专利名称：苏云金芽胞杆菌基因组合、其工程菌及其制备方法苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。在形成芽胞的同时，能产生由一种或几种杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体(parasporal crystal)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)又称S -内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中 得到了最广泛的应用。迄今为止已有人从不同的Bt菌株中克隆了 605种杀虫晶体蛋白基因，根据杀虫晶体蛋白氨基酸的同源性，可将他们分为71大类，分属226种模式基因(http://www. biols.susx. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)0其中cry3A对鞘翅目叶甲科害虫(如大猿叶甲[Colaphellus bowringi]和检疫性害虫马铃薯甲虫[Leptinotarsa decemlineata]等)具有特异毒性，该基因编码73kD的蛋白，可不依赖芽胞形成晶体，在昆虫中肠液的作用下，被降解为 55kD 的毒性多妝(Krieg A, Huger AM, Langenbruch GA, et al. , 1983 Bacillusthuringiensis var. tenebrionis:ein neuer gegenuber larven von Coleopterenwirksamer pathotyp. Z. Ang. EntomoI. , 96:500-508)。cry8 类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。目前已发现38种cry8类基因，编码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。用胰蛋白酶处理可生成60kD的毒性核心片段(Whiteley, HR and Schnepf HE, The molecular biology of parasporal crystalbody formation in B. thuringiensis, Annu. Rev. Microbiol. , 1986, 40:549;IbrahimMA, Griko N, Junker M, Bulla LA, Bacillus thuringiensis A genomics and proteomicsperspective, Bioeng Bugs, 2010, I (I) :31-50.)。其中美国 Mycogen 公司分离的 Cry8Aal和Cry8Bal对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性(Michaels TE, et al. ,Bacillusthuringiensis toxins active against scarab pests, 1994，USP5554534)。美国从 Bt菌株中分离了两种基因cry8Bbl和cry8Bcl基因，发现对西方玉米根叶甲(Diabroticavirgifera, Western corn rootworm)具有显著的杀虫效果,并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD,Kahn Tff, Sims LE. Genes encoding novelproteins with pesticidal activity againstco leopterans. 2002. WO 02/34774A2)。在我国筛选获得了对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)、铜绿丽金龟(A. corpulenta)、四纹丽金龟(Pop illia quadri guttata )、蒙古 _ 全龟(A. mongo I i ca )、和苹毛 _ 金龟(ProagoperthaIucidula)等害虫幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株HBF-I (冯书亮等，《中国生物防治》，2000，16(2) 74-78);《植物保护》2006，33 (4) :417_422)。中国农业科学院植物保护研究所在2003年首次从Btl85菌株中克隆到cry8类基因-cry8Eal、cry8Fal，该基因对暗黑觸金龟(Holotrichia parallela)具有高活力(Yu H，Zhang J, Huang D, Song F. CurrentMicrobiology. 2006，53:13-17)。随后又从 HBF-1 中克隆到 cry8Ca2 基因(Shu C，LiuR, Wang R, Zhang J, Feng S，Huang D, Song F. 2007. Current Microbiology. 