专利名称：用于骨和软骨修复的方法和组合物的制作方法骨是一种活组织，含有多种组分，包括碳酸钙、磷酸钙、胶原和水，并且通过骨基质的重吸收和沉积不断得到补充。发生骨折时，通常的治疗是把骨折的骨复位到合适的位置，稳定该骨的位置，然后等待骨愈合过程的发生。骨愈合是一种复杂的过程，通常认为涉及三个时期反应期、修复 期和重塑期。在反应期，骨折部位形成血肿，并且炎性细胞和成纤维细胞在前列腺素的介导下浸润该骨。这导致肉芽组织的形成、血管组织向内生长、以及间充质细胞的迁移。在修复期，成纤维细胞开始铺设间质，它有助于支持血管向内生长。随着血管向内生长，铺设了胶原基质，同时分泌类骨质并随后矿化，这导致在修复部位周围形成柔软的愈伤组织(软骨)。经过从数周到数月的时间，软骨骨化，在骨折骨片之间形成编织骨的桥梁。在重塑期，发生愈合的骨骼恢复其原来的形状、结构和机械强度。重塑期会缓慢持续数月至数年，但是典型地在三至六个月内实现足够的骨强度。显然，骨折愈合是一个漫长的过程。值得注意的是，软骨与其他结缔组织不同，不含有血管，因此与其他结缔组织相比，软骨生长和修复得更慢。此外，当愈合过程中任一步骤没有适当或及时发挥作用，骨愈合可能就被延迟或损害。这对个人而言是一个重大挫折，也是费用高昂的临床问题。因此，使身体自然再生骨和软骨的过程加快的方法显然是有利的。诸位发明人已经惊讶地发现，通过诱导新骨形成和新软骨生长，在此披露的植物提取物和包含这些植物提取物的组合物促进了骨和软骨的修复。发明概述根据本发明的一个第一方面,提供了黄槿(Hibiscus tiliaceus L.)的一种生物活性提取物。该提取物可以进一步包括滨5[豆(Vigna marina(Burm. )Merr.)、椰子(Cocosnucifera L.,)或榄仁(Terminalia catappa L.)中一种或多种的提取物。这种或这些提取物可以衍生自以下各项中的一种或多种树皮、叶片、藤蔓、豆子、外壳或坚果。在一个实施方案中，该黄槿提取物衍生自树皮，典型地衍生自捣碎的新鲜树皮。该提取物可以使用一种基于植物的油、一种烃和/或一种醇制备，和/或包含一种基于植物的油、一种烃和/或一种醇。该基于植物的油可以衍生自植物种子或果实。在一个具体的实施方案中，该基于植物的油衍生自椰子。该椰子油可以是例如初榨椰子油、精炼椰子油、氢化椰子油或分馏椰子油。根据本发明的一个第二方面，提供了一种组合物，它包括根据该第一方面的提取物以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在具体的实施方案中，该组合物用于治疗骨或软骨损伤，和/或促进骨或软骨的形成、修复或再生。可以将该组合物配制成适于任何途径的给药，例如局部给药或胃肠外给药。胃肠外给药可以包括，例如骨内输液或鞘内注射。根据本发明的一个第三方面，提供了一种用于促进受试者体内骨或软骨的形成、修复或再生的方法，该方法包括向有此需要的受试者给予一个有效量的根据该第一方面的提取物、根据该第二方面的组合物、或在所述提取物或组合物的存在下培养的成骨细胞、成骨祖细胞或骨段或骨片。该受试者可能患有骨和软骨损伤、缺损或疾病，或者易感染或易诱发这类损伤、缺损或疾病。该损伤可以是例如骨折。该疾病可以是退行性骨病，例如骨质疏松。该受试者可能正经历或已经历骨或软骨移植操作，例如骨骼融合术，例如脊柱融合操作。这些成骨细胞或成骨祖细胞可以是自然产生的、异基因或异种的。根据本发明的一个第四方面，提供了一种用于治疗受试者体内骨或软骨的损伤、缺损或疾病的方法，该方法包括向该受试者给予一个有效量的根据该第一方面的提取物、根据该第二方面的组合物、或者在所述提取物或组合物的存在下培养的成骨细胞、成骨祖细胞或骨段或骨片。该损伤可以是例如骨折。该疾病可以是退行性骨病，例如骨质疏松。该提取物或组合物可以提高该损伤或疾病的愈合率或愈合度。该提取物或组合物可以促进骨或软骨的形成、修复或再生。 根据本发明的一个第五方面，提供了一种用于促进在骨或软骨移植物或可植入装置周围的骨或软骨生长的方法，该方法包括在移植或植入操作之前、过程中或之后向受试者给予一个有效量的根据该第一方面的提取物、根据该第二方面的组合物、或者在所述提取物或组合物的存在下培养的成骨细胞、成骨祖细胞或骨段或骨片。该移植物可以是同体移植物或异体移植物。该移植术可以例如用于修复骨折、或用于骨骼融合(例如脊柱融合)目的。该可植入装置可以是一种骨固定装置或假体。根据该第一方面的提取物、根据该第二方面的组合物、或者在所述提取物或组合物的存在下培养的成骨细胞、成骨祖细胞或骨段或骨片可以涂在该假体上，用作一种骨固定装置的辅助物，或者用作一种骨水泥的辅助物用于固定该假体或骨固定装置。根据以上这些方面和实施方案，向受试者给药可以在关节镜或开放手术操作时进行。根据本发明的一个第六方面，提供了一种用于骨形成或生长的方法，该方法包括在一个有效量的根据该第一方面的提取物或根据该第二方面的组合物的存在下，在适宜诱导骨形成或生长的条件下孵育成骨细胞、成骨祖细胞或骨段或骨片。附图简要说明本发明将仅通过非限制的实例，参照附图对本发明进行说明，其中图I示出了 10至14周龄雌性大鼠的皮肤组织学剖面图。A :无治疗；B :每天涂抹椰子油，共七天；C :每天涂抹乙醇中的黄槿，共七天；以及D :每天涂抹椰子油中的黄瑾，共、七天。这些皮肤样本用苏木精和伊红染色，并且放大400倍显示。图2示出了 12周龄雌性新西兰兔的皮肤组织学剖面图。A和B :无治疗；(和0 :每天涂抹椰子油中的滨豇豆、椰子、榄仁和黄槿的组合提取物，共七天出和？每天涂抹椰子油中的黄槿，共七天。这些皮肤样本用苏木精和伊红染色，并且放大40倍(A，C，E)和400倍(B，D，F)显示。