专利名称：检测内皮细胞大量钙积累性死亡的方法组织(正常组织和肿瘤组织)尺寸增长时，需要形成微毛细管(新生血管)来为维持组织生长提供营养。这些微毛细管的组成中的最主要成分是内皮细胞，但也包含相关的间充质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和周细胞。血管新生不仅在正常过程如伤口愈合中很重要，而且在疾病如癌症、银屑病、糖尿病、类风湿性关节炎、和衰老相关的黄斑变性中也很重要。需要用于正常及患病组织中微毛细管体外研究的改良方法。Staton等人发表了关于现有已知方法的总结，“Current `Methods for Assaying Angiogenesis in vitro andinvivo”( “体内外分析新生血管生成的现有方法”)Int J Exp Path (2004) 85:233 248。体内模型虽然有用，但很繁琐。体外模型较为简便，但真实性与相关性也较低。具体而言，需要用于预测靶向肿瘤微脉管系统的抗癌药物及其它治疗的活性的改良方法。例如，贝伐单抗(Avastin )是一种FDA批准的靶向肿瘤微脉管系统的抗癌药物。治疗10个月所需Avastin 的批发价格超过$40000，但只有相对小百分比的病人实质获益。如 Ince 等人所述，“Association of k-ras, b-raf, and p53 Status withthe TreatmentEffect of Bevacizumab, ” ( “k_ras、b_raf 和 p53 状态与贝伐单抗疗效的关联”)，J NatlCancer Inst (2005) 97:981-989,鉴定可预测哪些病人最有可能响应此类治疗的生物标记物受到了人们的强烈关注。最常用的体外方法包括分离和培养内皮细胞。一旦细胞得以培养，利用各种细胞增殖和/或细胞死亡终点，即可研究药物作用(或其它干扰)。细胞增殖终点的例子包括放射性胸苷掺入、细胞计数、BrdU掺入和克隆形成率。细胞死亡终点的例子包括检测细胞ATP、MTT的线粒体还原、二乙酸荧光素的代谢和细胞内俘获(及其损耗)、用染料排斥法检测细胞膜完整性的缺失、以及凋亡的更特异性检测方法，如TUNEL检测法或胱冬酶表达测定法。在一些例子中，通过将预先分离的内皮细胞与预先分离的其它细胞共培养，研究了药物对于不同细胞群的药效差异。其它的体外方法基于器官培养。(参见例如，Staton等，同上)这些器官包括大鼠主动脉环、小鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎盘静脉盘和胎小鼠骨外植体。无细胞培养、无器官培养，这些研究和预测贝伐单抗效果的方法也已被Ince等人公开，J Natl Cancer Inst (2005)同上。Ince尝试将k-ras、b_raf和p53状态与贝伐单抗治疗效果联系起来，但是得出了它们“无法鉴定更可能响应贝伐单抗治疗的转移性结直肠癌患者的任何亚组”的结论。在他们的讨论中，Ince等人提到:“迄今，几乎没有研究评价过生物标记物在预测临床上哪些病人更可能响应抗新生血管治疗中的潜在效用”，并且仍未发现可预测临床益处的标记物。这些作者提出:“使用总结所有血管形成调节物效果的生物标记物比分析单个生长因子或信号诱导通路更利于预测患者结果”，但是并没有提出任何能用于该目的的体外方法。相反，他们指出了目前的研究中采用患者自身作为实验模型来预测他们自己的结果。在这些研究中，将贝伐单抗(和/或其它疗法)尝试性给予患者，然后通过外部诊断扫描(例如，MRI)和/或治疗后肿瘤活检，以及疗效的组织学评估来评价“早期”治疗效果(例如，Willett等人，Nature Med(2004) 10:145147.)。