一种生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种生产辅酶QlO工程菌的构建方法、工程菌及其应用。[0002]辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，不同来源的辅酶Q其侧链异戊烯单位的数目不同，人类和哺乳动物是10个异戊烯单位，故称辅酶Q10。[0003]辅酶QlO是生物细胞呼吸链中的重要递氢体，是一种良好的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近，研究者发现CoQlO具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。[0004]辅酶QlO的制备方法主要有三种，即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶QlO含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较成熟，主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，合成生物活性高的CoQlO尚未达到工业化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶QlO成本低、无光学异构体，生物学活性高，大规模生产应用效果好。[0005]常用的微生物包括红螺菌，土壤杆菌，类球红细菌，根瘤菌等。其中类球红细菌培养简单，是辅酶QlO高效的生产菌之一。辅酶QlO分子结构由两部分组成:醌环部分和异戊二烯侧链部分。醌环骨架由分支酸途径合成，前体是对羟基苯甲酸。侧链由异戊二烯途径合成，侧链的长短决定了辅酶Q的种类的不同。在类球红细菌中，异戊二烯焦磷酸异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)与9分子异戊二烯焦磷酸(IPP)依次在栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶及聚十异戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十异戊二烯焦磷酸。十异戊二烯焦磷酸和对羟基苯甲酸缩合形成辅酶QlO的前体物，该前体物苯环经修饰之后形成目标产物辅酶Q10。在微生物中，合成IPP主要有两条途径，分别是真核生物的甲羟戊酸途径(MVP)和原核生物中的非甲羟戊酸途径(MEP)。在类球红细菌中，IPP由MEP途径合成。[0006]目前国内相关研究主要集中在多基因表达强化大肠杆菌上。尚无专利有关于通过基因过表达强化类球红细菌辅酶QlO的合成能力。

[0007]本发明针对微生物发酵法生产辅酶QlO产量较低且生产成本较高等缺点，提供了一种能显著提高辅酶QlO产量的生产辅酶QlO工程菌及其构建与应用方法。通过引用该方法，可以极大提高应用微生物发酵法生产辅酶QlO的产量，降低了辅酶QlO的生产成本。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案:
[0009]一种生产辅酶QlO的工程菌的构建方法，具体步骤如下:[0010]a.从类球红细菌中提取基因组DNA ;
[0011]b.用聚合酶链式反应扩增出DXS和DDS的同源基因；
[0012]c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；
[0013]d.重组载体转化至大肠杆菌S17-1中；
[0014]e.将S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了基因DXS和DDS的工程菌。
[0015]作为优选，所述的DXS基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示，所述的DDS基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0016]作为优选，所述广宿主质粒为克隆载体pBBRlMCS-2，所述质粒的启动子为tac启动子。
[0017]一株利用上述构建方法得到的用于生产辅酶QlO的工程菌，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides ;命名为NHU-ZDD菌株；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间:2012年4月13日；保藏编号=CGMCCN0.5998。
[0018]应用上述工程菌生产辅酶QlO的方法，具体步骤如下:
[0019]f.挑取NHU-ZDD菌株单克隆接种于含IOmL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在26-34°C培养23h，获得一级种子；
[0020]g.将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在26_34°C，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子；