图3示出了未治疗(A和B)的和已治疗(C至F)的18月龄雌激素缺乏(在六周龄摘除卵巢)的大鼠与未治疗(G至H)的18月龄非雌激素缺乏(在六周龄进行了对照手术，之后令大鼠恢复)的大鼠以及已治疗的大鼠(I至L)的组织学差异，此前通过截骨术造成股骨的手术性骨折并通过内固定进行手术修复。每天把椰子油中的黄槿提取物涂抹到这些经治疗大鼠的骨折部位，共21天。该骨折组织学样本用苏木精和伊红(A、C、E、G、I、K)和藏红花-0染料(Saffron-0 Stain) (B、D、F、H、J、L)染色，藏红花_0染料把软骨中的蛋白多糖染成紫色，并放大12倍显示。 图4示出了未治疗的18月龄雌激素缺乏(在六周龄摘除卵巢)的大鼠(Ovx对照)(在六周龄进行了对照手术，之后令大鼠恢复)与经治疗的18月龄雌激素缺乏(在六周龄摘除卵巢)的大鼠(Ovx rx)其骨折部位的组织学评分图，此前这些大鼠通过截骨术在股骨造成手术性骨折并通过内固定进行手术修复。每天把椰子油中的黄槿提取物涂抹到这些经治疗的大鼠的骨折部位，共3星期。图5示出了在12周龄的新西兰白兔体内，用截骨术造成的20mm尺骨(包括骨膜)手术性缺损并且没有移植物或替代性填充物的计算机模型(A和C)以及放射线图(B和D)，此前每天涂抹白兔背部的上皮表面而不是骨折部位的肢体(共七天)A和C:带有中间烃提取物的椰子油；C和D :椰子油中的黄槿烃提取物。图6示出了 12周龄的雌性新西兰白兔的组织学剖面图，此前在骨折部位(通过截骨术造成20mm尺骨(包括骨膜)的手术性缺损并且没有移植物或者替代性填充物)每天涂抹(共七天)椰子油中的滨豇豆、椰子、榄仁和黄槿的组合提取物(C和D)，椰子油中的黄槿提取物(E和F)。A和B，未治疗的对照。这些样本用五色染色，并放大12. 5倍(A、C、E)和25倍(B、D、F)显示。图7示出了 12周龄的雌性新西兰白兔的组织学剖面图，此前每天涂抹骨折部位(通过截骨术造成的20mm尺骨(包括骨膜)手术性缺损并且没有移植物或替代性填充物)的上皮表面(共七天)A和B :椰子油中滨豇豆、椰子和榄仁的组合提取物(无黄槿)；(和D :乙醇中的黄槿提取物出和F :乙醇提取后的椰子油中的黄槿提取物；以及G和H :乙醇和烃提取后的椰子油中的黄槿提取物。这些样本用五色染色，并放大12. 5倍显示。图8示出了 12周龄的新西兰白兔通过截骨术造成的20mm尺骨(包括骨膜)手术性缺损的骨生长评分图，此前在骨折部位的上皮表面每天涂抹乙醇中的中间密度黄槿沉淀(HeA中间)、乙醇提取后的椰子油中的黄槿(eAo)、乙醇中的黄槿(eA乙醇)以及乙醇提取后的椰子油中的滨豇豆、椰子和榄仁的组合提取物(eNPKo)。图9示出了雌性新西兰兔脊柱的X-射线图(A-D)和CT扫描图(E)，这些兔子在12周龄时经历了使用从髂嵴收获的同体移植物进行的双侧单水平后外侧融合。手术后进行常规护理(A和B)，或者五天内每天涂抹、之后每周两次涂抹直到六周，将乙醇与烃提取后的椰子油中的黄槿提取物(C至E)涂抹到骨折部位周围的喙部上皮表面，而不覆盖该骨折部位。X-射线显示出双侧的脊柱修复，其中A图未治疗组和C图经治疗组显示出手术后六周的愈合性融合体，以及六周时未治疗动物(B)和经治疗动物(D)的髂嵴处的供体收获位点。CT扫描显示了经治疗动物在六周时的髂嵴(E)。图10示出了雌性新西兰兔的脊柱的组织学剖面图，这些兔子在12周龄时经历了用从髂嵴收获的同体移植物进行的双侧单水平后外侧融合。手术后进行常规护理(A)，或者五天内每天涂抹、之后每周涂抹两次直到六周，将こ醇和烃提取后的椰子油中的5mL黄槿提取物(B)涂抹到骨折部位周围的喙部上皮表面，而不覆盖该骨折部位。这些样本用苏木精和伊红染色，并以放大12. 5倍的复合图像显示，示出了横突和距该椎体侧2-3mm的脊柱融合体。图11示出了经治疗的同体移植物在8周时以及未治疗对照物在12周时的机械测试结果。 图12示出了经以下处理的质谱图A:こ醇和烃提取后的椰子油中的黄槿；以及B :烃中间层。0}本发明的详细说明冠词“ー种”和“一个”在此用于指示该冠词的ー个或ー个以上(即至少ー个)语法对象。作为示例，“ー种元素”是指ー种或ー种以上元素。除非上下文另有要求，贯穿整个说明书和以下的权利要求书，“包括” 一词及其多种变体(例如，“包括了”和“包括着”)应该理解为是指包含所述整体、步骤或整体或步骤的组，但并不排除任何其他整体、步骤或整体或步骤的组。在此所使用，术语“有效量”和“有效剂量”其涵义包括提取物或组合物的ー个无毒但却足够的量或剂量，以便提供所希望的效果。所要求的精确量或剂量将因为涂抹与受试者的不同而变化，这取决于多种因素，例如该提取物或组合物是否在体外、活体外或体内给药；正在治疗的物种；受试者的年龄和总体状况；正在治疗的病况的严重程度；所给予的具体提取物或组合物；给药模式；等等。因此，不可能指定一个精确的有效量或剂量。但是，对于任何给定的情况，本领域的普通技术人员可仅使用常规的试验方法来确定合适的有效量或剂量。在此所使用，术语“提取物”指衍生自ー种或多种植物的活性制剂。在本说明书的上下文中，提及“活性的”是指该提取物能够产生在此披露的所期望的治疗效果。提取物是通过“提取”过程获得的，本领域的技术人员通常应当将该“提取”理解为包括用ー种溶剤、液体、或超临界流体处理植物材料，以便溶解该活性制剂并且从将其从剩余的不想要的植物材料中分离。提取物可以是液体形式(例如煎剂、溶液、输液或酊剂)或固体形式(例如粉剂或颗粒)。在此所使用的术语“组合提取物”指从ー种以上植物物种制得的提取物。在组合提取物中，来自这些植物物种中任ー种的植物材料可以一起或分别进行提取。换言之，来自这些物种中的ー些或全部物种的材料可以在添加该溶剂、液体或者超临界流体之前进行组合，和/或来自这些物种中的ー些或全部物种的材料可以用ー种溶剂、液体或超临界流体単独处理，并且随后将如此获得的制剂组合。