所述方法存在很多明显缺点，包括治疗的花费、使患者接触最终无效治疗的 潜在毒性、以及诊断研究的花费(例如:MRI)。此类研究也不具备同时测试多种不同的治疗而不给患者带来风险的能力，而采用体外方法则有可能实现该能力。PCT公开W02007/075440是本文所述申请人所做的工作，其描述了使用显微观察不被活细胞接受而被非活细胞吸收的染料(尤其是固绿)的吸收情况，评估对内皮及非内皮细胞混合物或微团聚体的处理效果。申请人观察到死亡内皮细胞可通过其外观与存活或死亡肿瘤细胞或非内皮细胞区分开。然而，这种差别依赖于在不论实施何种疗法非内皮细胞本身都不会被杀死的情况下更易察觉的观察。在该情况下，可采用能被活细胞摄入的第二指示剂染料将活细胞与死亡内皮细胞中区别出来，产生蓝莓薄饼状特征，其中死亡内皮细胞显示为粉红背景下的“蓝莓”。其它出版物对此进行了总述，也代表了申请人的工作，包 ffeisenthal, L- M.等人，J.1ntern.Med.(2008)264:275 287; Weisenthal, L.，等人，ASCO2008 Breast CancerSymposium(ASCO 2008乳腺癌专题论丛)，华盛顿特区，摘要编号166 ；以及 Weisenthal, L,等，J.Clin.0ncol.(2010)28:增刊:摘要 E13617。即便非内皮细胞在处理中被杀死，其仍可得以辨别。只有死亡的内皮细胞在固绿染色下具有发生折射的、浓染的、且呈蓝黑色的易区分形貌，而所有死亡的非内皮细胞则呈现较淡的蓝色。在随后的PCT公开中，同样也是当前申请人的工作，公开号W02009/143478，利用内皮细胞响应特异于内皮细胞的毒性试剂所呈现的不同形貌来检测和量化循环内皮细胞作为健康指标。同样，利用这些死亡内皮细胞的形貌进行该评估。使用这种方法，还发现亚毒性血液水平的乙醇和/或DMSO是用于治疗不利新生血管的有用佐剂。虽然在上述参考的PCT公开中 描述的方法是有效的，其依然难适应高通量形式，因为如果非内皮细胞未受处理影响，内皮细胞与非内皮细胞之间的对比更为强烈。本发明提供了解决该问题的方法，通过该方法不论非内皮细胞本身在处理中有没有受到负面影响，在处理中受到负面影响的内皮细胞易于与所述非内皮细胞区分开。此外，已发现某些试剂使内皮细胞发生特定类型的细胞死亡，而非特异性内皮细胞死亡也受到不同非特异性试齐U的影响。本发明的方法依赖于使用钙离子敏感性染料。将钙离子与内皮细胞死亡联系起来，特别是在本文中将内皮细胞与肿瘤联系起来，使所述新技术成为可能。过去曾在心血管系统中观察到的钙积累现象，但是并没有将其与特定类型的内皮细胞死亡特别联系起来。例如，Spyridopoulos,1.等人，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.(2001) 21:439 444 报道了乙醇以钙依赖机制增强氧留醇诱导的人内皮细胞凋亡；阻滞钙内流则消除这种乙醇介导的毒性增强。还已知，氧化的LDL通过一种钙依赖途径诱导培养的人内皮细胞发生大量凋亡。抑制I丐内流导致凋亡受到阻滞(EscargueiIBlanc,1.,等，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.(1997) 17:331 339)Mohler, E.R.等在 J.Heart Valve Dis.(1999)8:254 260 中提到，心脏瓣膜I丐化也可列为一种病理。另一方面,Harada Shiba, M.,等人，J.Biol.Chem.(1998) 273:9681-9687描述了氧化LDL凋亡的可选机制。Mason, R.P.(J.Am.Col.Cardiol.(1999) 34:1857-1866)发表的一篇综述性论文中提到了钙通道阻滞子与癌症中的凋亡的关系。