生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法

于洪巍, 陆文强, 石一军

2014年1月15日

2012年6月15日

2012年6月15日

浙江新和成股份有限公司, 上虞新和成生物化工有限公司

C12N15/09GK103509728SQ201210201141

工程菌 q 辅酶 构建 生产

1.一种生产辅酶QlO的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下 从类球红细菌中提取基因组DNA ； 用聚合酶链式反应扩增出bchG的同源基因； 用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体； 重组载体转化至大肠杆菌S17-1中； 将大肠杆菌S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了叶绿素合成基因bchG的工程菌2.根据权利要求1所述的生产辅酶QlO的工程菌的构建方法，其特征在于，所述的bchG基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示3.根据权利要求1所述的生产辅酶QlO的工程菌的构建方法，其特征在于，所述广宿主质粒为克隆载体pK18mobsacB4.一株利用如权利要求1-3任一所述的构建方法得到的工程菌，其特征在于，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为sphaeroides ;命名为NHU-ZAA菌株；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间2012年4月13日；保藏编号CGMCC N0.59995.利用如权利要求4所述的工程菌生产辅酶QlO的方法，其特征在于，具体步骤如下 挑取所述NHU-ZAA菌株单克隆接种于含IOmL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在26-34°C培养23h，获得一级种子； 将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在26_34°C，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子； 将二级种子以1%的比例接种至含IOOmL发酵培养基的500mL中，在26_34°C，200rpm的条件下培养120h，收集菌液；菌液中提取辅酶Q106.利用如权利要求5所述的生产辅酶QlO的方法，其特征在于，所述的种子培养基每1OOmL中含有=(NH4)2SO4 0.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物0.14g, NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl2 0.003g, MnSO4.0.0OOlg, CaCO3 0.8g，维生素 BI 0.1y g，维生素 K 0.1y g，维生素 A 0.15 y g ;pH 调节为.7.27.利用如权利要求5所述的生产辅酶QlO的方法，其特征在于，所述的发酵培养基每1OOmL 种含有(NH4)2SCM 0.3g, NaCl 0.28g，葡萄糖 4g, KH2PO4 0.15g，味精 0.3g, MgSO4.0.63g，玉米浆 0.4g，FeSO4 0.12g，CoCl2 0.005g, CaCO3 0.6g，维生素 BI 0.1u g,维生素 K.0.1u g,维生素 A 0.15u g ；pH 调节为 7.2

，公开了一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法，构建方法如下a.从类球红细菌中提取基因组DNA；b.用聚合酶链式反应扩增出bchG的同源基因；c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；d.重组载体转化至大肠杆菌S17-1中；e.将大肠杆菌S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了叶绿素合成基因bchG的工程菌本发明提供一种通过敲除类球红细菌叶绿素合成基因提高辅酶Q10产量的方法，能将辅酶Q10的合成能力提高约15%，适合辅酶Q10的大规模工业化生产

本发明涉及生物【专利说明】生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法