55:492-496)。2007年，从BtSU-4克隆到cry8Hal、cry8Ial (闻贵欣博士学位论文，2010)，从HBF-18中克隆至丨J cry8Gal(Shu C，Yan G,ffang R, Zhang J, Feng S, Huang D, Song F, Characterizationof a novel cry8 gene specific to Melolonthidae pests:Holotrichia oblita andHolotrichia parallela, Appl Microbiol Biotechnol.2009;84(4):701-707)。。 目前，cry8Ca2 基因(专利号ZL200410009807. 8), cry8Eal (专利号ZL200410009808. 2)、cry8Fal (ZL200710090542. 2)基因已经获得国家发明专利保护，cy8G (专利号ZL200710118289. 7)和 cry8H (专利号ZL2007 I 0120020.2)。为了扩大杀虫谱，延缓昆虫抗药性，国内外科研人员利用生物工程的方法，构建了一些苏云金芽胞杆菌工程菌。如美国Ecogen公司首次利用质粒结合转移等细胞工程手段构建了含有cry3B和crylCa基因、对鳞翅目和鞘翅目害虫有活性的Bt工程菌(Sick A, et al. , 1990. Nucleotide sequence of a coleopteran-active toxin froma new isolate of B. t. subsp. tolworth. Nucl. Acids Res. 18; Entwistle, P. F. , 1993.An Environmental Biopesticide:Theory and Practice. Wiley Chichester Press. U.K. 125-146. X 美国 Mycogen (Frank.H.Gaertner. et al.Bacillus thuringiensisisolate. US Patent,NO.4910016. Mar. 20, 1990.)公司和 Sandoz (Dimitri-Karamata.et al.Insecticidal hybrid bacteria from B. t.subsp. kustaki and B.t.subsp.tenebrionis. US Patent NO. 4797279. Jan 10，1989.)公司用上述同样的方法研制出 MT 104和B-18013，分别用于粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和马铃薯甲虫的防治。在我国，大量调查表明，蛴螬在地下害虫中的危害居首位，其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主，占总地下害虫量的70-80%以上。据统计每年全国蛴螬发生面积约I亿亩，严重年份曾达3亿2千万亩，产量损失高达20 %以上，有些地块甚至绝产(许婷婷、江晨、宫清轩，陈金凤，曲明净.青岛市花生田蛴螬发生与无公害防治研究.花生学报，2010，39(1):42-44. )。2007年8月中下旬在山东省菏泽地区挖查，蛴螬虫口密度平均为8. 7头/m2，最高达22头/m2 (王爱东.农田蛴螬发生及综合防治技术，现代农业科技.2008)，主要种类有暗黑觸金龟(Holotrichia parallela)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)、华北大黑鳃金龟(H. oblita);草坪受到蛴螬为害时，轻者部分植株变黄，严重时植株枯死，在北京地区，为害最严重的蛴螬虫口密度平均为118头/m2，最高205头/m2，其中黄褐丽金龟、铜绿丽金龟和华北大黑鳃金龟幼虫数量占90%以上(罗晨，郭晓军，张芝利.京郊草坪蛴螬的种类和为害特点.昆虫学报，2008,51 (1):108-112.)。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区，主要危害粮食、油料等作物；其它地区的危害情况也很严重，如危害甘蔗的蛴螬，在广东、广西、云南、四川、福建等地普遍发生；在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区，蛴螬的发生也很严重(魏鸿钧等，《中国地下害虫》，上海上海科学技术出版社，1989，1-41 ;王永祥等，“冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”，《河北师范大学学报》(自然科学版)，1998，22(2) : 268-270)。我国多年来为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学、物理等综合防治策略，在一定程度上起到了积极的作用，已经将这类害虫危害控制在较低水平。自2005年起，国内高毒力、高残留剧毒化学农药相继禁用，使得地下害虫的防治面临新的问题，蛴螬从过去为害较轻的次要害虫逐渐发展成主要害虫，在局部地区猖獗危害，直接威胁到我国粮食、油料等作物的安全生产。