专利名称：七鳃鳗Lj-RGD2在抗血管新生类抗肿瘤药物中的应用的制作方法血管新生是指在生长因子诱导下的从预先存在的血管或血管内皮前期细胞形成新的血管的过程。原发性实体瘤的生长与发展高度依赖于血管的生成作用。无血管肿瘤很少有生长超过2 3mm3的。一旦肿瘤变成血管化，则瘤体就会迅速增长。在临床前期模型中，以肿瘤血管系统为靶向的抗血管新生药物都已显示出了阻碍或推迟肿瘤生长，甚至促进肿瘤退化或休眠的作用。目前许多血管生成抑制剂正在进行I III期临床研究，例如血管抑素、内皮抑素、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等。血管新生抑制疗法可使肿瘤细胞凋亡速度加快、坏死及退化到最初的休眠状态，进而抑制肿瘤细胞转移而治疗癌症。RGD序列多肽已成为抗肿瘤血管生成抑制剂类药物的主力军，这是因为:RGD序列能特异性拮抗新生血管内皮细胞和肿瘤细胞表面高表达的某些整合素与细胞外基质的结合，封闭整合素介导的信号转导通路，从而具有抑制血管新生和抑制肿瘤细胞的增殖、粘附、浸润及转移，并引起血管内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡而达到抗肿瘤的功效。迄今为止，除本实验室发现于七鳃鳗的三条RGD毒素肽外，只在另外四种不同物种的毒腺或唾液腺中发现了的RGD模体 毒素家族，这四大家族分别是毒蛇以及吸血动物水蛭、蜱类、七鳃鳗、牛虻(1_4)。来源于蛇毒的RGD模体毒素也叫去整合素，是被研究得最为透彻也是最大的一族，种类可依蛇种来源不同达数十种；来源于水蛭唾液腺的RGD模体毒素目前为止只发现decorsin及ornatin两类；来源于蝶类的含RGD模体毒素称为variabilin ;来源于牛蛇的含RGD模体毒素称为Tablysin-15。Lj-RGD2为本实验室发现于七鳃鳗的RGD毒素肽，含有2RGD模体。由几大家族RGD毒素肽结构分析可以看出，来自于蛇毒这一物种的去整合素之间同源性较高(60%以上)，而物种间的RGD模体毒素除具有RGD模体和多对半胱氨酸的共性外，在一级结构上没有同源性。Lj-RGD2为发现于日本七鳃鳗口腔腺中的RGD模体蛋白，由69个氨基酸残基组成，具有两个RGD模体，此蛋白目前在国内外尚无研究与报道，本发明属首次发现。Lj-RGD2有望应用于血管新生抑制剂类抗肿瘤药物制备领域。参考文献:1.Chunsik Lee, Molecular Mechanisms of action of Histidine-richglycoprotein in angiogenesis inhibition， Digital comprehensive summaries ofuppsala dissertations from the faculty of medicine 192， ACTA UniversitatisUpsaliensis Uppsala(2006).2.Blank M.，Shoenfeld Y.，Histidine-rich glycoprotein modulation ofimmune/auto immune, vascular, and coagulation systems, Clin Rev Allergy Tmmunol34(2008)307-312.3.Vanwildemeersch M., Olsson A.K., Gottfridsson E., Claesson-ffelshL., Lindahl U., Spillmann D., The ant1-angiogenic His/Pro-rich fragment ofhistidine-rich glycoprotein binds to endothelial cell heparan sulfate inaZn2+-dependent manner,J Biol Chem 281 (2006) 10298-10304.4.Dongying Mal, Xueqing Xu2, Su Anl et al.A novel family ofRGD-containing disintegrins(Tablysin-15)from the salivary gland of the horseflyTabanus yao targets a IIb β 3 or a V β 3 and inhibits platelet aggregation andangiogenesis.Thrombosis and Haemostasis 105(2011) 1032-45.