[0021]h.将二级种子以1%的比例接种至含IOOmL发酵培养基的500mL中，在26_34°C，200rpm的条件下培养72h后，添加异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，诱导表达48h ；收集菌液；可通过常规方法提取辅酶Q10。
[0022]作为优选，所述的种子培养基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物 0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g，K2HPO40.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO40.01gjCoCl2 0.003g，MnSO40.0OOlg，CaCO30.8g，维生素 ΒΙΟ.1 μ g，维生素 K 0.1 μ g，维生素A0.15 μ g ;ρΗ 调节为 7.2。
[0023]作为优选，所述的发酵培养基每IOOmL种含有:(NH4)2SO40.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO4 0.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米浆 0.4g，FeSO4 0.12g，CoCl2 0.005g，CaCO3 0.6g，维生素 B10.1 μ g,维生素 K 0.1 μ g,维生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 调节为 7.2。
[0024]作为优选，所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度为0.0Ol-lOmM。
[0025]所述类球红细菌从河边污泥中分离得到；大肠杆菌S17-1购自美国模式培养物集存库，编号ATCC47055。
[0026]本发明由于采用了以上技术方案，具有以下显著的技术效果:
[0027]本发明通过选择MEP途径中的关键酶DXS、DDS的过表达，完成对EMP途径相关代谢途径的改造。经过上述改造生产的工程菌，具有较高的辅酶QlO合成能力，相比现有用于生产辅酶QlO的类球红细菌或类似菌种，该工程菌具有更高的辅酶QlO生产能力。将该工程菌应用于辅酶QlO的微生物发酵法生产，能够在不改变原有的生产过程，工艺步骤，培养条件的情况下，使微生物发酵法生产辅酶QlO的生产能力在原有基础上提高达30%，具有较高的应用价值和工业实用性。
[0028]保藏信息[0029]保藏名称:类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides ;命名为NHU-ZDD菌株；
[0030]保藏时间:2012年4月13日；
[0031]保藏编号:CGMCCN0.5998 ；
[0032]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0033]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述:
[0034]实施例1生产辅酶QlO的工程菌的构建方法
[0035]一、重组质粒的构建
[0036]1.设计引物。用Primer5引物设计软件设计引物序列。
[0037]克隆基因DXS，其中，
[0038]上游引物DXSF:
[0039]CATGCCATGGGCATGACCGACAGACCCTGCAC ；
[0040]下游引物DXSR: CGGGATCCCTCCTCCGGATCAGGCGCG ；
[0041]上游引物添加酶切位点Ncol，下游引物添加酶切位点BamHI。
[0042]克隆基因DDSF:
[0043]上游引物DDSF:
[0044]GAAGATCTGAGGAGACGGGATGGGATTGGACGAGGTT ；
[0045]下游引物DDSR:
[0046]CCCAAGCTTGAAAGGGATCAGGCGATGCG ；
[0047]在上游引物中包含酶切位点BglII和SD序列GAGGAGA，下游引物包含酶切位点
HindIII1
[0048]2.提取类球红细菌基因组DNA (所用试剂均来自Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒)
[0049]I)吸取0.5_4mL类球红细菌(最多5父109个细菌)，13500印111离心I分钟，尽可能
吸净上清。
[0050]2)加入100 μ LEL Buffer,使用tip头吹打均匀。
[0051]3) 37 °C温育 40 分钟。
[0052]4)加入 100 μ LRS Buffer,随后加入 10 μ LPK Solution,充分混匀。
[0053]5)于56°C环境中温浴15分钟，然后移出。
[0054]6 )加 200 μ L GABuffer 并混合均匀。
[0055]7)于12000rpm离心I分钟。将上清液转移到一个新的1.5mL离心管。
[0056]8)加 400 μ L 的 BA Buffer,并混合均匀。
[0057]9)将混合液体转移至Spin column。于1000Orpm离心I分钟,并弃去接液管中液体。
[0058]10)向 Spin column 中加入 500 μ L 的 G Binding Buffer。于 1000Orpm 离心 30