目前我国油料作物中种植面积居第二位的花生，占世界花生总产量的35%左右，居世界首位，年出口收入达207亿美元，仅2011年全国花生种植面积达到470万公顷，总产量为1434万吨。随着近两年来全球粮油价格飞涨，花生等重要油料作物的高产稳产是关系到社会稳定、粮食和食品安全的头等大事。当前对花生生产威胁最大的就是虫害一蛴螬，直接造成减产和影响花生籽粒品质，危害十分严重，而且在大田中存在多种蛴螬混发的现象。因此，开辟新的有效防治途径，已成为当务之急。cry3A对叶甲科害虫(如大猿叶甲和检疫性害虫马铃薯甲虫等)具有杀虫活性，crySC对铜绿丽金龟有杀虫活性，本课题组将含cry3A基因的穿梭质粒pSTK_3A转入含cry8C基因的野生菌株HBF-I中，获得工程菌3A-HBF，该工程菌不但获得了对马铃薯甲虫、大猿叶甲和铜绿丽金龟的杀虫活性，而且对大猿叶甲和铜绿丽金龟的活性有约2倍获此能够的提高，推测这两种基因具有协同增效作用(Yan GX, Song FP, Shu CL, Liu JJ, Liu CQ, Huang DF, Feng SL, Zhang J. (2009)An engineered Bacillus thuringiensis strain with insecticidal activity againstScarabaeidae(Anomala corpulenta)and Chrysomelidae(Leptinotarsa decemlineataand Colaphellus bowringi). Biotechnol Lett. 31:697-703.)。本实验室分离筛选的 Bt 野生菌株Btl85含有对鞘翅目暗黑鳃金龟良好杀虫活性的crySEa基因，通过同源重组的方法，将对铜绿丽金龟有良好杀虫活性的crySCa基因转到Btl85中，得到了工程菌株BI0T185，由于cry8Ca基因对cry8Ea的协同增效作用，使得该菌株对暗黑鳃金龟的杀虫活性增加了 12. 4倍(Liu J, Yan G, Shu C，Zhao C，Liu C，Song F，Zhou L, Ma J, Zhang J, HuangD. Construction of Bacillus thuringiensis engineered strain with high toxicityand broad pesticidal spectrum against coleopteran insects. Appl MicrobiolBiotechnol. 2010, 87 (I) : 243-249)，本研究将在此基础之上，通过基因重组技术，导入新的杀虫基因，拓宽其杀虫谱，提高杀虫毒力，具有非常广阔的应用前景。
本发明的目的之一是发现可以提闻杀虫毒力和扩大杀虫谱的有效的杀虫蛋白和基因组合，以获得毒力更高、杀虫谱更宽的苏云金芽胞杆菌工程菌制剂(即Bt产品)，并期望能有效延缓害虫对其产生抗药性。目的之二是利用等位基因同源重组的方法筛选相应的突变菌株使其不带有包括抗生素基因在内的任何外源基因，来获得对环境更加安全的转基因工程菌。同时提供将协同作用的基因组合，导出野生菌株中，得到具有更高、更广谱杀虫毒力的工程菌。—种蛋白组合物,其特征在于含有Cry8Eal蛋白和Cry3Aa7蛋白。 所述蛋白组合物中还含有Cry8Ca2蛋白。上述蛋白组合物在制备杀虫剂中的应用。苏云金芽胞杆菌工程菌BI0T1853A，能表达上述蛋白组合物。所述工程菌BI0T1853A的构建方法，包括如下步骤I)构建含有cry3Aa基因的温敏穿梭载体pMAD3A，其结构如图2所示，2)将温敏穿梭载体pMAD3A导入工程菌菌株BI0T185中，得到重组菌株BI0T185M3A，通过高温筛选、温敏穿梭载体pMAD3A丢失、同时等位基因重组得到苏云金芽胞杆菌工程菌BI0T1853A。所述构建温敏穿梭载体PMAD3A的构建方法如下(I)根据已经获得的Btl85菌株内生质粒序列，选择ISBma4转座酶基因序列用于等位基因同源重组，设计四条引物pISFl/pISRl、pISF2/pISR2做重叠PCR，其中pISRl/PISF2引物设计有NcoI酶切位点，PCR扩增产物分别为655bp片段和630bp片段，(2)然后以两个片段的PCR产物混合物为模板，以pISFl/pISR2为引物PCR，这样655bp片段与630bp片段中间以NcoI酶切位点相连接；PCR扩增转座酶基因的I. 285kb片段，连接于PMD18-T载体，得到重组载体pMD-ISBma4 ；(3)以NcoI单酶切pMD_ISBma4载体，将I. 285kb片段分为用于等位基因同源重组的N端和C端两个侧臂； (4)以 Pcry3ANcoIF/Pcry3ANcoIR 为引物，pSTK_3A 质粒为模板扩增带有 cry3A 启动子的cry3Aa7基因，将回收的cry3Aa7表达区PCR产物，连接至两同源臂内，得到重组质粒 pMD-3A ；(5)利用限制性内切酶BamHI酶切pMD_3A质粒，回收3790kb插入片段连接于pMAD载体卡盒内，经序列测定最终获得整合载体PMAD3A ；所述引物序列分别为p ISFI CGGGATCCCCAGAATTATTAGAGGCpISRl CGGAAAATCTGTTAAACCATGGCAGAGAGTTTTCAACpISF2 GTTGAAAACTCTCTGCCATGGTTTAACAGATTTTCCGpISR2 CGGGATCCAAGCTATTGAATTGTACTCPcry3ANcoIF CGCCATGGGGGAGCTTAATTAAAGATAATA,Pcry3ANcoIR :CGCCATGGTTAATTCACTGGAATAAATTC。