一种生产正己醇工程菌的构建方法[0001]【技术领域】，具体地，本发明涉及一种生产正己醇工程菌的构建方法。[0002] 正己醇是一种重要的医药、农药和香料中间体。近年来研究发现它也是一种理想的液体生物燃料，其燃烧热12402千卡/kg，比0#柴油的燃烧热9600千卡/kg高2805千卡/kg，是未来柴油的优良替代品，可以替代矿物燃料。工业正己醇的合成通常是采用乙烯催化控制聚合后，再水解、分离而得，还可由正己酸乙酯还原而得。[0003]目前已能利用生物发酵法制备乙醇、正丁醇、1，3-丙二醇等低碳醇，但是利用生物发酵法制备正己醇的技术还比较少见。美国齐凯姆公司发明了一种间接制备正丁醇和正己醇的方法，在包含碳水化合物源的培养基中进行同型产乙酸发酵得到乙酸酯、乙酸及其混合物，将其中一部分化学转化为乙醇，一部分和乙醇培养基中产酸发酵制备丁酸酯、丁酸、己酸酯、己酸或其混合物，再将其化学转化为丁醇和己醇。采用该方法，可以有70 %的碳源转化为了丁醇和己醇，但是该方法操作过程繁琐，且正己醇选择性并不高(丹.W.沃瑟，CN200980112342.X)。本地生物，如Clostridium Kluyveri,已报道发酵乙醇和醋酸纤维素，不仅产生丁酸、己酸、H2，还产生正丁醇和正己醇，但是，并没有对生物合成正己醇的酶进行定义。张等报道了正己醇合成，通过延伸Atsumi等开发的2-酮酸合成路径，大肠杆菌催化从葡萄糖合成正己醇。 Liao研究小组等人通过设计具有NAPH和乙酰CoA驱动力的正丁醇人工途径，获得新型大肠杆菌合成细胞工厂，正丁醇产量可达30g/L。美国科学家通过引入六碳化合物的合成酶Bktb (β-ketothiolase)，延长改造正丁醇人工合成路径，开发出一种新型的正己醇合成细胞工厂，即乙酰辅酶A工程菌正丁醇路径合成正己醇，大肠杆菌工程菌催化，从葡萄糖直接合成正己醇，并初步研究了己醇合成酶及其影响因素(YasumasaDekishimaj Ethan 1.Lanj Claire R.Shenj et.al, Journal of the American ChemicalSociety, 2011,133:11399-11401)。但是目前由于Bktb酶活不高造成正己醇合成途径碳流较低，使得合成细胞工厂产物仍以正丁醇为主。后期计划通过定向改造Bktb，提高胞内己醇前体物酮基己酰CoA和可用NADH的量来进一步增加正己醇的生产。[0004]过去一直没有微生物能由葡萄糖合成高级醇类，现在研究人员已能通过基因工程手段对大肠杆菌进行改造，使其能够从葡萄糖合成长链醇类，包括异丁醇、2-甲基-1-丁醇或3-甲基-1-丁醇。我们认为，可以通过选择性地操纵基因，设计微生物，以合成许多不同的燃料和化学品。本发明利用基因工程方法，将梭菌属Fe-氢酶基因hydA (GenBank登录号:EU590683)和地衣芽孢杆菌β -葡聚糖酶基因lie (GenBank登录号:ΑΥ225317)的重组基因hyd-lic插入大肠杆菌构建了正己醇合成工程菌。[0005]
本发明提供了一种生产正己醇工程菌的构建方法。[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案如下:
设计引物，pUC19-hydA质粒和pUCm-T_lic质粒分别PCR扩增,在连接酶作用下连接成为重组DNA的基因hyd-lic，
hyd-lic 连接到载体 pTE28aT7，得到质粒 pTE28aT7-hyd_lic，
质粒pTE28aT7-hyd_lic转化至宿主菌P.pastoris kM71感受态细胞中，利用YPD/G418平板筛选高拷贝转化子，摇瓶发酵。比色测定法测定酶活。
[0007]工程菌生产正己醇活性检测:收集重组菌发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，检验产己醇活性如下:用pH3~8的醋酸缓冲液配制20%~60%的纤维素半水解物溶液，适量粗酶液，370C反应24h，再55°C反应12h，然后煮沸lOmin，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物。 本发明制备的工程菌应用于正己醇发酵，检测到了正己醇的生成，工程菌酶活达83U/mL，发酵产物正己醇含量最高可达35g/L。
[0008]
下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。
[0009]实施例1、生产正己醇工程菌的制备
菌株和质粒:大肠杆菌质粒pTE28aT7购自大连Katara公司、大肠杆菌质粒pUC19购自Promega公司、pUCm_T、P.pastoris kM71购自Invitrogen公司。质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程公司，胶回收试剂盒购自TaKaRa公司，限制性核酸内切酶BamH1、EcoR1、Not1、Xoh1、SacI和T4 Iigase连接酶购自TakaRa公司。遗传霉素G418购自上海生工生物工程公司。其他试剂为国产分析纯。
[0010]培养基:MD、YPD、BMGY, BMMY培养基，重组酵母常用培养基。