这篇文章中指出细胞钙水平的增高和降低都显示出促进凋亡细胞死亡。钙通道阻滞剂及促进癌症的作用仍被判为不明确。关于内皮细胞凋亡的综述也在论文Stefanec，T.，Chest (2000) 117:841-854中出现。这篇综述将增强的细胞内钙离子浓度列为内皮细胞的促凋亡刺激因素。总而言之，先前已将短期钙积累与内皮凋亡联系起来，其中，钙被视为导致所观察到的内皮细胞中非特异性细胞死亡的分子通路中的信使，而非以其本身作为主要致病剂。参见例如，Orrenius, S.等，Nat Rev Mol Cell Biol (2003) 4:552-565.现已发现I丐本身可作为致病剂，产生钙大量积累且具有晶体外观从而易于从非特异性细胞死亡中检测及分辨出来的死亡细胞。因此，到目前为止本领域尚未理解可将内皮细胞的死亡与细胞内钙离子的大量上升联系起来。此类细胞死亡，大量钙积累性死亡(MCAD)即是本申请的对象。申请人在出版物 Weisenthal, L.，等，Nature Proceedings (2010)于 HDL.handle, net/10101/npre.2010.4499.1.中对此 有报道。
存在一些可受益于诱导MCAD能力的情况。它们是一些其中发生不利的或不希望的血管生成的疾病，比如实体瘤。其它此类病症包括导致视力丧失的视网膜或脉络膜新生血管异常。在其它情况中，希望阻止因内生情况而在对象内发生的MCAD。此类情况包括例如动脉粥样硬化。由于MCAD与钙离子增加有特别关联，可用检测钙离子的染料识别和强化发生此类细胞死亡的细胞的染色。此类染料能够将MCAD从与非内皮和内皮细胞相关的其它类型的凋亡中区分出来，所述其它类型的凋亡为例如响应全身性毒剂、营养缺乏、或其它环境因素。本发明所述的方法能够检测和/或量化微脉管系统包括活检肿瘤或正常组织的分离物中的变化(例如活力变化)，包括响应化学、生物和/或物理处理的变化。本发明的方法还能够测定生物样品包括生物液体中内皮细胞的存在与否或其水平，并且能够用于测试保护性抵抗MCAD的潜在药物的实验。以观察到的微脉管及其它细胞变化作为来预测被测疗法的体内活性的检测，因此，本发明的方法能够检测对内皮细胞的特异性作用，也能够观察同一处理或施予伴随性治疗对周围细胞的作用。因此，特别的药物可以既影响内皮细胞，又影响其周围的细胞。这些方法可用于协助发现和/或开发新型或研究型疗法，也可以用于预测所测试疗法在分离获得含细胞样品的对象中成功的可能性，尤其是设计用于抑制血管发生的疗法。总体来说，申请人发现一种内皮细胞独有的死亡类型与高水平的细胞内钙离子有联系。因此，钙离子特异性的组织学染色提供了样品中发生此类细胞死亡的内皮细胞与其它细胞的高水平对比。因此，一方面，本发明涉及一种区分非特异性细胞死亡与大量钙积累性死亡(MCAD)的方法，该方法包括用钙离子特异性染料处理包含内皮细胞的样品，其中所述样品中的个体细胞可被辨识，以及测定相较于那些未被亮染的细胞而言被所述染料亮染(由对所述染料大量摄取而引起)的细胞的有、无或细胞数量，被亮染的细胞被鉴别为经过MCAD的细胞，未被亮染的细胞被鉴别为未经过MCAD的细胞。另一方面，本发明涉及一种鉴别对MCAD有作用的试剂的方法，该方法包括采用所述试剂处理前述方法样品中的细胞，和测定所述试剂是否致使所述样品中细胞的亮染增强。在这一方面，本发明还涉及一种测定处理相较非内皮细胞对内皮细胞活力的影响的方法，该方法包括:使样品与所述处理接触，其中所述样品中的个体细胞可被辨识，且所述样品至少包括活内皮细胞和活非内皮细胞； 使所述组合物与至少一种钙离子特异性染料接触；测定被所述染料亮染的细胞的有、无或其数量；由此，所述内皮细胞的亮染增强表明所述处理对于内皮细胞活力具有负面影响。