这样，可以使用相同或不同的溶剂(或液体或超临界流体)从不同的物种中提取活性制剂。术语“提取物”和“组合提取物”在整个说明书可以互换使用。术语“促进了”和“促迸”及其变体当用于骨和软骨的形成、修复和再生的上下文时是指在此披露的提取物或组合物的诱导、刺激、增强、或者直接或间接地影响或导致新骨和新软骨形成、或骨或软骨修复或再生的能力。这种促进可以在体内、活体外或体外发生。术语“增强了”、“增强”及其变体当用于骨或软骨形成、修复和再生的上下文时是指在此披露的提取物或组合物直接或间接地增强或提高骨和软骨形成、修复和再生所涉及的自然生理过程的活性率或程度。在此所使用，术语“受试者”包括人类、灵长类、家畜动物(如棉羊、猪、牛、马、驴)、实验用实验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(如狗、猫)、表演动物(如狗、猫、猪、牛、棉羊、马)以及圈养的野生动物(如狐狸、袋鼠、鹿)。典型地，该受试者是人类或实验用实验动物。更典型地，该受试者是人类。在此所使用，术语“治疗了”、“治疗”、“预防了”以及“预防”是指以下任ー以及所有用途，这些用途包括以任一方法用于治疗一种状况或症状，预防ー种状况或疾病的确立，或者预防、阻碍、延缓或逆转ー种状况或疾病的进程或其他不希望的症状。因此，术语“治疗”和“预防”以及类似术语应当以其最广泛的含义来理解。例如，治疗并不一定意味着治疗患者直至完全康复 在本说明书的上下文中，术语“药学上可接受的”意思是它所指的化合物适于和身体的组织接触使用，其毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等等并未达到尚可的效益/风险比的程度。如在此所示例，本发明阐明了诸位发明人的令人惊讶的发现，即来自太平洋岛屿的不同植物的提取物当给予至哺乳动物的皮肤时促进骨和软骨修复、以及新骨和新软骨形成中的用途。因此，在此提供的是黄槿的生物活性提取物以及包含这些提取物的组合物尽管以黄槿的提取物为例，还考虑该提取物还可能衍生自任何木槿属(Hibiscussp.)的ー种或多种植物，包括但不限于红叶■ (Hibiscus acetosella)、夏威夷朱丰堇(Hibiscus bracKenriagei)、大麻丰堇(Hibiscus cannabinus)、长柄-木丰堇(Hibiscusdiversifolius) > Hibiscus lavaterioide、鲁威丰堇(Hibiscus Iudwigiiノ、大口十木丰堇(Hibiscus macrophyllus)、Hibiscus macropodus、高红丰堇(Hibiscus elatus)、Hibiscusescobariae、Hibiscus ficulneus、ノ户山笑蓉(Hibiscus paramutabilis)、具柄木丰堇(Hibiscus pedunculatus)、毛茛木丰堇(Hibiscus platanifolius)、福射刺芙蓉(Hibiscusradiatus)、朱丰堇(Hibiscus rosa-sinensis)、玫瑰爺(Hibiscus sabdariffa)、裂瓣朱丰堇(Hibiscus schizopetalus)、史氏;木丰堇(Hibiscus scottiiノ、Hibiscus socotranus、华木丰堇(Hibiscus sinosyriacus)、光売木丰堇(Hibiscus splendensノ、Hibiscus stenanthus、条纹木丰堇(Hibiscus striatus)、木丰堇(Hibiscus syriacus)、三叶木丰堇(Hibiscustrilobusノ、或 Hioiscus waimeae。根据某些实施方案的提取物和组合物还可以包括豇豆属(Vigna sp.)和/或诃子属(Terminalia sp.)的提取物。在具体实施方案中，豇豆属为滨豇豆和/或诃子属为榄仁。还考虑豇豆属提取物可以衍生自下列植物中的ー种或多种，包括但不限于飞蛾J3. (Vigna aconitifolia)、赤ii (Vigna angularis)、虫呙牛藤(Vigna caracalla)、Vignadebilis、云南野紅豆、披针叶紅豆(Vigna Ianceolata)、长叶紅豆(Vigna Iuteola)、滨海 Si ii (Vigna maritime)、黑吉 ii (Vigna mungo)、Vigna o-wahuensis、长虹(Vigna parkeri)、绿豆(Vigna radiata)、金茅5エ豆(Vigna speciosa)、马岛花生(Vignasubterranea)、三裂叶 5エ豆(Vigna tri Iobata)、饭豆(Vigna umbel lata)、Si 豆(Vignaunguiculata)或野迎显(Vigna vexillate)。