专利名称：含有血管结构的组织工程皮肤及其构建方法 近年来，随着组织工程技术的发展，研究开发具有修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的报道逐渐增多，人工皮肤替代物的研究报道也为数不少。目前对组织工程皮肤的研制与开发已成为皮肤缺损移植治疗的热点。皮肤是覆盖与保护体表的重要组织器官，由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损与异常。对于这种组织缺损，以前多采用自体皮瓣或自体皮肤的移植，这些方法不仅存在着造成供皮区新的创伤缺陷，而且常常存在着供皮来源受限的影响。同时，移植物经常与移植部位邻近的皮肤存在着色泽、质地和功能上的差异。组织工程方法就是通过获得自体或异体的极少量皮肤组织，在体外(实验室中)经过灭菌、消化、分离、培养，在获得足够的细胞数量时将其重组成皮肤组织，用于患者皮肤创伤的修复。1975年Rheinwald和Green提出的上皮细胞的培养技术，解决了上皮细胞体外的传代扩增的难题，使体外培养人工皮片成为可能。但是临床应用发现其有较大的收缩，脆性大且薄，不宜临床操作，移植后耐磨性差、易起疱。为解决临床上对厚度、韧性和可操作性的要求，需在皮片下方增加支持物比如纤维蛋白载体，无细胞的人真皮层支架；人工合成的胶原海绵载体等。有学者将上皮细胞接种在胶原膜上，细胞融合成单层后进行移植，与常规作法相反，表皮细胞转向创面，表面为胶原膜。在人工真皮方面，最早由Burke和Yannas等人设计了一种真皮替代品，目的是让其在创面上充当支架，便于真皮层的再生。结构上分为两层，内层由牛肌腱来源的胶原纤维和硫酸软骨素构成多孔支架，外层则为硅胶膜，起表皮作用，可用于全厚层皮肤缺损。外层的硅胶膜一般在移植2～3周后由自体皮片来替代。代表产品有Integra和Dermagraft系列。Dermagraft-TC产品内层由尼龙丝构成支架材料，表面亦采用硅胶膜。DermagraftTM则使用可降解材料作为真皮支架，其成分为聚羟基乙酸的聚合物。理想的皮肤替代品应该是能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复，这就是所谓全层复合皮肤。这种全层皮肤组织在种植后不易变形，易于愈合。复合皮肤包括两种细胞成分，即位于表层的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞。有学者使用异种动物或尸体皮的脱细胞真皮作为支架接种成纤维细胞构建皮肤替代物，但尚未见到临床应用的报道。Michel等构建皮肤替代物不使用任何支架材料，仅用成纤维细胞在维生素C的作用下形成含有细胞外基质的纤维膜，其某些超微结构与正常组织相似；然后在其上接种角朊细胞，移行、增殖、复层化形成组织工程皮肤替代物。尽管组织工程学方法在皮肤的研制方面已经取得了巨大进展，部分产品已经应用于临床，但是已经或正在研制中的组织工程产品仍不完善，在方法成熟上、研制周期上以及在产品成本上等多方面都存在有缺陷。所报道的组织工程皮肤替代物大多与正常组织有较大差异，如前所述没有正常皮肤的毛囊、血管、汗腺以及黑色素细胞等成分。
针对上述现有技术状况，本发明的目的在于提供一种含有血管结构的组织工程皮肤及其构建方法，并力求使该组织工程皮肤在种植后不易变形、易于愈合、体外培养时间短、异体皮肤免疫排斥小、构建成本低廉。现将本发明技术解决方案叙述如下本发明所提出含有血管结构的组织工程皮肤的特征在于其是由真皮成纤维细胞、角朊细胞和血管内皮细胞和I型胶原构成；所述的真皮成纤维细胞、角朊细胞是取自同一新生儿包皮组织，用消化法分离、扩大培养；所述的血管内皮细胞是取自同一新生儿的脐静脉血管内皮细胞，用消化法分离、扩大培养；以上述三种细胞为种子细胞，用组织工程方法构建而成。所述的真皮成纤维细胞密度为0.5×105～1×107/ml；所用I型胶原浓度为1～15％；真皮成纤维细胞与血管内皮细胞按1∶1～10∶1的比例混合；所述角朊细胞的密度为1×105～5×106/ml。
本发明含有血管结构的组织工程皮肤的构建方法，包括真皮成纤维细胞、角朊细胞和血管内皮细胞的培养和组织工程皮肤的构建，其特征在于(1)真皮成纤维细胞、角朊细胞和血管内皮细胞的体外培养包括以下步骤1)取新生儿包皮组织，用消化法分离表皮和真皮；取同一新生儿脐静脉的血管内皮细胞，用消化法分离获得血管内皮细胞；2)将分离出的表皮用胰酶消化后获得单细胞悬液，将单细胞悬液用角朊细胞培养液接种培养；将分离出的真皮用胶原酶消化后获得真皮成纤维细胞的单细胞悬液，再用含胎牛血清的DMEM培养液接种培养；将分离出的血管内皮细胞离心、清洗，用培养液重悬细胞，接种培养；3)将上述各细胞扩大培养；4)血管内皮细胞培养液的配制商用培养基M199为80％，小牛血清为20％；另含有商用碱性成纤维细胞生长因子bFGF为5～20ng/ml，商用肝素为60～90μg/ml。
(2)组织工程皮肤的构建包括以下步骤1)取上述生长状态良好的细胞，将密度为0.5×105～1×107/ml的真皮成纤维细胞与血管内皮细胞按1∶1～10∶1的比例混合，然后再与浓度为1～15％的I型胶原混合；2)37℃孵育凝固后，加入培养液培养；3)在上述细胞表面以1×105～5×106/ml的密度接种角朊细胞继续培养；4)将复合了细胞的胶原移至气液面进行器官培养，培养7～21天，即获得组织工程皮肤，保存备用。