另稍作他释，本发明涉及一种鉴定特异性影响内皮细胞死亡的试剂的方法，该方法包括:用候选试剂处理样品，其中该样品中的个体细胞可被辨识，且所述样品至少包括活内皮细胞和活非内皮细胞；允许充足的时间供所述试剂发挥作用；用钙离子特异性染料处理所述样品；并测定被所述染料亮染的细胞，其中所述样品中个体细胞可被辨识。由此，导致被所述染料亮染增强的试剂即被鉴定为特异性影响内皮细胞死亡的试剂。在另一个方面，本发明涉及一种鉴定保护性抵抗MCAD的试剂的方法，该方法包括在候选保护试剂存在下，用已知对MCAD有影响的试剂处理包括内皮细胞的测试样品，其中所述样品中个体细胞可被辨识，并在不加入所述候选试剂的情况下，用所述已知对MCAD有影响的药物处理对照样品，用钙离子特异性染料处理两种样品，并将所述测试样品中亮染细胞的有、无或细胞数量与所述对照样品中亮染细胞的有、无或细胞数量相比较，由此，相较于所述对照样品，所述测试样品中染色的减少表明所述候选试剂是保护性抵抗MCAD的。本发明各种方法中所用样品可以是微团聚体、体液或组织样品。为了获得有意义的结果，样品中必须包含内皮细胞。附图简要说明图1A-1C为可用于本发明一些实施方式中的现有技术微团聚体的示意图说明。图2A-2H显示采用现有技术方法对从各种实体瘤制得的微团聚体进行染色的结
果O图3A-3F为未用或用贝伐单抗处理，并用茜素红染色的微团聚体的显微照片，放大倍率为40 XUOOX和200 X。图4A为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微照片，所述细胞在无贝伐单抗(上图)或有贝伐单抗(下图)的情况下 ，在(不利的)非贴壁依赖性条件下培养。细胞用固绿染料短时孵育，并根据现有技术方法沉积到Cytospin 离心玻片上。图4B为在无贝伐单抗(上图)或有贝伐单抗(下图)情况下培养的人肾癌细胞微团的显微照片。细胞用固绿染料短时孵育，沉积到Cytospin 离心玻片上，然后用茜素红s进行复染。图5为一系列内皮细胞(HUVEC)的纯培养物的显微照片，所述培养物在载剂(盐水或50% DMS0/50%乙醇)或50% DMS0/50%乙醇加猪油(lmg/ml)存在的情况下培养72小时，然后使用固绿染料处理，采用Cytospin 离心机沉积到显微镜载玻片上，用茜素红s复染。本发明的实施方式本发明基于如下发现:内皮细胞独特存在一种凋亡模式，该凋亡模式与高水平细胞内钙离子相关，因此能够对在各种处理中被杀死的内皮细胞进行高特异性染色。一种典型的此类染料为茜素红，但也可使用其它钙离子特异性染料，如冯库萨(von Kossa)。在一个实施方式中，本发明改进了上文所参考的PCT公开W02007/075440和W02009/143478中的方法，这些方法研究任选在仿天然条件下的微团聚体中或在其它包含内皮细胞的样品中的活组织微脉管分布(microvascularity)如本文所用，“微团聚体”指在本文的测试中能够有效模仿细胞自然环境的细胞群。在一个实施方案中，关注对内皮细胞处理的效果。在该情况下，所述微团聚体需要至少包括内皮细胞和能够提供所述细胞自然环境的替代环境的充足周围细胞。理论上，可仅包括一个内皮细胞和伴随的细胞。在本申请中，“微团聚体”，“微团”和“团簇”可互换使用。细胞微团聚体或细胞团可从活检组织中分离。所述团簇代表获得活检样品的组织(肿瘤或正常)的缩影，包括肿瘤细胞(癌症情况)、正常组织细胞、结缔组织细胞、炎性细胞，以及在一些情况下，微毛细管的完整片段，包括内皮细胞和其它毛细管组成细胞。所述团簇可仅包含一个内皮细胞和一个非内皮细胞，但一般包含几个、数十个、数百个、数千个细胞。随后可将所述团簇在标准组织和/或器官培养装置中，使用标准组织和/或器官培养基(包含适当的营养物质和补充添加剂)培养数小时、数天、数星期的时间。细胞可接触假设对活检前(即在患者体内)的微毛细管和/或微毛细管组成细胞具有潜在作用的各种处理，所述接触如本发明的方法中所示，在活检后但细胞培养前或细胞培养过程中进行。处理可能会损伤或杀死或促进或增强微毛细管和/或组成细胞的生存和/或増殖。