还考虑诃子属提取物可以衍生自下列植物中的ー种或多种，包括但不限干Terminalia acuminata、翅揽7I一(Terminalia alata)、高山揽仁(Terminalia altissima)、亚马逊揽仁(Terminalia amazonia)、狭叶揽仁(Terminalia angustifolia)、乔木状揽仁(Terminalia arborea)、树状揽仁(Terminalia arbuscula)、群岛揽仁(Terminaliaarchipelagi)、 M Yl 揽仁(Terminalia arjunaノ 、了半J Tj 揽仁(Terminalia australis)、Terminalia avicennioides、油揽仁(Terminalia bellirica)、红果揽仁树(Terminaliabialata)、Terminalia bracnystemma、杨揽仁 uerminaiia brassii)、Terminaliabucidoides、黑揽仁(Terminalia buceras(黑撤揽(Bucida buceras)))、Terminaliabursarina、马尼 SI 揽仁(Terminalia calamansanaiノ、Iロ」于(Terminalia chebula)、Terminalia cherrieri、Terminalia ciliata、黄花揽仁(Terminalia citrina)、■氏揽仁木(Terminalia copelandii)、多皮揽仁(Terminalia corticosa)、Terminalia eddowesii、可食揽仁(Terminalia edulis)、捕圆揽仁(Terminalia elliptica)、绵穗揽仁(Terminalia eriostachya)、红叶揽仁(Terminalia erythrophylla)、法地揽仁 uerminalia ferdinandiana)、Terminalia foetidissima、填揽 7I一 (Terminaliafranchetii)、光叶揽仁(Terminalia glabrescens)、粉叶揽仁(Terminaliaglaucifolia)、Terminalia hararensis、Terminalia hecistocarpa、揽イー树(Terminaliaintermedia)、种特迪 ^!揽仁(Terminalia ivorensis)、Terminaliajanuariensis、Terminalia kaernbachii、Terminalia kangeanensis、Terminalia kuhlmannii、_叶揽仁(Terminalia latifolia)、小叶揽仁(Terminalia mantaly)、Terminalia molinetii、莫氏揽仁(Terminalia muelleri)、千果揽仁(Terminalia myriocarpa)、亮叶揽仁(Terminalianitens)、Terminalia novocaledonica、长圆揽仁树(Terminalia oblongata)、倒卵形揽仁木(Terminalia obovata)、緬甸揽仁木(Terminalia oliveri)、圆维花揽仁(Terminaliapaniculata)、细花揽仁(Terminalia parvifIora)、膜叶揽仁(Terminalia pellucida)、显脉揽仁(Terminalia phanerophlebiaノ、Terminalia phellocarpa、类李个览仁(Terminaliaprunioides)、Terminalia reitzii、Terminalia rerei、Terminalia schimperiana、絹毛揽仁(Terminalia sericea)、布拉斯李子(Terminalia seriocarpa)、近匙叶揽仁(Terminalia subspathulata；、艳HI3揽 1 一 (Terminalia superba)、姆南揽仁或 Terminaliavolucris。还提供了釆用在此披露的提取物和組合物用于促进或增强骨或软骨形成、修复或再生的方法。这些方法尤其可应用于治疗骨或软骨损伤、缺损或疾病。这种损伤、缺损或疾病可以是急性的或慢性的。本领域的技术人员应当很容易地理解与在此披露的实施方案相关的损伤、缺损或疾病的范围，即在该范围内新骨或新软骨形成、受损或有缺陷的骨或软骨的修复、或骨或软骨的再生是希望的或有利的。仅仅作为示例，该损伤可以是例如创伤造成的，例如骨折或半月板损伤。作为示例，这些缺损和疾病包括先天性骨缺损、骨或脊椎变形、骨肉瘤、骨发育不良、骨质疏松症、骨软化症(佝偻病)、成骨不全(脆骨病)、骨的佩吉特氏病、骨关节炎以及其他特点为骨代谢、形成或再吸收异常或与其相关的疾病和状況。在此披露的实施方案也应用于手术操作，以便矫正骨损伤、畸形或疾病，其中骨生长或再生的促进或增强是有利的。例如，在此披露的实施方案可以与以下操作联合使用骨骼融合(例如脊柱融合)操作，椎间盘重建或取出，或植入骨填充材料(例如羟基磷灰石块、脱矿化的骨基质塞、胶原基质)，固定装置(例如ー种杆、螺钉、栓、盘等)，手术植入物或假体装置(例如假体髋部或膝部)，或与骨水泥(例如用于填充骨和假体装置之间的空隙或者把假体装置固定到骨上的骨水泥)结合使用。这种植入材料、植入物或装置可以是可再吸收的或不可再吸收的。在具体实施方案中，用于治疗骨损伤、缺损和紊乱目的的提取物和组合物的应用可以通过使用活体外操作实现。例如，在损伤例如骨折的情况下，ー个或多个骨片或骨段可以从有待治疗的受试者体内取出，并用在此披露的提取物或组合物进行活体外培养。如果条件适宜，这个或这些骨片或骨段和提取物或组合物也可以与骨固定装置或假体一起培养。在适宜的条件下培养适宜的一段时间以后，为了至少启动骨形成、修复或再生，可以将这个或这些骨骨片或骨段以及可任选的骨固定装置或假体再次导入该受试者体内。培养条件将取决于应用，但是适宜的条件可以由本领域的技术人员容易地确定，无需过多实验。可 替代地，环境可能要求必须使用衍生自其他个体或生物体的ー个或多个骨片或骨段。 类似地，成骨细胞或成骨祖细胞可以用在此披露的提取物或组合物进行活体外培养，之后将这些成骨细胞或成骨祖细胞导入需要治疗的受试者体内。这些细胞可以是自然产生的(同种的)、异基因的或异种的。