秒，并弃去接液管中液体。
[0059]11)向 Spin column 中加入 500 μ L 的 Wash Buffer。于 1000Orpm 离心 30 秒，并弃去接液管中液体。
[0060]12)再向 Spin column 中加入 500 μ L 的 Wash Buffer。于 1000Orpm 离心 30 秒，并弃去接液管中液体。
[0061]13)再次将Spin column于1000Orpm离心I分钟，并将Spin column转移至一个新的1.5mL离心管。
[0062]14)向 Spin column 中加入 100 μ L Elution Buffer,并于室温温育 1 分钟。
[0063]15)于12000rpm离心I分钟,并弃去Spin column。1.5mL离心管中剩余液体即含
有基因组DNA。
[0064]3.进行PCR扩增DXS基因
[0065]用高保真酶PrimeSTAR(购自大连宝生物公司)扩增,采用标准反应体系:GC缓冲液25μL，水16μL，(dNTP混合液4 μL，上游引物DXSF 1.5μ L (10uM)，下游引物DXSR 1.5μ L(10uM)，所提取的基因组 DNA 1.5 μ L，PrimeSTAR 酶 0.5 μ L。
[0066]扩增程序为:30个循环，每个循环包含98 V变性10秒，60 V退火5秒，72 °C延伸2分钟。
[0067]4.PCR产物和质粒进行酶切(所用试剂来自AxyPrep PCR清洁试剂盒)
[0068]将PCR产物取出，各加入150 μ L PCRA，然后均加入离心柱中，取一支空白离心柱加入 400 μ L 水，一起 13500rpm 离心1 分钟，加入 BUFFER W2 700 μ L, 13500rpm 离心 I 分钟，弃清液，再加入BUFFERW2 700 μ L，再13500rpm离心I分钟。弃清液，再空离I分钟，彻底甩干离心柱。加入34 μ L Eluent，然后取2支离心管。一支加入DXS34 μ L，另一只加入pBBRlMCS-234 μ LjNcoI 和 BamHI 各加入 1 μ L，加入 4μ L BUFFER。放入 37°C 水浴酶切 1.5小时。
[0069]5.电泳
[0070]1)制备1%琼脂糖凝胶:称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20mL 1 X TAE,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。冷却到65°C左右加入GelGreen染色剂3 μ L。
[0071]2)胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65°C左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加IXTAE电泳缓冲液至没过胶板l_2mm为止。
[0072]3)加样:在点样板上将第4步中酶切的PCR产物和质粒pBBRlMCS-2与上样缓冲液混合，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于IX。用10 μ L微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。并加入10 μ L DNAmarker-D作为对照。
[0073]4)电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约Icm处时，停止电泳。
[0074]5)电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，显示2kb处有明显条带。证实DXS的PCR扩增成功。[0075]6.割胶回收(所用试剂来自AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)
[0076]I)割下对应条带的胶。
[0077]2)将胶放入1.5mL离心管中，计算凝胶重量。(需提前记录离心管重量)该重量作为一个凝胶体积(IOOmg=IOO μ L)。再加入3个凝胶体积的BUFF DE-A，混合后75°C加热融化，约6-8分钟，期间间断混合。再加入0.5个BUFFER DE-A体积的BUFFER DE-B,混合均匀。
[0078]3)将混合液转入DNA制备管。13500rpm离心I分钟，弃滤液。加入500 μ L BUFFERffl, 13500rpm离心30秒，弃滤液。加700 μ LBUFFER W2, 13500rpm离心30秒，弃滤液。再加700 μ L BUFFER W2, 13500rpm离心I分钟，弃滤液。然后再13500rpm离心I分钟。将制备管置于洁净的1.51^离心管中，在制备膜中央加入25 4 1^11^社，室温静置1分钟，13500rpm离心I分钟洗脱DNA。
[0079]7.T4连接酶连接，构建重组质粒
[0080]取割胶回收得到的DXS基因5.5 μ L，pBBRlMCS-2质粒3 μ L，T4连接酶(λ 5 μ L，T4连接酶BUFFER I μ L混合，22 °C水浴连接30分钟。
[0081]8.PCR 扩增 DDS 基因