这些微团聚体的制备细节可从上文参考的PCT公开W02007/075440中找到。所述方法通常包括对粉碎的活检样品进行一系列在本文中被称为“快速旋转”的离心步骤。下文将更详细讨论这一点。在每一步骤中，向样品施加高重力，随后立即回到lXg，以获得细胞团簇沉淀和上清。移除上清，将细胞沉淀重悬，重复这一过程直到形成合适的分离微团聚体。然后，可任选培养微团聚体，或立即将其沉积至表面上进行显微观察。或者，可使用Ca+特异性染料处理微团聚体的初始制备物，或者可在培养中或培养后用染料处理。可在微团聚体沉积于表面之前或之后进行染色。可将所述微团聚体在标准组织和/或器官培养装置中，使用标准组织和/或器官培养基(包括适当的营养物质和补充添加剂)培养数小时、数天、数星期的时间。所述培养为评估不同处理或因素或方法对微团聚体中包含的内皮细胞和周围细胞的影响提供了机
O可用于本发明的微团聚体的特征如图1A-1C中所示。在各种情况下，如本文所述从活检组织制备获得所示细胞微团。在图1A中，用CD31染色确认内皮细胞的存在，这些细胞以阴影表示，周围环绕着以空心圆表示的伴随细胞。在图1A-1C的示意图中，采用抗VEGF药物进行预定的处理。图1B显示没有实施处理的阴性对照，如图所示，当该团簇与Ca+特异性染料接触时，由于细胞未被损伤，无表观变化发生。然而，在图1C中，其中团簇已与抗VEGF药物接触，内皮细胞被染料染色，因此证明它们已被药物影响。以空心圆表示的周围细胞未被染料染色，仍保持原样。因此，通过制备所示团簇,证明了个体内皮细胞显示出对用于示例的所述抗VEGF药物的响应能力。在培养过程中，细胞可接触各种假设对微毛细管和/或微毛细管组成细胞和/或周围细胞具有潜在影响的处理。可研究损伤或杀死相关观察细胞的处理，或可研究促进或增强微毛细管和/或组成细胞生存和/或增殖的处理。本发明的方法可测试正常组织和/或肿瘤组织，通过对比毛细管相关(内皮)细胞与团簇中存在的其它细胞差异性确定药物或其它处理对其的效果。各种细胞活力也能在活检后不久，未经细胞培养时进行测定。可测定毛细管和其它细胞活力，例如，在未接受治疗的患者中或活检(采用针或其它活检器具施检)前接受了一段时间临床治疗的患者中。虽然“微团聚体”是一种方便用于本发明方法的样品，也可采用其它样品。例如，所述方法可用于体液中内皮细胞数量的简单测定(如上文参考的W02009/143478中所述)。循环内皮细胞水平的增加可作为异常健康状况的指示。相似地，任何包含内皮细胞的样品都能用于评估设计为特异影响MCAD的处理。在本文中，“处理/治疗”指在样品环境中进行的任何有意改变。在至少包含内皮细胞的样品的培养物中加入药剂如化疗药物是最为常见的处理。然而，其它处理可能包括温度、pH、培养条件和成分的变化，例如营养物的供给变化，或各种化合物(例如小分子或肽)的组合，。处理也可包括加入趋化因子或任何其它有意的施药方案。虽然上文详细描述了通过 用钙离子特异性染料代替或加上能被死细胞轻易摄入的低特异性染料而改进的现有技术方法，本发明的其它方面基于如下理解:内皮细胞(即便被所述非特异性染料染色时)呈现折射、深染外观是由于大量钙离子的存在。这提供了许多其它重要的应用。首先，本发明使得在仅包含内皮细胞(或也可包含非内皮细胞)样品中辨别影响MCAD而非影响由非特异性毒剂引起的凋亡的部分成为可能。虽然MCAD只发生在内皮细胞内的事实可大致上区分内皮细胞死亡和非内皮细胞死亡，但非特异性毒素或条件和由于MCAD皆可导致内皮细胞自身凋亡。因此，本发明的另一方面涉及通过测定对于钙离子特异性染料的吸收及其水平，简便区分MCAD和非特异性细胞死亡。