所述步骤(2)中工程菌BI0T1853A的筛选方法为活化BI0T185M3A进行等位基因同源重组和载体消除，第一次突变后，以cry3A特异鉴定引物扩增含有I. 9kb片段的生长缓慢的克隆，进行第二次突变；经第二次突变，筛选丢失红霉素抗性的克隆，以crySC鉴定引物扩增300bp片段,确定cry8C基因没有丢失；以cry3A鉴定引物扩增I. 9kb片段，同时以pISFl、pISR2引物鉴定，获得不能扩增出内源质粒上I. 285kb片段的阳性重组子BI0T1853A ；所述第一次突变的方法为(I)挑取新鲜的、多个阳性转化子接种于含红霉素的IOOmL的LB液体培养基中；28°C>200r/min 培养 6h ；(2)1%转接于IOOmU无抗生素的LB液体培养基中；38°C、200r/min培养3代，培养 I. 5-2. Oh ；(3)按 I %。比例依次转接 2 次，38°C、200r/min 培养 I. 5-2. Oh ；(4)将菌液适当稀释，分别无抗生素LB平板和红霉素抗性平板；(4)挑选红霉素抗性平板上生长相对缓慢、菌落小的克隆，进行PCR鉴定所述第二次突变的方法为将一次突变中PCR鉴定正确的克隆，进行二次突变，步骤同一次突变；最终挑选LB培养基上可正常生长，但在红霉素平板上不生长的克隆，以PCR法鉴定突变体。上述工程菌BI0T1853A在制备杀虫剂中的应用。因苏云金芽胞杆菌野生菌株Btl85 (其本身带有cry8Eal基因)对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟有较高毒力，其获得cry8Ca2基因后的工程菌菌株BI0T185对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟同时有高毒力。本发明将cry3Aa7转入BI0T185后筛选得到的工程菌BI0T1853A对鞘翅目多发性害虫暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟、诸多叶甲科害虫(包括马铃薯甲虫和大猿叶甲等)同时具有闻毒力，同时有可能对几种害虫的毒力有所提闻。在检测工程菌BI0T1853A杀虫效果的实验过程中，本发明将所涉及的基因cry8Eal> cry8Ca2、cry3Aa7分别转入Bt无晶体突变株HD73-菌株,得到重组菌株HD3A、HD8C、HD8E，发现在该菌株表达的蛋白之间存在相互的协同作用。特别是对于cry3Aa7，与cry8Eal之间的协同，以及基因cry8Eal、cry8Ca2、cry3Aa7三者的协同，同时发现,工程菌BI0T1853A的杀虫效果比重组菌株HD3A、HD8C、HD8E三者的组合杀虫效果还要好，这表明，在工程菌中除了三个基因的协同作用外，还存在其它基因或它们之间的相互协同作用。 该工程菌BI0T1853A利用等位基因同源重组的方法筛选得到，不携带包括抗生素基因在内的任何其它外源基因，降低了基因漂移的频率，增强了转基因工程菌的环境安全性。图I.重组质粒pMD_3A及工程菌的构建技术路线图2.重组质粒pMAD3A及工程菌的构建技术路线图3. BI0T1853A 中 cry3Aa、cry8C 基因的 PCR 鉴定图4. BI0T1853A Southern blot 验证分析图5. cry3A基因在工程菌BI0T1853A中的表达图6. BI0T1853A Western blot 验证分析其中I Marker ；2 :BI0T185_3A ；3 Bt22 ；4 BI0T185 ；5 :BI0T185_3A ；6 Bt22 ；7 BI0T185图7.扫描电子显微镜下观察到的晶体形态图8.工程菌BI0T1853A与对照菌株BI0T185、Btl85的生长曲线图9cry8E PCR产物DraI、KpnI酶切鉴定10cry8C PCR 产物 DraI、KpnI 酶切鉴定llcry3A PCR 鉴定12cry8E PCR 产物 DraI、KpnI 酶切鉴定图为了提高Bt的转化效率，制备Bt的电击转化感受态细胞(Sambrook J, Fritsch EF，and Maniatis T, 1989. Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring HarbourLab, Cold Spring Harbour, NY),采用电击转化的方法转化Bt受体菌细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。4.含cry3Aa基因的同源重组质粒的构建首先，根据已经获得的Btl85菌株内生质粒序列，选择ISBma4转座酶基因序列用于等位基因同源重组，设计四条引物pISFl/pISRl (SEQ ID N01/2)、pISF2/pISR2 (SEQ IDN03/4)做重叠PCR，其中pISRl/pISF2引物设计有NcoI酶切位点。