[0082]用高保真酶PrimeSTAR(购自大连宝生物公司)扩增,采用标准反应体系:GC缓冲液25 4 1^，水16 4 1^，(1见13混合液4 4 1^，上游引物005卩 1.5μ L (10uM)，下游引物 DDSR 1.5μ L(10uM)，所得基因组 DNA 1.5 μ L，PrimeSTAR 酶 0.5 μ L。
[0083]扩增程序为:30个循环，每个循环包含98°C变性10s，60 °C退火5s，72 °C延伸2min。
[0084]9.PCR产物和质粒进行酶切(所用试剂来自AxyPrep PCR清洁试剂盒)
[0085]将PCR产物取出，加入150 μ LPCRA，然后均加入离心柱中，取一支空白离心柱加入400 μ L水，一起13500rpm离心I分钟，加入BUFFER W2700 μ L, 13500rpm离心I分钟，弃清液，再加入Ι27(Κ)μ?，再13500rpm离心I分钟。弃清液，再空离I分钟，彻底甩干离心柱。加入34 μ L Eluent，然后取2支离心管。一支加入DDS 34 μ L，另一只加入已重组有DXS基因的口88町]?^-234 4 1^重组载体，88111和出11(11111各加入BUFFER。放入37°C水浴酶切1.5小时。
[0086]10.电泳
[0087]I)制备1%琼脂糖凝胶:称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20mL I X TAE,瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。冷却到65°C左右加入GelGreen染色剂3 μ L。
[0088]2)胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65°C左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加IXTAE电泳缓冲液至没过胶板l_2mm为止。
[0089]3)加样:在点样板上将第9步中酶切的PCR产物和pBBRlMCS-2质粒与上样缓冲液混合，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于IX。用10 μ L微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。并加入10 μ L DNA marker-D作为对照。
[0090]4)电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约Icm处时，停止电泳。
[0091]5)电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，对比mark显示Ikb处有明显条带。证实DDS的PCR扩增成功。
[0092]11.割胶回收(所用试剂来自AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)
[0093]I)割下对应条带的胶。
[0094]2)将胶放入1.5mL离心管中，计算凝胶重量。(需提前记录离心管重量)该重量作为一个凝胶体积(IOOmg=IOO μ L)。再加入3个凝胶体积的BUFF DE-A，混合后75°C加热融化，约6-8分钟，期间间断混合。再加入0.5个BUFFER DE-A体积的BUFFER DE-B,混合均匀。
[0095]3)将混合液转入DNA制备管。13500rpm离心I分钟，弃滤液。加入500 μ L BUFFERffl, 13500rpm离心30秒，弃滤液。加700 μ LBUFFER W2, 13500rpm离心30秒，弃滤液。再加700 μ L BUFFER W2, 13500rpm离`心I分钟，弃滤液。然后再13500rpm离心I分钟。将制备管置于洁净的1.51^离心管中，在制备膜中央加入25 4 1^11^社，室温静置1分钟，13500rpm离心I分钟洗脱DNA。
[0096]12.T4连接酶连接，构建最终重组质粒
[0097]取割胶回收得到的DDS基因5.5yL，已重组DXS基因的pBBRlMCS-2重组质粒
3μ L，T4连接酶0.5 μ L，Τ4连接酶BUFFER I μ L混合，22°C水浴连接30分钟。将扩增好的片段克隆至载体上DXS基因后面，获得重组载体Ptac-DXS-DDS。基因DXS和基因DDS在同一个tac启动子的控制下串联表达。
[0098]二、重组质粒转化到大肠杆菌S17-1
[0099]取出大肠杆菌S17-1感受态2管，冰浴10分钟后加入重组载体Ptac_DXS_DDS。冰浴20分钟，热击90秒，冰浴5分钟，加入600 μ LLB培养基。37°C培养45分钟后5000rpm离心5分钟，弃300 μ L上清液，将剩余液体涂布到卡那平板上。
[0100]二、接合转移
[0101]1.接种类球红细菌。
[0102]2.第二天晚上接种已转化大肠杆菌S17-1的阳性克隆。
[0103]3.第三天早上转接大肠杆菌S17-1，每管5mL LB培养基加入100 μ L菌液，并加入5μ L卡那霉素，放入37°C摇床培养。培养3-4小时。
[0104]4.取4mL类球红细菌菌液和2mL大肠杆菌菌液，分装至2mL离心管中，每管lmL。
[0105]5.5000rpm 离心 5 分钟。
[0106]6.各弃上清，加入ImL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。