也可以采用活体外细胞疗法，使用取自例如骨髄或成人外周血的间充质细胞、胚胎干细胞、成人干细胞或任何其他专能细胞、多能细胞、全能细胞、或体外产生的“设计者”细胞。在此使用的术语“成骨祖细胞”涵盖了所有具有分化为成骨细胞能力的专能细胞、多能细胞和全能细胞，不管它们是自然衍生的还是人工创造的。本发明的提取物可以是基于水性的、油和/或有机溶剂的提取物，通过任何可获得的植物材料単独地、组合地和/或相继地提取得到，这些植物材料例如是叶、根、树皮、茎、果实、嫩枝、坚果、坚果壳、种子、种皮、果仁、花朵、藤蔓和/或木材。合适的提取エ艺以及合适的提取溶剂和提取液是本领域的技术人员已知的。用于提取的水性溶剂(例如水、酸、碱)、油(例如衍生自椰子的油)以及有机溶剂(这些溶剂可以是极性的(如醇类，例如こ醇)、非极性的(例如己烧)和/或卤代的(如ニ氯甲烷))可依次用于提取或以组合混合物用于提取。重要的是，如在此所示例，该提取物的活性当被提取至椰子油、极性溶剂(例如こ醇)或非极性溶剂(例如异戊烷)时得以保持。根据本发明，使用例如超临界氮或ニ氧化碳的超临界流体提取也可以用来获取提取物。此外，本领域的技术人员还应当了解，本发明的提取物可以经受一个或多个提取后步骤，以便例如提高或保持该提取物的稳定性、修饰或改变该提取物的物理形式、或协助将该提取物配制成用于给予受试者的一种组合物。仅作为示例，ー种液体形式的提取物可以被低压冻干以产生固体形式的提取物。本发明的提取物可以衍生自任何合适的植物材料。合适的植物材料包括叶、根、树皮、茎、果实、嫩枝、坚果、坚果壳、种子、种皮、果仁、花朵、藤蔓或木材。该植物材料可以是例如新鮮的、干燥的或冻干的。对于任意给定的植物物种，ー种以上的植物材料可以用于提取物的生产。当提取物衍生自黄槿时，典型地该提取物是叶、藤蔓和/或豆子提取物。本发明的一种或多种提取物可以根据本发明以药物组合物的形式给药，这些组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这些提取物还可以与其他治疗剂组合，例如但不限于抗生素、抗微生物剂、消毒剤、麻醉剂和/或其他骨或软骨生长或修复的促进剂。应当了解，对于任何特定个体，本发明的组合物的具体剂量水平将取决于各种因素，包括例如所采用的具体提取物的活性；有待治疗的个体的年龄、体重、一般健康状况和饮食；给药时间；这种/这些提取物的稳定性；身体上的涂药部位、以及与其他任何治疗或疗法的組合。根据环境条件和有待治疗的个体的情况，可以使用按照要求确定的剂量水平和模式进行单次或多次给药。有技术的受众可以容易地确定合适的剂量方案。可以应用一个宽的剂量范围。考虑到人类受试者，例如，每天每千克体重可以给予从大约0. Img到大约Img的提取物。剂量方案可以进行调整以提供最佳的治疗反应。例如，可以将数个分开的剂量以每小时、每天、每周、毎月或其他合适的时间间隔进行给药，或者该剂量可以根据情况的急迫性所要求地成比例地減少。—般而言，一个有效剂量预计是在姆24小时姆千克体重大约0. OOOlmg到大约 IOOOmg的范围内；典型地,姆24小时姆千克体重大约0. OOlmg到大约750mg ;姆24小时姆千克体重大约0. Olmg到大约500mg ;姆24小时姆千克体重大约0. Img到大约500mg ;姆24小时姆千克体重大约0. Img到大约250mg ;姆24小时姆千克体重大约I. Omg到大约250mg。更典型地，一个有效剂量预计在姆24小时姆千克体重大约I. Omg到大约200mg的范围内；每24小时每千克体重大约I. Omg到大约IOOmg ;每24小时每千克体重大约I. Omg到大约50mg ;姆24小时姆千克体重大约I. Omg到大约25mg ;姆24小时姆千克体重大约5. Omg到大约50mg ;姆24小时姆千克体重大约5. Omg到大约20mg ;姆24小时姆千克体重大约5. Omg到大约15mg。该提取物在局部施用的组合物中的存在量可以是大约0. 001% (W/W)与大约15% (W/W)之间、或大约0. 001%与大约12%之间、或大约0. 001%与大约10%之间、或大约0. 005%与大约10%之间、或大约0. 01%与大约10%之间、或大约0. 05%与大约10%之间、或大约0. 05%与大约5%之间。在此披露的组合物可以通过任何方便或合适的路径给药，例如通过胃肠外、局部、ロ服或经鼻路径给药。胃肠外给药可以包括，例如骨内输液、或鞘内、静脉内、动脉内、肌内或皮下的给药。在某些实施方案中，在关节镜或开放手术操作时采用在此披露的多种方法和组合物可能会影响治疗。典型地，局部施用的配置品包括本发明的一种或多种提取物，连同一种或多种可接受的载体以及任选的任何其他治疗成分。适合局部给药的配置品可以为任何合适的形式，例如可以按配方制成搽剂、洗剤、霜剂、凝胶、软膏或糊剂。药学上可接受的载体或稀释剂的例子是去离子水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油(arachis oil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、こ基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇，例如こ醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基ニ醇或低级亚烷基ニ醇，例如聚こニ醇、聚丙ニ醇、こニ醇、丙ニ醇、1，3-丁ニ醇或甘油；月旨肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蘧酸异丙酯或油酸こ酯；聚こ烯吡咯烷酮；琼脂；卡拉胶；西黄蓍胶或阿拉伯胶以及石油膏。