[0011]主要仪器:PCR仪、凝胶成像仪和蛋白电泳仪购自美国BIO-RAD公司，DYY-6C型电泳仪购自北京六一仪器厂，高效液相`色谱仪和液质联用仪购自美国沃特斯公司。
[0012]表达载体的构建:
按照已发表的梭菌属Fe-氢酶基因hydA (GenBank登录号:EU590683)的cDNA序列，设计正反引物:正向引物Pl (5’ -ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCG-3’);反向引物P2(5’ -ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’)，正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有NotI酶切位点，以引物Pl，P2对重组质粒pUC19-hydA PCR扩增获得hydl基因片段。同样，设计地衣芽孢杆菌葡聚糖酶基因lie (GenBank登录号:ΑΥ225317)引物，Ρ1’(5，-ATGATGACCGACGATGAGAT-3’)，Ρ2’( 5 ’-AATGAGCGTGAAGTGGAGTGGAGT-3’)。正向引物带有BamHI酶切位点，反向引物带有XohI酶切位点，以引物PI’，Ρ2’，，对重组质粒pUCm-T-lic PCR扩增获得Iicl基因片段。将hydl和Iicl基因片段，在连接酶T4 Iigase的作用，连接成为重组DNA的基因hyd-lic。连接到大肠杆菌载体pTE28aT7，得到表达质粒pTE28aT7-hyd-lic。
[0013]PCR扩增条件:94°C 30s, 56°C 30s，72°C 2min，30个循环。1%葡聚糖凝胶电泳回收PCR产物。
[0014]工程菌的构建以及高拷贝重组子的筛选:
将表达载体pTE28aT7-hyd-lic，经Sac I酶切线性化后回收含有目的基因的条带，电击转入P.pastoris kM71感受态细胞中，在MD平板长出单克隆，再经YPD/G418平板筛选多拷贝转化子，G418浓度筛选梯度依次为0.5、1、2 mg/mL,高拷贝转化子经PCR鉴定。
[0015]PCR扩增条件:94°C 30s, 56°C 30s，72°C 2min，30个循环。1%葡聚糖凝胶电泳回收PCR产物。
[0016]摇瓶发酵产正己醇发酵工程菌:
将鉴定正确的单菌落接种至5 mL Yro培养基，200r/min，30°C培养16 h，以10%的接种量接入BMGY培养基(50mL培养基/250mL三角瓶)，30°C培养24 h，离心收集全部菌体，转入BMMY培养基(50mL培养基/250mL三角瓶)，30°C，培养120h，每24h补加0.5%的甲醇，并取样200uL，离心收集上清进行12% SDS-PAGE确定目的蛋白的表达存在形式。
[0017]产正己醇工程菌的合成酶活测定:比色测定法实施例2、产正己醇工程菌的产己醇活性检测
收集重组菌发酵培养的上清液经聚乙二醇浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，检验产己醇活性如下:用PH4.3的醋酸缓冲液配制45%的纤维素半水解物溶液10mL，400uL粗酶液，37°C反应24h，再55°C反应12h，然后煮沸lOmin，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物。
[0018]HPLC条件:示差折光检测器，色谱柱:Hypersi 1NH2 , 250mm x 4.6mm;柱温:30°C ;池温(检测器):30°C ;流动相:70%乙肪；流速:1 mL/min;进样量:5μ?。
[0019]质谱条件:离子方式:ESI_、ESI+，离子源温度:100°C，脱溶剂气温度:250°C，质量范围:100~800 m/z,选择离子:ESI+:365.5Da;ES1-:341.4Da,光电倍增器电压:650Volts, Analyser Vacuum:2.6e-5mBar, Gas Flow: 4.21it/hr。
[0020]纤维素水解:
稀酸处理后，里氏木霉中的纤维素酶水解处理纤维素，500C，PH5.6，水解6-12h，获得纤维素水解物。
[0021]产醇发酵及产物提取:
两步法发酵:前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入高产正己醇工程菌菌株的菌落。37°C、120r/min培养24h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，55°C、150r/min振荡培养12h。4°C，6000g无菌离心lOmin，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4°C，6000g无菌离心12min，弃上清。分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100ml两步法发酵培养基的500ml三角瓶中，分别加入微量元素溶液0.lml，55°C、150r/min振荡培养40h。
[0022]正己醇的提取:
发酵收获后，收集菌体，过滤丝状菌体，用萃取剂萃取，在60°C水浴搅拌加热2h。再减压蒸馏，回收萃取剂，并得到产物正己醇。