通常，钙离子特异性染料会将发生MCAD的细胞亮染，而未发生MCAD的活细胞或死细胞则由于通常呈现低钙离子水平而微弱染色。“亮”染指的是可通过或对已摄取染料的细胞的光吸收的定量测定或肉眼观察而轻易观察到的染色强度。可轻易比较样品中的细胞，其中只有发生MCAD的那些细胞显示出明亮的染色强度。因此，可通过比较发生MCAD的细胞和未发生MCAD的细胞的光吸收而容易地确定“明亮”。所述染色的“水平”通过样品中或其中规定部分内亮染细胞的数量来确定。本发明也包括测定影响MCAD而不是非特异性凋亡的药物或试剂的方法。除了可用包含内皮细胞的任何样品以外，所述方法类似于上文详细描述的在微团聚体上实施的方法。因此，体液、通常包含内皮细胞的组织样品或如下示例说明的内皮细胞系如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养物可用作此测定的样品。对影响MCAD的处理的测定有利于鉴别可在不希望血管生成的情况下有效抗血管生成的试剂。此类情况包括实体瘤(其需要新血管系统供给营养)、由脉络膜中不希望的新血管系统造成的黄斑变性以及不希望出现新血管系统的其它任意情况。相反，也有不希望MCAD发生的情况。所述情况中值得注意的是动脉粥样硬化，其中由内皮细胞中钙积累推动了导致血管阻塞的一系列事件。如下所示，脂肪，如猪油，能够诱导MCAD。实际上,I丐的大量积累会起到“眼中沙(burr under asaddle) ”的作用，触发血管壁中的炎症反应，这会弓I起导致动脉粥样硬化的一连串事件。在这些例子中，找到能够保护细胞抵抗MCAD的试剂十分有用。这可通过使用比较培养物或样品实现，这些培养物或样品之一(测试样品)包含保护性候选试剂，而另一对照样品则不包含保护性候选试剂。在各种情况下，用已知可影响MCAD的物质处理必须包含内皮细胞的样品。在测试培养物中，如果候选试剂是成功的，则可通过证明被钙离子特异性染料亮染的细胞数量即染色水平的降低来确定对抗MCAD的保护力。制备A肿瘤和/或IH常组织样本新鲜活检物或液体吸抽物获自癌症或其它病症患者或正常捐献者。用于实施本发明方法的样本通常来自提交医院的解剖病理学实验室或在一些情况下，直接来自手术室或外科/内科诊所。将实体瘤样本(未接触固定剂或冰冻)放置于低温运送培养基中(非CO2依赖性培养基，英杰/吉布可(InvitroGen/GIBCO)，纽约州格兰德岛，补充有青霉素/链霉素、两性霉素B、胰岛素/硒/转铁蛋白、和10%低内霉素高温灭活胎牛血清)。随后将样本置于坚固的Styrofoam 货运箱中，其中包含350gm冷冻至-20°C的“蓝冰”块。然后通过优先隔夜递送服务或本地快递发送这些样本。充分混匀液体样本使细胞团簇悬浮，然后将其倾倒至500mL的无菌聚丙烯运送瓶中。向每毫升提交的液体中加入十至十五个单位的硫酸肝素。应收到来自提交医院的正式组织病理学报告副本。制各B肿瘤细胞微团聚体的分离用高质量弯形外科手术剪将实体瘤剪碎成小于I毫米的碎片(小到足以被吸入标准一次性IOmL移液管)。保留运输所述肿瘤所用的培养基，并保留来自组织碎片的上清。将剪碎的肿瘤碎片用胶原酶/脱氧核糖核酸酶的RPM1-1640培养基(含抗生素和10%胎牛血清)溶液消化。将样本置于50mL—次性聚丙烯离心管中消化，采用塑料包裹的磁性搅拌棒于搅拌盘上进行温和搅拌以辅助消化。如此混合样本直到完全总体消化(compIetegross digestion)—通常1_3克样本需要约2_3小时。然后，制备所有细胞碎片(运送培养基、来自组织碎片的上清液和酶消化物)的Cytospin 载玻片，并用固绿-Η/E将其染色，如前所描述(Weisenthal 等,“A Novel Dye ExclusionMethod for Testing in vitroChemosensitivity of Human Tumors, ” ( “用于人肿瘤体外化学敏感性测试的新颖染料排斥法”)Cancer Res.