典型地，这种或这些载体按重量计将构成这些组合物的10%至 99. 9%o根据本发明的洗剂包括那些适合涂抹到皮肤或表皮附属物的洗剂。涂抹到皮肤的洗剂或搽剂也可以包括促进皮肤干燥和使皮肤凉爽的药剂(比如一种醇或丙酮)，和/或加湿剂(例如甘油)；或油(例如椰子油、蓖麻油或落花生油)根据本发明的霜剂、软膏或糊剂是该提取物的半固体配制品，用于外用。这些配制品可以通过将细粒或粉状的提取物单独与ー种油状或非油状的基质混合，或者该提取物在溶液中或悬浮于水性或非水性流体中与以上基质混合。该基质可以包括烃类，例如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；胶水；自然来源的油，例如椰子油、杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或羊毛脂衍生物，或脂肪酸，例如硬脂酸或油酸，连同一种醇，例如丙ニ醇或聚こニ醇。本发明的这些组合物能够按照以下量值包括在局部施用的运载体中约0. 001%(W/W)与约90% (W/W)之间、或约1% (W/W)与约50% (W/W)之间，或约1% (W/W)与约40% (W/W)之间，或约 1% (W/W)与约 20% (W/W)之间、或约 0. 01%、0. 5%、1%、2%、3%、4%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%。这些提取物和/或组合物还能以任何形式浸溃到透皮贴剂、硬膏剂和敷料(例如绷带或水状胶体敷料)中，例如以液体或者半液体的形式。这些提取物和/或组合物也可以涂布到骨固定装置、假体或骨水泥上，或者用作骨固定装置、假体或骨水泥的辅助物。这些提取物和/或组合物也可以用作骨移植填充物或骨替代品的添加剂，例如同种移植骨、轻基磷灰石、wo 11 ano site或磷酸三I丐。在特定环境下，例如在术后促进骨和软骨的形成、修复或再生中，可以适当地通过胃肠外给药(典型地注射)来对这些组合物进行给药。适宜于注射用途的药物形式包括无菌水溶液(当为水溶性吋)或分散剂，以及用于临时配置无菌注射液的无菌粉末。该药剂在制备和储藏条件下必须是稳定的，并且保存时必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。该载体可以是ー种溶剂或分散介质，包含例如水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇和液体聚こニ醇等)、它们适当的混合物以及植物油。适宜的流动性可以例如通过使用一种包衣剂(例如卵磷脂)、在分散剂的情形下通过保持所要求的粒径，以及通过使用表面活性剂来保持。防止微生物发挥作用可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酷、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在多数情况下，优选包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在这些组合物中使用延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。无菌注射液是通过将活性化合物以所要求的量与以上列举的各种其他成分按照要求一起掺入到合适的溶剂中、之后过滤灭菌制备的。通常，分散剂是通过将不同的灭菌提取物与以上列举的所要求的其他成分一起掺入到在ー种含有基本分散介质的无菌运载体中而制备的。在用于制备灭菌注射液的灭菌粉末的情形下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从预先无菌过滤的溶液中产生该提取物的粉末以及任何额外的所希望的提取物。本发明的组合物也能以单位剂量的形式方便地呈现，并且以药学领域中熟知的任何方法制成。该方法可以包括将ロ服组合物的多种组分与ー种载体结合，该载体构成了一种或多种辅助成分。一般而言，这些组合物通过以下方法制备将该ロ服组合物的组分与一种液体载体或细粒固体载体均匀一致地结合，然后若有必要将该产品塑形为所希望的组合物。适宜ロ服给药的组合物能以不连续的单元(即，剂型)存在，例如明胶胶囊或HPMC胶囊、药囊或片剂，每个単元含有ー个预定量的组合物的每种组分，该组分为粉末、颗粒、水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液、或水包油液体乳剂或油包水液体乳剤。当该组合物被配制成胶囊时，该ロ服组合物的组分可以与ー种或多种药学上可接受的载体进行配制，这些载体例如淀粉、乳糖、微晶纤维素和/或ニ氧化硅。额外的成分可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁和/或硬脂酸钙。片剂可以通过压片或模印制备，任选地与ー种或多种辅助成分一起。压制片可以通过以下方式制备在一台合适的机器中以自由流动的形式压制该ロ服组合物的组分，例如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂(例如硬脂酸镁或硬脂酸钙)、惰性稀释剂或表面 活性/分散剂混合。模印片可以通过在一台合适的机器中模印经惰性液体稀释剂润湿的粉末状组合物的混合物而制成。这些片剂可以任选地进行包衣，例如用肠溶包衣剂，并且可以进行配制以便使该组合物在包衣内缓慢或受控释放。本发明考虑了多种联合疗法，其中在此说明的提取物和组合物与其他合适的药剂或治疗方法共同实施，这些药剂或治疗方法可以促进所希望的治疗效果。例如，人们可以寻求将抗生素、抗微生物剂、麻酔剤、镇痛剂、或其他骨或软骨的生长或修复促进剂与在此披露的提取物或组合物联合给药。