具体步骤是前两条引物用于扩增序列的655bp片段，后两条引物用于扩增序列的630bp片段，然后以两个片段的PCR产物混合物为模板，以pISFl/pISR2为引物PCR，这样655bp片段与630bp片段中间以NcoI酶切位点相连接，目的是在此位点插入cry3A启动子及基因片段。PCR扩增转座酶基因内I. 285kb片段，连接于pMD18-T载体，得到重组载体pMD-ISBma4。核酸限制性内切酶NcoI位于转座酶基因片段内655bp位置，以NcoI单酶切pMD_ISBma4载体，将I. 285kb片段分为用于等位基因同源重组的N端和C端两个侧臂。以Pcry3ANcoIF/Pcry3ANcoIR为引物(SEQ ID N05/6)，pSTK-3A质粒为模板扩增带有cry3A启动子的cry3A基因。将回收的cry3A表达区PCR产物，连接至两同源臂内，得到重组质粒pMD_3A。利用限制性内切酶BamHI酶切pMD-3A质粒，回收3790kb插入片段连接于pMAD载体卡盒内，经序列测定最终获得整合载体pMAD3A，该载体具有pMAD载体的红霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、bgaB基因和pE194ts温敏复制区。bgaB基因可以进行蓝白筛选，pE194ts温敏复制区在完成等位基因同源重组后可通过提高温度消除载体，从而使工程菌内不含有非必要基因，保证工程菌环境释放的安全性。PMAD3A可以用于构建稳定安全的Bt工程菌。载体质粒pMAD3A构建的物理图谱，重组质粒PMAD3A及工程菌的构建技术路线图见(图1，2)。(用于扩增同源重组片段左翼片段655bp，以Btl85或BI0T185基因组为模板)pISFI CGGGATCCCCAGAATTATTAGAGGC BamHIpISRl CGGAAAATCTGTTAAACCATGGCAGAGAGTTTTCAAC NcoI(用于扩增同源重组片段右翼片段630bp，以Btl85或BI0T185基因组为模板)pISF2 GTTGAAAACTCTCTGCCATGGTTTAACAGATTTTCCG NcoIpISR2 CGGGATCCAAGCTATTGAATTGTACTC BamHI(用于扩增带cry3A启动子的全长的cry3Aa基因片段2505bp，以pSTK_3A质粒为模板)Pcry3ANcoIF CGCCATGGGGGAGCTTAATTAAAGATAATA NcoI
Pcry3ANcoIR CGCCATGGTTAATTCACTGGAATAAATTC NcoI5.含cry3Aa基因的Bt工程菌BI0T1853A的构建将含有cry3Aa基因的重组质粒pMAD3A通过电击转化导入大肠杆菌SCS110，去甲基化，提取阳性转化子质粒，电激转化BI0T185菌株(Liu J, Yan G，Shu C，Zhao C，LiuC，Song F，Zhou L, Ma J, Zhang J, Huang D. Construction of Bacillus thuringiensisengineered strain with high toxicity and broad pesticidal spectrum againstcoleopteran insects. Appl Microbiol Biotechnol. 2010，87 (I) : 243-249.),得到重组菌株BI0T185M3A。活化BI0T185M3A进行等位基因同源重组和载体消除，第一次突变后，以cry3A特异鉴定引物扩增含有I. 9kb片段的生长缓慢的克隆，进行第二次突变，经第二次突变，筛选丢失红霉素抗性的克隆，以cry8C鉴定引物扩增300bp片段，确定cry8C基因没有丢失。以 cry3A鉴定引物扩增I. 9kb片段，同时以pISFl、pISR2引物鉴定，获得不能扩增出内源质粒上I. 285kb片段的阳性重组子BI0T1853A。6.工程菌的检测PCR检测和测序检测用特异PCR引物，以得到的Bt转化子为模板，进行PCR扩增，检测工程菌中是否含有外源cry3Aa7基因和cry8Ca2 (图3)并进行测序验证(见SEQ IDN09/SEQ ID N010)及 Southern blot 验证分析(图 4)。(用于鉴定cry8Ca基因片段3.6kp)pEXPRESSI0N5 TGTATCTGGTAGGGGAGCTTAATTAAAGpEXPRESSI0N3 ACAATTCTTTCGGGCAAAAAACCCCTCAASDS-PAGE检测将得到的工程菌菌株进行SDS-PAGE检测，观察工程菌中cry3Aa基因和cry8Eal、cry8Ca2表达变化情况(图5)。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992)。Western-blotting检测通过Western-blotting的方法进一步验证所得到的转化子中外源Cry3Aa蛋白和Cry8Ca2蛋白的表达情况(图6)。方法参见分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992)。