(1983)43:749-757)。将液体样品全部离心，以收集样本中的所有细胞。然后,用上述基于RPM1-1640的培养基将细胞重悬，并如上文描述制备细胞离心涂片。通过“快速旋转”从培养基中富集活的微团聚体，所述培养基中包含存在于经剪切、消化的组织中的微团混合物以及单一细胞、正常细胞、血红细胞、死细胞及残片。快速旋转过程由重复的50-500X g极短时离心组成，其中，首先用温和手摇离心管进行混合，将其置于标准室温预备离心机中，然后加速至所需速度(以实证试验决定不同离心机的速度)，然后一旦离心达到所需速度，就立即关闭离心机，随后使其惯性运转至停止。每次快速旋转后，吸出上清并保存，同时收集细胞团簇沉淀并将其重悬以进行重复离心步骤。通过制备重悬细 胞团簇的细胞离心涂片来监测该过程，直到获得的部分中活细胞占到了细胞团簇的90%。若不能达不到此理想状态，则合并团簇中所含细胞百分比尽可能高的部分。调整所述细胞团簇的浓度，使Cytospin 细胞“盘”(“斑”)面积的大约25%为红粉色(活)肿瘤细胞团簇，而75%为空白区域。该细胞浓度至关重要，这是由于过度铺板和铺板不足都可能会导致人为抗药性和敏感性结果和/或可能会在随后的培养中对细胞团簇生存产生不利影响。由于测试结果基于众多对比测试的比较(如下文所描述)，测试条件必须标准化。为使上述结果标准化，需制备“第O天”玻片，用来描述测试最初细胞未受处理时的状态，并且还需制备“终止培养物”玻片作为阴性对照(未处理细胞)。可分析出独立于处理作用影响的因素，对第O天和终止培养物玻片的以下方面进行主观评分:(1)存在于团簇(而不是单一细胞)中的全部活肿瘤细胞(或其它所关注的细胞)所占百分比；(2)细胞团簇的平均密度，其中在Cytospin 离心后，“松散”团簇与细胞之间存在清晰空间，“中等”团簇与细胞之间无清晰空间，但平展为二维外观，而“致密”团簇在Cytospin 离心后维持三维立体的外观，以及(3)使用目镜测微计测量的细胞团簇的中值二维面积。上述这些因素皆会影响处理接触相关细胞的能力，因此在比较结果时须将它们纳入考虑。建议使“致密”团簇散开，从而使大分子(例如抗体)更容易透过。这可通过加入酶(如透明质酸酶)消化实现。除了对这些团簇进行测量外，对玻片进行主观评分以确定培养结束时活细胞相对于培养开始时(O小时或“第O天”)活细胞数的比例。制各C原位微毛细管活力测试(ISMCVA)
_2] 与现有染色技术的对比结果在培养第4天，向96孔培养板中的所有培养孔中加入0.0lOml阿尔玛蓝染料溶液(Trek 诊断系统公司，西部湖,俄亥俄州(Trek Diagnostic Systems, Westlake, OH))。4小时后，使用标准酶标仪(戴纳科技公司(Dynatech))于570ηιμ和600mμ记录吸光值。用570处的吸光值减去600处的吸光值，并从各接触药物的孔的读数中减去相应的阳性对照(高浓度顺氯氨钼/蛇形菌素(anguidine))孔读数。用每个如上算得的值除以从阴性(载齐U)对照孔(0.9% NaCl)获得的相应读数(同样减去阳性对照读数)。上述结果提供了药物诱导细胞死亡的粗略(相对不灵感)指标(针对培养物中的所有细胞，并未区分不同细胞群的死亡)，其仍然可作为附加质量控制来保证微板孔正确旋转沉积在正确标记的ISMCVACytospin 玻片上。