甚至促进肿瘤退化或休眠的作用。目前许多血管生成抑制剂正在进行I III期临床研究，例如血管抑素、内皮抑素、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等。血管新生抑制疗法可使肿瘤细胞凋亡速度加快、坏死及退化到最初、的休眠状态，进而抑制肿瘤细胞转移而治疗癌症[1]。LJ-RGD3为来源于日本七鳃口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由118个氨基酸残基组成。Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，具有富含组氨酸的特点。其在一级结构上与马来线虫富含组氨酸糖蛋白(Histidine-rich glycoprotein,HRG)有约40%同源性，与人HRG的富含组氨酸/脯氨酸结构域(His/Pro-rich domain)有约30%同源性。HRG为发现于脊椎动物血液中的血浆糖蛋白，是一肝素结合蛋白。HRG的富含组氨酸/脯氨酸结构域(His/Pro-richdomain)是由十二个左右的五肽(GHHPH)模体串联重复构成，具有抗血管新生的功能[2]。Juarez等首次发现HRG蛋白以富含His/Pro结构域依赖方式抑制血管内皮细胞微管形成(tube formation)和增殖。紧接着,这个实验团队又发表了来源于富含His/Pro结构域的合成肽(HHPHG模体)对血管新生的抑制作用、其以75mg/kg/天的剂量对肿瘤生长的抑制活性。Vanwilddemeersch等研究表明，HRG是通过其蛋白水解后释放的富含组氨酸结构域行使其血管新生抑制剂功能的。而来源于His/Pro-rich结构域的一个35个氨基酸残基的合成肽HRGP330和一个26个氨基酸残基的合成肽HRGP335在体内与体外均具有血管新生抑制活性。HRGP330和HRGP335通过与血管内皮细胞表面的肝素/硫酸肝素结合而行使抗血管新生功能[3]。Lj-112为Lj-RGD3的全RGD模体缺失突变体，其为类HRG蛋白，因其结构上具有富含组氨酸的特点而行使抗血管新生功能。关于其功能实验表明，rLj-112抑制血管新生功能的强度约为野生型rLj-RGD3的六倍，为一新的血管新生抑制剂。Lj-112有望应用于血管新生抑制剂类抗肿瘤药物制备领域。参考文献I.Chunsik Lee, Molecular Mechanisms of action of Histidine-richglycoprotein in angiogenesis inhibition, Digital comprehensive summaries ofuppsala dissertations from the faculty of medicine 192, ACTA UniversitatisUpsaliensis Uppsala(2006).2. Blank M. , Shoenfeld Y. , Histidine-rich glycoprotein modulation ofimmune/auto immune, vascular, and coagulation systems, Clin Rev Allergy Immunol34(2008)307-312.3. Vanwildemeersch M. , Olsson A. K. , Gottfridsson E. , Claesson-ffelshL. , Lindahl U. , Spillmann D. , The anti-angiogenic His/Pro-rich fragment ofhistidine-rich glycoprotein binds to endothelial cell heparan sulfate in aZn2+-dependent manner,J Biol Chem 281 (2006) 10298-10304.