Cry3Aa蛋白的抗体由中科院遗传所动物中心制备。扫描电镜检测通过扫描电镜观察工程菌形成伴孢晶体的情况，从而检测外源蛋白在工程菌中的表达情况，由图中可以看出导入cry3Aa7基因后能够产生正常的方形晶体，同时也存在cry8Eal、cry8Ca2基因产生的球形晶体(图7)。生长情况观察将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，按固定的时间间隔取样，观察工程菌株与受体菌株之间细胞生长情况的变化(图8)。工程菌的遗传稳定性采用连续培养法(Wang G, Zhang J, Song F，Wu J, FengS，Huang D.Engineered Bacillus thuringiensis G033A with broad insecticidalactivity against lepidopteran and coleopteran pests.Appl MicrobiolBiotechnol (2006) 72:924 - 930)测定工程菌的遗传稳定性，证明工程菌中含有外源cir3Aa基因的可以稳定遗传(表I)。7. cry3A、cry8C、cry8E在无晶体突变株HD73-中的表达将含有cry3Aa、cry8C、cry8E 基因的质粒 pSTK_3A、pSTK-8C、pSTK_8E 通过电击转化分别导入大肠杆菌SCS110，去甲基化，提取阳性转化子质粒，分别电激转化Bt无晶体突变株HD73-菌株，得到重组菌株HD3A、HD8C、HD8E。8.工程菌杀虫活性研究将工程菌BI0T1853A、受体菌株BI0T185、野生菌株Btl85及HD3A、HD8C、HD8E制成粉剂，确定粉剂中活孢子的数量以及晶体蛋白的含量。然后将粉剂稀释成不同的浓度，测定工程菌株对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟及大猿叶甲的活性(表2、3、4、5、6、7)。以下是本发明的实施例，这些实施例只对本发明举例说明。在实施例中，尽管详细描述了不同基因的组合，但本发明的基因组合并不限于对Bt菌株进行转化和用于生产对上述害虫有抗性的Bt工程菌。以下所用材料包括载体，野生菌株，工程菌均为公开的产品，本申请人实验室均有保藏，可以对外公开发放。、实施例I大肠杆菌SCSllO电感受态的制备挑取单菌落于5ml LB震荡37°C培养过夜。按I %接种量接种于100ml LB液体培养基中，37°C,230rpm 培养 2hrs (OD600=O. 5)。4°C,4000rpm 离心 6min。弃上清，加入预冷的超纯水冲洗两次。加入预冷的超纯水悬浮细胞。4°C，9000rpm离心6min，回收细胞。加入预冷的超纯水洗两次，加入10%甘油l_2ml重新悬浮细胞，分装，_70°C保存备用。实施例2 Bt电击感受态的制备挑取单菌落于5ml LB震荡30°C培养过夜。按I %接种量接种于IOOml BH液体培养基中，37°C,230rpm 培养 3_4hr (OD600=2. O)。4°C,9000rpm 离心 6min。弃上清，加入预冷的超纯水洗两次。加入预冷的超纯水悬浮细胞，4°C，9000rpm离心6min，回收细胞。加入预冷的超纯水洗两次，加入40% PEG重悬细胞，分装，_70°C保存备用。实施例3 Bt质粒DNA提取接菌于5mL液体LB培养基试管中30°C，230rpm活化。按I %接菌量接菌于三角瓶中37°C，230rpm震荡培养4h左右(0D_=2. 0)。5，OOOrpm, 5min离心收集菌体。每IOOmL菌液加 I. 5mLSI (10%鹿糖，50mM Tris .Cl (pH8. 0), 20mM EDTA (pH8. 0) Lysozyme 20mg/ml,(用时现配)，混匀，37°C放置 2-4h。每 IOOmL 菌液加 13. 5mL SII(10mM Tris .Cl，ImM EDTA,
0.085MNa0H, I. 1% SDS 用时现配)，轻轻混匀，放置 IOmin0 每 IOOmL 菌液加 75mL SIII (5MKAc，用冰乙酸调至pH4. 8)，轻轻混匀，(TC放置4h上。12，OOOrpm离心5min，取上清，加入等体积异丙醇，_20°C放置30min以上。12，OOOrpm离心5min,弃上清,沉淀用70%乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用3mL超纯水溶解。加入50 ill 1^^86,37°(作用211,除去RNA。酚、氯仿抽提后，补水至10mL，加入1/10 3M NaAC和2倍体积无水乙醇，_20°C沉淀2h。12，OOOrpm离心5min，弃上清，沉淀用70%乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用ImL超纯水溶解。实施例4大肠杆菌热击感受态细胞制备及转化挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；按I %接种量接种于LB液体培养基中，37°C，230rpm 培养 2-2. 