Cytospin 分析玻片如之前描述制备(Weisenthal等，同上(1983)),同时加入乙醒固定的鸭血红细胞(Weisenthal 等，“Comparison of Dye Exclusion Assays withaClonogenic Assay in the Determination of Drug-1nduced Cytotoxicity,，，(“药物诱导的细胞毒性测定中的染料排斥测试与克隆形成测试比较”)Cancer Res (1983) 43:258264)，此方法在现有分析中主要用作测量Cytospin 细胞“盘”(“斑”)均一性的质量控制。对培养后玻片进行主观评分以如下测量细胞死亡:首先检查玻片，采用标准细胞病理学标准确定哪些细胞和团簇为肿瘤细胞以及哪些(如有)为正常细胞。需特别注意推定的毛细管相关细胞，这些细胞通常遍布分散于团簇中，可根据实践和经验被认作小的、常具有棱角的细胞，且非常邻近一个或更多其它相似外观的细胞。这些细胞通常有些过染。然后，主要于40 X放大倍数对经固绿和Η/E染色的ISMCVA Cytospin 玻片“盘”进行评分。扫描涂片以鉴别形态完好保存且大部分存活的细胞团簇。理想的细胞团簇应包含至少20个非毛细管细胞。扫描阴性对照(0.9% NaCl载剂)玻片以(在头脑中)确定完全不存在药物影响时玻片所呈现的外观。完好保存的阴性对照细胞团簇可称为“原味薄饼(plainpancake) ”，以暗指它们的外观较为均一。检测接触药物的培养物，选择完好保存、大量存活的细胞团簇。在低放大率下，根据是“原味薄饼”(若其具有大部分均一的外观)还是“蓝莓薄饼”(若存在多个被蓝绿染色的点状区域)来评测微团聚体进行评分，其中在高放大率下发现所述点状区域与死亡(固绿染色)的毛细管相关细胞一致。如果需要，可制备其它玻片，并用能够特异性鉴别毛细管相关细胞的免疫细胞化学方法染色，例如对适当特异于内皮细胞的CD31抗原进行染色。若在测试培养物 中观察到的“蓝莓薄饼”效应大于对照培养物，可根据主观但标准化的分级标准对该效果评分，如“1+蓝莓”、“4+蓝莓”等。或者，可在关注的细胞团簇上叠加显微目镜网格，在标准手动计数器的帮助下对每网格单元内的“蓝莓”数目进行计数。也可用自动图形分析系统对“蓝莓”进行评分。
图2显示了采用Avastin (贝伐单抗)处理的实体瘤微团聚体的典型结果。提供以下实施例以说明而非限制本发明。实施例1培养/处理步骤为测试处理效果，如药物效果，将细胞团簇悬液与10%(体积/体积)药物溶液或载剂对照(最典型为0.9%NaCl)混合。加入板中用于培养的细胞悬液/药物溶液(或载剂)的终体积为0.12ml。在聚丙烯圆底96孔培养皿中于37°C湿化培养箱中，进行标准化时间长度的培养。通常制备十倍于所需浓度的储备溶液，等量分装入单次使用的0.5ml聚丙烯锥形管，使用前于_70°C冰冻保存。一些药物根据厂商的推荐保存于冰藏温度。

使用各种药物的指示浓度和指示浓度的稀释物(若需要)培养细胞，其中所述指示浓度通过训练组试验或文献决定。阴性对照通常由0.9% NaCl和/或溶解了关注药物的载剂组成。对于肿瘤样品，阳性对照添加了 100μ g/ml的顺氯氨钼加I μ g/ml的蛇形菌素(获于国立癌症研究院)测试重复的96孔板。实施例2MIM通常如准备A和B中所描述制备人膀胱癌样本，并用Avastin κ.处理，或在对照样本中不予处理。所用贝伐单抗的量为2.5mg/ml，其清除了培养基中所有可检测的VEGF，由此影响生长依赖于VEGF的内皮细胞的细胞死亡。将培养物沉积到显微载玻片上，用茜素红S染色，其原始图片如图3A-F所示。如所述图片所示，Avastin 处理的培养物中的内皮细胞呈现清晰图像。这些原始图片利用市售可得的ImageJ软件，通过阈值进行门控只显示茜素红染色特征。这些结果示于表I中。表I示于图3A-F中的膀胱(移行细胞)癌ImageJ分析结果


利用钙离子特异性染料评估和预测各种处理对样品中所包含细胞类型的活力的影响，其中所述染料检测发生大量钙积累性死亡的内皮细胞。