提及“联合用药”是指对相同的配置品或两个不同的配置品通过相同或不同的路径同时给药，或按照相同或不同的路径依次给药。提及“依次”给药是指两类药剂的给药时间差为数秒钟、数分钟、数小时或数天。这些药剂能以任意顺序给药。例如，本发明的实施方案考虑在该提取物或组合物给药之前或之后给药ー种脂质或油，例如椰子油。本说明书中所引用的任何现有出版物(或从它派生的信息)或任何已知的问题，不是也不应被视为承认或允许或以任何形式暗示该现有出版物(或从它派生的信息)或任何已知的问题构成了与本说明书相关的技术领域的常见一般性知识的一部分。现在參考以下具体实例说明本发明，这些实例不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。实例实例I-滨豇豆、椰子、榄仁和黄槿在椰子油中的组合提取物的制备将椰子油(200mL)加入到滨豇豆的新鲜碎叶(IOOg)以及榄仁的新鲜碎叶(IOOg)中。将该混合物放进坩埚中，在100°c下水浴20分钟。将混合物从热源移开，并立即过滤和挤压以提取椰子油。将得到的含有滨豇豆和榄仁提取物的椰子油添加到具有绿色坚果的椰子的新鲜碎壳(IOOg)以及黄槿刮下的树皮(IOOg)中。让该混合物静置沉降4h，然后过滤挤压以提取椰子油。然后倒置椰子油，并将其存储于20°C以下，直到椰子油凝固。混合物中任何剰余的水分或固体通过从固化的椰子油中倾析而移除。然后将椰子油在大约56°C的热水浴中加热，并过滤。所得的滤液含有滨豇豆、椰子、榄仁和黄槿的组合提取物。
实例2-黄槿提取物的制备2. I椰子油中的黄槿提取物将黄槿的新鲜碎树皮(IOOg)浸泡在椰子油(IOOmL)中。通过冷压黄槿与椰子油的混合物，或加热该混合物来制备提取物。冷压是通过将黄槿与椰子油混合物放入一个新咖啡柱塞中，让混合物静置沉降lh，然后下压柱塞从而提取油。将该混合物再静置沉降5min，并再次下压柱塞以释放更多的油。将该过程重复5次，直到压不出油。当通过加热制备提取物时，将黄槿与椰子油混合物在坩埚中在100°C下水浴中加热20min，从热源移开，然后立即过滤和压榨以提取椰子油。冷压或加热以及过滤之后在提取物中剰余的任何水分或固体通过以下方法被移除倒置该椰子油提取物，并将其存储在20°C以下，直到椰子油凝固，然后倾析凝固的椰子油，或在分液漏斗中倾析。2. 2こ醇提取后的椰子油中的黄槿提取物将黄槿的新鲜碎树皮(IOOOg)浸没在95% -100%的こ醇(2000mL)中，并让其浸 泡6h。除去こ醇，在第二份こ醇(2000mL)中将黄槿再浸泡6h。将所得的こ醇提取物加到椰子油(250mL)中。一半以上こ醇的体积通过在こ醇沸点以上加热而去除。然后按照以下方法提取椰子油在倾析器中静置至少2h之后从溶液中倾析；或者倒置该椰子油提取物，并将其存储在20°C以下，直到椰子油凝固，然后倾析凝固的椰子油。2. 3こ醇和烃提取后的椰子油中的黄槿提取物把黄槿的新鲜碎树皮(IOOOg)浸没在95% -100%的こ醇(2000mL)中，并让其浸泡6h。然后除去こ醇，将黄槿在第二份こ醇(2000mL)中再浸泡6h。将得到的こ醇溶液与己烷、戊烷、甲基丁烷或ー个当量的烃或氟/氯/溴烃(250mL) 一起搅动。在倾析器中静置至少2h之后，从溶液中倾析烃层和油性泡沫层，或者将こ醇溶液从95%稀释到ー个较低的浓度，通常为但不一定是50%的こ醇，然后在各层沉降后倾析。将水(250mL)或醇(250mL)加入到提取到的烃层。向其中加入椰子油(250mL)，搅动该混合物并允许其沉降。将该混合物加热到该烃的沸点，除去该烃。2. 4こ醇提取后的椰子油中的黄槿提取物将黄槿的新鲜碎树皮(IOOOg)浸没在95% -100%的こ醇(2000mL)中，并浸泡6h。然后除去こ醇，将滨豇豆在第二份こ醇(2000mL)中再浸泡6h。将得到的こ醇提取物与椰子油(250mL) —起搅动。在倾析器中静置至少2h之后，从溶液中倾析出该烃；或者将こ醇溶液从95%稀释到ー个较低的浓度，通常为但不一定是50%的こ醇，然后在各层沉降后倾祈。当混合物搅动和沉降时，通过将ー种低沸点烃加入到该混合物中可以促进椰子油的倾析。然后倒置椰子油，并将其存储在20°C以下，直到椰子油凝固，或者通过在分离器中倾析。实例3-黄槿的单个提取物对于皮肤的作用对在实例2中所说明而制备的提取物对于皮肤的活性进行评估。日剂量为lmL椰子油中的黄槿提取物(实例2. I)和ImLこ醇中的黄槿提取物(实例2. 2)。将这些提取物局部涂抹到10-14周龄雌性大鼠背部的上皮表面。对照组为每天用ImL椰子油治疗或不治疗的10-14周龄雌性大鼠。图IA至ID示出了经以下处理7天时的皮肤组织学未经治疗的对照组(IA);每天涂抹椰子油(IB);こ醇中的黄槿提取物制剂(IC);以及こ醇提取后的椰子油(ID)。这些组织学剖面图表明，该提取物在こ醇中的活性有限，但是椰子油中的提取物诱导上皮肥大以及特定毛囊中的上皮附属物。对实例I和2. 2中所述而制备的提取物对皮肤的活性进行评估。将日剂量ImL的提取物局部涂抹到12周龄雌性新西兰兔背部的上皮表面。对照物是12周龄雌性新西兰兔的未经治疗的皮肤。图2A至2F示出了经以下处理7天时的皮肤组织学未治疗的对照物(2A和B)；以及每天涂抹如实例I所述而制备的椰子油中的滨豇豆、椰子、榄仁和黄槿组合提取物(2C和D);以及如实例2. 2所述而制备的椰子油中的黄槿(2E和F)。这些组织学剖面图表明，这些提取物诱导了上皮肥大以及特定毛囊中的上皮附属物。实例4-治疗雌激素缺乏骨和非雌激素缺乏骨的 骨折进行了ー项研究来评估如实例2. I所述制备的黄槿提取物对于雌激素缺乏和非雌激素缺乏大鼠的骨折修复的作用。