本发明将Lj-RGD2基因克隆于pET-23b载体，对其重组蛋白rLj-RGD2在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。rLj-RGD2生物学活性涉及到通过与血管内皮细胞高表达整合素结合而行使抗血管新生功能。本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺Lj-RGD2的基因克隆、在大肠杆菌中的表达，以及其抑制血管新生的功效。LJ-RGD2 cDNA序列(开放阅读框)207bp长，其蛋白质由69个氨基酸组成，理论分子量为8.2kDa，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列详见说明书中核苷酸/氨基酸序列表。LJ-RGD2抑制血管新生的生物学活性如下:通过MTT法检测rLj-RGD2对bFGF诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304增殖呈剂量依赖性抑制，rLj-RGD2抑制ECV304细胞增殖的IC5tl为1.77 μ nol/L。体内血管生成实验采用鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型进行。用bFGF(200ng/embryo)诱导血管新生24h后，用不同剂量 的rLj-RGD2或等量的PBS作用于鸡胚。结果表明，bFGF诱导后用PBS处理过的CAM的主枝血管清晰而发达，毛细血管网逐渐形成；而rLj-RGD2处理过的CAM，随着剂量的加大，CAM主枝血管发生明显衰退现象，数量明显减少，毛细血管几乎已不复存在。且rLj-RGD2对bFGF诱导的CAM血管新生呈剂量依赖性抑制。
图1:rLj-RGD2对bFGF诱导的ECV304细胞增殖的抑制作用。图2:rLj-RGD2纯化蛋白对bFGF诱导的六日龄鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生的抑制作用(OLYMPUS数码相机拍摄)(A) PBS作用于六日龄鸡胚24小时；⑶200ng的bFGF作用于六日龄鸡胚24小时；(C)-(D):200ng的bFGF诱导24小时后，rLj-RGD2作用于CAM的血管新生情况。(C) 20 μ I (3 μ g) ； (D) 40 μ I (6 μ g) ； (E) 80 μ I (12 μ g)。

为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET_23b做为基因克隆的载体，克隆具体操作如下:(I)目的基因的回收与测序:目的基因的回收采用TaKaRa PCR FragmentRecovery Kit进行；对回收DNA进行测序，此项工作由大连宝生物工程有限公司完成。(2)质粒的提取:采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。(3)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接:由于所设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。(4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coli BL21中。(5)阳性转化子的筛选鉴定:利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛
选鉴定。2、对阳性重组子进行终浓度为lmmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为30°C过夜诱导。3、对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。 (I) IOOOOg离心IOmin收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每IOOml的原培养液加4ml冰冷的IX Binding buffer的比例重悬细胞。(2)将上述样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。(3) 14000g离心20min以去除细胞碎片。(4)上清以0.45 μ m的滤膜过滤。(5)吸去His.Bind Column上室的忙液，并打开下面管口 ；(6)用 IOml 的 Ix Binding Buffer 对柱子进行平衡；(7)将过滤好的上清液上样；(8)用 IOml 的 Ix Binding Buffer 洗柱；(9)用 IOml 的 Ix Wash Buffer 洗柱；(10)用 5ml 的 Ix Elute Buffer 洗脱目的蛋白。4、MTT法测定rLj-RGD2对人血管内皮细胞ECV304增殖的抑制作用。具体方法如下:(I)将ECV304细胞接种于96孔板中，在bFGF终浓度为3ng/ml的M199培养液中培养24h ；(2)分别加入梯度浓度的蛋白到培养液中，并用PBS补齐，继续培养24h ；(3)加入培养液10 %的浓度为0.5mg/ml的MTT溶液继续培养4h ；(4)吸去培养液，加入鱼培养液相同量的DMSO ；(5)振荡IOmin,使结晶充分溶解；(6)在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm(7)计算细胞杀伤率:杀伤率=(对照孔的均值-试验孔均值)/对照孔均值X 100%(8) 3次实验取平均值7.利用鸡绒毛尿囊膜CAM系统进行抗血管新生功能测定。具体实验步骤如下:
(I)取六日龄鸡胚，用0.1%的新洁尔灭消毒；(2)在绒毛尿囊膜体表投影距胚头Icm处开窗定位，并锯出Icm2的小窗；(3)无菌玻璃纤维滤纸用40 μ I的bFGF(200ng/disk)或等量PBS饱合，置于CAM上，透明胶带覆盖；(4)于37°C 60%湿度的隔水式恒温孵箱内孵育24h后，加不同剂量的rLj-RGD2或等体积的PBS于覆在CAM上的滤纸上，透明胶带覆盖；(5)继续孵育24h 后用数码相机观察拍照。


“七鳃鳗Lj-RGD2在抗血管新生类抗肿瘤药物中的应用”属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中RGD模体蛋白Lj-RGD2的基因克隆、蛋白表达，以及Lj-RGD2通过抑制新生血管内皮细胞表面高表达的整合素的信号转导途径而强效抑制血管新生功能及其作为血管新生抑制剂在抗肿瘤制药中的应用。