图1为本发明含血管样结构组织工程皮肤构建后的HE染色照片。
图2为本发明含血管样结构组织工程皮肤构建后的免疫组化VIII因子抗体照片。
图3为本发明动物移植实验结果照片。
图4为本发明动物移植实验免疫组化结果照片。
图1和图2说明，在组织工程皮肤真皮层中含有大量血管样结构，管壁细胞扁平，单层排列，管腔较大，免疫组化结果显示该细胞VIII因子抗体反应阳性，表明该细胞为血管内皮细胞。
图3和图4说明，被植皮裸鼠的皮肤缺损愈合良好，表面光滑，色泽正常。免疫组化结果显示，在愈合后皮肤的真皮层含有大量微血管结构，VIII因子抗体反应阳性，表明本发明组织工程皮肤愈合良好。

现结合实验将本发明方法和实施效果作进一步说明。
1、血管内皮细胞的培养取新生儿脐带，放在无菌磷酸盐缓冲液PBS中，4℃保存运输，培养尽量在1小时内开始，否则细胞活力将大大下降；脐带放在无菌培养皿中，用无菌PBS缓冲液反复冲洗以去除污物，并冲洗静脉内腔，以去除血污；用缝合线将脐带静脉一端严密结扎，在其中先灌入消化液a37℃消化10分钟，再用消化液b消化5分钟；从一端剪开结扎的脐带，将液体到出，然后用PBS反复冲洗血管内腔，收集液体离心，洗2遍；用血管内皮细胞培养液重悬细胞，接种培养。所述的消化液a为625U/ml胶原酶/0.1％乙二胺四乙酸EDTA1∶1的混合液；b为0.25％胰酶/0.1％EDTA1∶1的混合液。
细胞鉴定倒置显微镜下细胞呈卵圆型铺路石样；免疫组化染色显示VIII因子阳性；透射电镜可见W-P小体。
2、真皮成纤维细胞和角朊细胞的培养取新生儿包皮环切术后包皮组织，处理前在75％乙醇中浸泡1分钟；再将包皮组织，用加有抗生素的PBS清洗，用剪镊去除皮下组织，将组织分切为2mm×10mm的条状，用1.2U/ml的蛋白酶消化液4℃消化24小时；将表皮与真皮分离；收集表皮，用0.25％胰酶消化10分钟，反复吹打以获得角朊单细胞悬液，将角朊单细胞用角朊细胞培养液K-SFM接种，持续培养以获得纯净的角朊细胞；收集真皮，用325U/ml胶原酶消化4小时以获得真皮单细胞悬液，用含10％胎牛血清的DMEM培养液接种培养以获得纯净的真皮成纤维细胞；原代细胞长满70％-80％时，用2.5/L胰酶消化传代，扩大培养。
3、含血管样结构组织工程皮肤的构建取生长状态良好的细胞，将比例为1∶1的真皮成纤维细胞和血管内皮细胞各以1.5×106/ml的密度与提取自小牛皮的I型胶原混合，37℃孵育凝固后，加入培养液培养4天；在其表面以1×107/ml密度接种角朊细胞继续培养3天，将复合了上述细胞的胶原移至气液面进行器官培养，培养1-2周即获得组织工程皮肤，保存备用。HE染色(图1)和免疫组化VIII因子抗体(图2)结果显示，在组织工程皮肤真皮层中含有大量血管样结构，管壁细胞扁平，单层排列，管腔较大，免疫组化结果显示该细胞VIII因子抗体反应阳性，表明该细胞为血管内皮细胞。
4、动物移植实验2％戊巴比妥钠腹腔注射30～50mg/kg麻醉，在Balb/c裸鼠背部切取全层皮作圆形创面，直径1.5cm，以供皮肤移植。取上述含血管样结构的组织工程皮肤，覆盖创面，用线缝合，加压包扎。对照组用不含血管内皮细胞的组织工程皮肤修复皮肤缺损。6周后取标本，4％多聚甲醛固定，脱水透明，石蜡包埋，切片，烤片后脱蜡至水，行免疫组织化学染色(VIII因子抗体)。结果取材时，可见裸鼠皮肤缺损愈合良好，表面光滑，色泽正常(图3)。免疫组化结果显示(图4)，在愈合后皮肤的真皮层含有大量微血管结构，VIII因子抗体反应阳性，表明组织工程皮肤修复效果良好。


本发明涉及一种含有血管结构的组织工程皮肤及其构建方法。其特征是组织工程皮肤含有皮肤成纤维细胞、角朊细胞和血管内皮细胞。组织工程皮肤的构建方法包括上述三种细胞的分离、培养方法和构建含有血管结构的人工皮肤方法，特点是在体外培养皮肤的角朊细胞、成纤维细胞和人脐静脉血管内皮细胞，然后用组织工程方法自体外将这三种细胞按比例混合，构建带有血管的人工皮肤。可以提高组织工程皮肤的移植成活率以及抗感染的能力，进一步扩大组织工程皮肤的应用范围。