在这项研究中，将日剂量ImL的提取物局部涂抹到18个月龄雌激素缺乏(在6周龄时摘除卵巣)的大鼠以及18个月龄卵巢完好(在6周龄时进行了对照手木，并让大鼠恢复)的大鼠的上皮表面，此前通过截骨术造成股骨骨折并且通过内固定进行手术修复。将该提取物毎日涂抹到试验动物上，共计3周。对照动物是没有局部涂抹提取物的18个月龄雌激素缺乏(在6周龄时摘除卵巣)的大鼠以及18月龄卵巢完整的大鼠。在3周时评估这些动物的组织学，特别要注意愈合骨折中软骨以及新骨的形成。图3A至3H示出了骨折部位的组织学。结果表明，治疗组中沿软骨帽的广泛的新软骨生长以及新骨形成，特别值得注意的是发生在雌激素缺乏骨中的量值。图4是ー个柱状图，示出了未经治疗的雌激素缺乏大鼠(Ovx对照)与经治疗的雌激素缺乏大鼠(Ovx rx)的骨折部位的组织学评分。为了确定总体组织学得分，对以下骨折愈合和组织响应參数进行评分愈伤组织形成、骨愈合、骨髄变化以及皮质重塑。每个參数的评分为从0(没有形成愈伤组织；骨折中没有新骨；纤维组织或红色；并且没有重塑)到3 (整个缺损形成了完整的愈伤组织；全骨桥愈合；成人型脂髓；以及完全重塑皮质)，其中评分I表示轻度愈合(< 50 % )，并且评分2表示中度愈合(> 50 %，但小于完全骨折愈合或组织反应)。3周后，与未治疗的雌激素缺乏的大鼠相比，经治疗的雌激素缺乏的大鼠的骨折部位的骨折愈合和组织反应的组织学总评分显著更高。实例5-骨折治疗进行了ー项研究以评估如实例I和2. I所述制备的黄槿提取物对骨折愈合的作用。在该研究中，将日剂量ImL的提取物局部涂抹到12周龄的新西兰白兔的上皮表面，此前用截骨术造成20mm尺骨(包括骨膜)的手术性缺损并且没有移植物或替代性填充物。将该提取物每天涂抹这些实验动物，共计I周。对照动物为没有局部涂抹该提取物的12周龄新西兰白免。在I周时，评估这些动物的放射学和组织学数据，特别注意软骨和新骨形成。图5A至是骨的放射照片，而图6A至6F以及7A至7D示出了该骨折部位的骨缺损的组织学图像。这些图表明黄槿提取物对骨折愈合的作用。七天后，与未经治疗或对照治疗部分相比，在骨折部位明显有更多的骨形成、新软骨形成和血管分布。图8是ー个骨生长评分的柱状图，该图示出了使用基于骨或软骨占用空间百分比的愈合评分定义来评价的缺损的骨愈合。使用了以下的评分系统0 =无可见骨；1 =最小(1%至20% )新骨生长且无软骨；2 =轻度(1-20% )软骨，具有新骨生长；3 =中度(20%至40% )软骨和骨生长；4 =明显(60%至80% )软骨和骨生长；5 =缺损完全充满新的骨和软骨；6 =缺损填满新骨而没有软骨；7 =皮质骨取代编织骨；并且8 =新的骨髄腔形成。7天后，与在未经治疗或对照治疗部分中用こ醇中的中间密度黄槿沉淀(HeA中间)、こ醇中的黄槿(eAこ醇)、或こ醇提取后的椰子油中的滨豇豆、椰子和榄仁的组合提取物(eNPKo)进行治疗的骨折部位相比，用こ醇提取后的椰子油中的黄槿(eAo)所治疗的骨折部位明显有更多骨形成。实例6-脊柱融合自体移植后的骨形成进行了ー项研究以评估如实例2. 4中所述制备的黄槿提取物对骨折修复的作用。在这项研究中，将日剂量Iml的提取物局部涂抹到12周龄的新西兰白兔 的上皮表面，此前将兔子麻醉并使用从髂嵴收获的自体移植物进行双侧单水平后外侧融合。将提取物(5mL)每天涂抹到这些试验动物上，共5天，然后每周两次直到处死。对照动物为没有局部涂抹该提取物的12周龄的新西兰白兔。图9A至9E示出了经治疗以及未经治疗的对照动物其脊柱的X射线图和CT扫描图。这些图像显示了木槿的提取物对自体移植部位周围骨生长的作用。与未经治疗或对照治疗的骨折相比，仅七天之后骨折部位就有了更多的骨形成、新的软骨形成以及更大的血
管供应。图IOA和IOB显示在6周时的脊椎组织学。图IOA示出了在6周时对照自体移植的组织学，用苏木精和伊红染色覆盖整个脊柱融合体。在具有良好形成的髓隙与致密皮质骨(A)的融合体的每一端可以看出横突，并且与该横突相邻的是少量的软骨(B)。自体移植的骨片仍然可见并且是坏死的，有腔隙损失(C)。该融合体的中心主要是纤维组织(D)以及一些新的编织骨(E)。图IOB示出了在6周时经治疗的自体移植物的组织学，用苏木精和伊红染色覆盖整个脊柱融合体。在具有良好形成的髓隙和致密皮质骨(A)的融合体的每一端可以看出横突，并且与该横突相邻的是皮质的新骨(B)。自体移植物的骨片几乎不可见，并且大多被吸收和替换(C)。该融合体的中心主要是软骨(D)、新髓隙(E)和一些新的编织骨(F)。图11示出了与在12周未经治疗的对照物相比，在8周经治疗的自体移植物的机械测试結果。在所有脊椎中，手术切断韧带和椎间盘，留下横突脊柱融合体作为椎体之间的桥梁。施加荷载，直到该融合体断裂。对每个样本记录峰荷。图11所示的数据表明，8周治疗组至少与12周对照ー样强，并且具有更大骨強度的趋势。实例7-分析黄槿提取物开发了ー种使用气相色谱-质谱(GC-MS)分析来研究这些提取物组合物的方法。例如，对こ醇和烃提取后的椰子油中的黄槿提取物(实例2. 3)和该烃中间层进行GC-MS分析。图12A示出了椰子油中的黄槿提取物的质谱图，主峰在30. 99min。该中间层也包含在30. 99min的峰(图12B)，然而，该峰比椰子油中的黄槿提取物观察到的峰至少小7倍。概括而言，椰子油中的黄槿提取物的质谱图中的主峰在30. 99、35. 47、37. 48、39. 56、42. 85、43. 28,49. 04,52. 51,55. 97和58. 54min。大多数次峰对应于在椰子油中发现的脂肪酸こ酷。


在此说明了黄槿的生物活性提取物以及包含该提取物的多种组合物。本发明还提供了该提取物和这些组合物的治疗用途，特别是用于促进骨和软骨损伤的愈合以及促进骨和软骨的形成。