本发明通过全基因人工合成方法合成了 Lj_RGD3的三个RGD模体全缺失突变体Lj-112基因，并将此基因克隆于pET-23b载体，对其重组蛋白rLj-112在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。rLj-112生物学活性涉及到通过与血管内皮细胞表面肝素/硫酸肝素结合而行使抗血管新生功能。本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺Lj_RGD3全RGD模体缺失突变体Lj-112的基因人工合成序列、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌中的表达，以及其抑制血管新生的功效。Lj-112基因人工合成序列324bp长，其蛋白质由108个氨基酸组成，其中含有17个组氨酸残基，组氨酸所占比例为15.7%，具有富含组氨酸的特点。Lj-112蛋白的分子量为I. 2kDa，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列详见说明书中核苷酸/氨基酸序列表。Lj-112抑制血管新生的生物学活性如下通过MTT法检测突变体蛋白rLj-112对bFGF诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304增殖呈剂量依赖性抑制，突变体rLj-112抑制ECV304细胞增殖的IC5tl为0. 160 u mol/L。结果表明，rLj-112对血管内皮细胞增殖的抑制作用比野生型rLj-RGD3强，rLj-112的作用强度是rLj-RGD3的大约六倍。体内血管生成实验采用鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型进行。用bFGF (200ng/embryo)诱导血管新生24h后，用30ii (6 ug)的rLj-112或等量的PBS作用于鸡胚。结果表明，bFGF诱导后用PBS处理过的CAM的主枝血管清晰而发达，毛细血管网逐渐形成；而rLj-112处理过的CAM主枝血管发生明显衰退现象，数量明显减少，毛细血管几乎已不复存在。对比同等剂量的rLj-RGD3的血管新生抑制效果，rLj-112的作用效果更加强烈。图I :Lj_112基因合成序列测序结果。灰色阴影部分为Lj-112的基因合成序列，其余为测序载体序列。图2 rLj-112对bFGF诱导的ECV304细胞增殖的抑制作用。野生型rLj-RGD3为阳性对照。图3 rLj-112对bFGF诱导的鸡绒毛尿囊膜(CAM)血管新生的抑制作用(数码相机拍摄)。每只鸡胚加入200ng bFGF诱导24h后，对照组加入30 u I PBS、其它各组分别加入30 ill不同种类的蛋白(浓度为0. 2mg/ml)后再作用24h。(A)PBS对照；(B)rLj-RGD3对CAM血管新生的抑制作用；(C) rLj-112对CAM血管新生的抑制作用。
为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET_23b做为基因克隆的载体，克隆具 体操作如下(I)目的基因的回收与测序目的基因的回收采用TaKaRa PCR FragmentRecovery Kit进行；对回收DNA进行测序，此项工作由大连宝生物工程有限公司完成。(2)质粒的提取采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。(3)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接由于所设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。(4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E. coli BL21中。(5)阳性转化子的筛选鉴定利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛
选鉴定。4.对阳性重组子进行终浓度为lmmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为30°C过夜诱导。5.对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。(I) IOOOOg离心IOmin收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每IOOml的原培养液加4ml冰冷的IX Binding buffer的比例重悬细胞。(2)将上述样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。(3) 14000g离心20min以去除细胞碎片。(4)上清以0. 45 ii m的滤膜过滤。(5)吸去His. Bind Column上室的忙液，并打开下面管口 ；(6)用 IOml 的 Ix Binding Buffer 对柱子进行平衡；(7)将过滤好的上清液上样；(8)用 IOml 的 IxBinding Buffer 洗柱；(9)用 IOml 的 IxWashBuffer 洗柱；(10)用 5ml 的 IxEluteBuffer 洗脱目的蛋白。6. MTT法测定rLj-112对人血管内皮细胞ECV304增殖的抑制作用。具体方法如下(I)将ECV304细胞接种于96孔板中，在bFGF终浓度为3ng/ml的M199培养液中培养24h ；
(2)分别加入梯度浓度的蛋白到培养液中，并用PBS补齐，继续培养24h ；(3)加入培养液10 %的浓度为0. 5mg/ml的MTT溶液继续培养4h ；(4)吸去培养液，加入鱼培养液相同量的DMSO ；
(5)振荡lOmin，使结晶充分溶解；(6)在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm(7)计算细胞杀伤率杀伤率=(对照孔的均值-试验孔均值)/对照孔均值X 100%(8) 3次实验取平均值7.利用鸡绒毛尿囊膜CAM系统进行抗血管新生功能测定。具体实验步骤如下(I)取六日龄鸡胚，用0. I %的新洁尔灭消毒；(2)在绒毛尿囊膜体表投影距胚头Icm处开窗定位，并锯出Icm2的小窗；(3)无菌玻璃纤维滤纸用40 ill的bFGF(200ng/disk)或等量PBS饱合，置于CAM上，透明胶带覆盖；(4)于37 °C 60%湿度的隔水式恒温孵箱内孵育24h后，加等体积的rLj-112、rLj-RGD3或等量的PBS于覆在CAM上的滤纸上，透明胶带覆盖；继续孵育24h后用数码相机观察拍照。


类HRG的七鳃鳗Lj-RGD3全RGD缺失突变体Lj-112在抗肿瘤药物中的应用属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中RGD模体蛋白Lj-RGD3的三个RGD(Arg-Gly-Asp)模体缺失突变基因的人工合成、突变基因的克隆、与之对应的突变体蛋白(命名为Lj-112)在大肠杆菌中的表达，以及rLj-112通过类富含组氨酸糖蛋白(HRG)功能途径更强效抑制血管新生功能及其作为血管新生抑制剂在抗肿瘤制药中的应用。