5hr, (OD600=O. 5-0. 6);4°C，4000rpm 离心 IOmin ;弃上清，加入预冷的 0. IMCaCl2 50ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；4°C, 4000rpm离心IOmin,回收细胞;用2-4mI冰预冷的0. IM 0&(12重悬细胞，分装成200iiL/0. 5mL离心管中，于4°C保存，一周内用完。E. COli的转化将200iiL感受态细胞与要转质粒混匀，冰浴30min，42° C热击I. 5min，冰浴3min，加入800ii L LB培养基37。C培养60min，取200 y L涂板，37° C培养。实施例5大肠杆菌质粒DNA提取离心收集菌体，用250 u L SI悬浮，加入SII250iiL，翻转混匀，加入SIII350iiL，迅速混匀，12000rpm离心lOmin，取上清倒入质粒提取试剂盒中的柱子里，柱子下面接有
I.5ml的离心管，12000rpm离心Imin,弃去离心液，在柱子里加500 u LWl, 12000rpm离心Imin,弃去离心液,在柱子里加700 u LW2,12000rpm离心Imin,弃去离心液,700 u LW2,12000rpm离心Imin,弃去离心液,加适量ddH20水,离心Imin,获得质粒溶液。实施例6 pMAD3A温敏穿梭载体的构建首先，根据已经获得的Btl85菌株内生质粒序列，选择ISBma4转座酶基因序列用于等位基因同源重组，设计四条引物pISFl/pISRl、pISF2/pISR2做重叠PCR，其中pISRl/PISF2引物设计有NcoI酶切位点。具体步骤是前两条引物用于扩增序列的655bp片段，后两条引物用于扩增序列的630bp片段，然后以两个片段的PCR产物混合物为模板，以pISFl/ PISR2为引物PCR，这样655bp片段与630bp片段中间以NcoI酶切位点相连接，目的是在此位点插入cry3A启动子及基因片段。PCR扩增转座酶基因内I. 285kb片段，连接于pMD18_T载体，得到重组载体pMD-ISBma4。核酸限制性内切酶NcoI位于转座酶基因片段内655bp位置，以NcoI单酶切pMD-ISBma4载体，将I. 285kb片段分为用于等位基因同源重组的N端和C端两个侧臂。以Pcry3ANcoIF/Pcry3ANcoIR为引物，pSTK_3A质粒为模板扩增带有cry3A启动子的cry3A基因。将回收的cry3A表达区PCR产物，连接至两同源臂内，得到重组质粒pMD-3A。利用限制性内切酶BamHI酶切pMD_3A质粒，回收3790kb插入片段连接于pMAD载体卡盒内，经序列测定最终获得整合载体PMAD3A，该载体具有pMAD载体的红霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、bgaB基因和pE194ts温敏复制区。bgaB基因可以进行蓝白筛选，pE194ts温敏复制区在完成等位基因同源重组后可通过提高温度消除载体，从而使工程菌内不含有非必要基因，保证工程菌环境释放的安全性。PMAD3A可以用于构建稳定安全的Bt工程菌。载体质粒PMAD3A构建的物理图谱，重组质粒PMAD3A及工程菌的构建技术路线图见(图1，2)。实施例7 cry3Aa、cry8Ca基因在Bt中的表达用含有cry3Aa基因的重组质粒pMAD3A转化大肠杆菌SCSI 10，用红霉素进行筛选，得到转化子，从中提取重组质粒，然后电击转化Bt自然菌株BI0T185，利用红霉素抗性筛选转化子，然后42度高温筛选同源重组子，得到工程菌BI0T1853A。PCR检测和测序检测用Pcry3ANcoIF/Pcry3ANcoIR,pEXPRESSI0N5/pEXPRESSI0N3 (SEQ ID N07/8)为引物，以得到的Bt转化子为模板，进行PCR扩增，结果表明工程菌可以扩增出2. 5kb和3. 6kb的DNA条带，证明其中含有cry8Ca、cry3Aa基因，图3为PCR鉴定结果；同时将PCR结果送样测序，结果表明得到的序列分别为cry8Ca、cry3Aa,证明cry3Aa已经成功重组到BI0T185中，图4为Southern blot验证分析结果图。pEXPRESSI0N5 TGTATCTGGTAGGGGAGCTTAATTAAAGpEXPRESSI0N3 ACAATTCTTTCGGGCAAAAAACCCCTCAA以SN5un8/SN3un8为引物，以筛选到的阳性转化子为模板，进行PCR扩增，扩增产物用Dral/Kpnl酶切，电泳鉴定图见见图12。SN5un8 GTCCGAATAATCAGAATGAATATG