[0107]7.5000rpm 离心 5 分钟。
[0108]8.各弃上清，加入ImL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。
[0109]9.按类球红细菌和大肠杆菌的比例为100 =10,100 =20,100 =50,100:100的比例混匀菌液。
[0110]10.将混合液浇注于滤膜中心区域。
[0111]11.将LB平板小心移至32°C培养箱中培养过夜。
[0112]12用镊子将滤膜转移至2mL离心管中。
[0113]13.用700 μ L LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散。
[0114]14.分装涂布到含NK的平板培养基上，每板350 μ L菌液。放入32°C培养箱中培养72小时。
[0115]四、接合转移完检验是否为阳性克隆
[0116]1.挑取2个生长良好的菌落培养30-48小时。
[0117]2.转接后2~4小时提取质粒(所用试剂来自AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)。
[0118]1)取2mL菌液加入离心管。13400rpm离心I分钟，弃上清。再加入2mL菌液，13400rpm离心I分钟，弃上清。
[0119]2)加入250yL Buffer SI悬浮细菌沉淀。不留小的菌块。需确认S I中已加入
RNaseA0
[0120]3)加250 μ L Buffer S2，温和并充分上下翻转4_6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5分钟。BufferS2需尽量减少与空气的接触。
[0121]4)加350 μ L Buffer S3。温和并充分的上下翻转混合6-8次，13400rpm离心14分钟。
[0122]5)取上清液转至制备管，置于2mL离心管中，13400rpm离心I分钟，弃上清。
[0123]6)加入 500 μ L Buffer Wl, 13400rpm 离心 I 分钟，弃上清。
[0124]7)加 700 μ L Buffer W2，13400rpm 离心 I 分钟，弃上清。再加 700 μ L Buffer W2,13400rpm离心I分钟，弃上清。需确认Buffer W2已加入无水乙醇。
[0125]8)然后13400rpm空离I分钟，将制备管移入新的1.5mL离心管中，加入80 μ L已预热到65度的Eluent，室温静置I分钟，13400rpm离心I分钟。
[0126]3.酶切后进行电泳检测。证实为阳性克隆。
[0127]其中，所述平板培养基(每IOOmL):酵母提取物0.8g，FeSO40.01g, K2HPO4 0.13g，CoCl2 0.003g,NaCl 0.2g,MnSO4 0.0OOlgjMgSO4 0.025g，葡萄糖 0.3g，维生素 Β10.1 μ g，维生素K 0.1 μ g，维生素A 0.15 μ g，琼脂粉1.5g ；pH调节为7.2。
[0128]实施例2: IPTG诱导表达
[0129]一、挑取NHU-ZDD菌株单克隆接种于含IOmL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在30°C培养23h，获得一级种子；
[0130]二、将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在30°C，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子；
[0131]三、将二级种子以1%的比例接种至含IOOmL发酵培养基的500mL中，在30°C，200rpm的条件下培养72h后，添加IPTG至终浓度ImM，(也可选0.0OlmM或IOmM)诱导表达48h。收集菌液。并采用常规方法提取其中的辅酶Q10。
[0132]种子培养基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米浆0.05g,酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO40.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl20.003g，MnSO4 0.0OOlg, CaCO3 0.8g，维生素 B10.1 μ g，维生素 K 0.I μ g，维生素 A0.15μ g ;ρΗ 调节为 7.2。
[0133]发酵培养基每IOOmL 种含有:(NH4) 2S040.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO40.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米浆 0.4g，FeSO40.12g，CoCl20.005g，CaCO30.6g，维生素BI0.1 μ g,维生素 K 0.I μ g，维生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 调节为 7.2。
[0134]实验例:HPLC检测比较菌株改造前后同等培养条件下辅酶QlO产量的对比，见表I:
[0135]表1菌株改造前后辅酶QlO产量对比
[0136]