SN3un8 CGTTTCGCCTCTCTCACTGCATCSDS-PAGE检测将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm，30°C培养。在36小时取样，将样品进行处理后，进行SDS-PAGE检测，观察工程菌中cry3Aa基因表达变化情况(图5)。样品处理方法将所取样品离心，收集菌体，菌体沉淀中加入100 u I超纯水和50 u I 3 X Sample Buffer混匀，煮沸5分钟，备用。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992)。结果表明Bt22菌株(对照菌株) (张杰宋福平等，对鞘翅目害虫高毒力Bt基因cry3Aa的分离克隆及表达研究，中国农业科学，2002，35 (6)，650-653)中只表达65kDa的Cry3Aa蛋白，Btl85、BI0T185只表达约140kDa的蛋白带；而在工程菌株BI0T1853A中，除含有原受体菌中所表达的蛋白外，还同时表达了约65kDa的Cry3Aa蛋白带，表明外源的Cry3Aa蛋白在受体菌株中可以正常表达(图5)。Western-blotting 检测抗体制备Cry3Aa蛋白的抗体由中科院遗传所动物中心制备；将蛋白样品进行SDS-PAGE ;转膜电泳后将载有蛋白的凝胶用转移缓冲液漂洗，按照金冬雁等(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992。)的方法用湿式转膜仪将蛋白从聚丙烯凝胶转移至PVDF膜；封闭将膜放入TBST缓冲液中漂洗，然后转入封闭液中室温封闭2小时；第一抗体反应按1000 I的比例在封闭液中加入Cry3Aa蛋白/小鼠抗血清(一抗)，室温结合1-2小时，洗膜三次，每次15分钟；第二抗体反应按500 I的比例在TBST加入羊抗鼠IgG-AP(二抗)，室温结合I小时，洗膜三次，每次15分钟；显色将PVDF膜置于含有NBT和BCIP的显色液中显色至条带清晰，将膜放入蒸馏水中漂洗终止反应。将膜取出凉干，拍照(图6)。Western-Blotting杂交结果进一步证明cry3Aa基因在工程菌株中可以形成65kDa的蛋白(图6)。扫描电镜检测将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm、3(TC培养；约36小时后，离心，弃上清，将沉淀重悬于无菌水中；同时将盖玻片粘在载物台上，然后将孢晶混合物涂在盖玻片上，用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金；扫描电子显微镜下观察晶体的形态。结果证明在BI0T1853A中可以形成球形晶体。图7为扫描电镜下的观察结果。生长情况观察将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm、3(TC培养，每2小时取样，在紫外分光光度计下测定OD6tltl值，观察细胞生长变化。比较了 Btl85、BI0T185和BI0T1853A的生长曲线，发现cry3A基因导入工程菌菌株BI0T185中，对它的生长速率没有显著的影响。图8为它们的生长曲线。同源重组突变株构建方法I) 一次突变①挑取新鲜的、多个阳性转化子接种于含红霉素的IOOmL的LB液体培养基中；②28°C、200r/min 培养 6h ;③1%转接于100mL、无抗生素的LB液体培养基中；④38°C>200r/min 培养 3 代，大约 I. 5-2. Oh ；⑤按I %。比例依次转接2次，38°C、200r/min培养大约I. 5-2. Oh ；⑥将菌液适当稀释，分别无抗生素LB平板和红霉素抗性平板；
⑦挑选红霉素抗性平板上生长相对缓慢、菌落较小的克隆，进行PCR鉴定2) 二次突变将一次突变中PCR鉴定正确的克隆，进行二次突变，步骤同一次突变。最终挑选LB培养基上可正常生长，但在红霉素平板上不生长的克隆，以PCR法鉴定突变体；实施例8工程菌的遗传稳定性米用连续培养法(GuangjunWang. Jie Zhang. Fuping Song. Jun Wu. ShuliangFeng.Dafang Huang Engineered Bacillus thuringiensis G033A with broadinsecticidal activity against lepidopteran and coleopteran pests. Appl MicrobiolBiotechnol (2006)72:924 - 930)测定工程菌的遗传稳定性，将待测菌株接种在含有抗生素的LB液体培养基中30°C振荡培养过夜，以I %的接种量转接至无抗生素的LB液体培养基中，30°C连续振荡培养，于24、36、48、60、72、84、96hrs取样，按菌浓度稀释IO7-IO9倍，并分别取IOOul稀释液涂布于没有选择压的LB平板上，30°C培养30-40hrs，待长出单菌落后，对 cry8C、cry3Aa基因进行PCR扩增检测。


本发明涉及“苏云金芽胞杆菌基因组合、其工程菌及其制备方法”，属于生物防治领域。本发明的基因组合cry8Ea1、cry8Ca2、cry3Aa7两两之间，三者之间均有协同作用，特别是对于cry3Aa7，与cry8Ea1之间的协同，以及基因cry8Ea1、cry8Ca2、cry3Aa7三者的协同效果很好。借此构建的含有三个基因的工程菌BIOT1853A对鞘翅目多发性害虫暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟、马铃薯甲虫和大猿叶甲等同时具有毒力，同时有可能对几种害虫的毒力有所提高。利用等位基因同源重组的方法筛选得到的本工程菌BIOT1853A不带有抗生素基因，增强了转基因工程菌的生物安全性。