专利名称：SAA1β/β纯合子基因型在肝硬化预后诊断及肝硬化诊断中的应用的制作方法肝硬化(Cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复而作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化是肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程；过度纤维化使肝脏萎缩变硬，最终引起肝硬化失代偿或肝功能衰竭而导致患者死亡。早在2002年，WHO统计数据即显示全球每年死于肝硬化的人数近8万例。至2010年，肝硬化已经是公认的导致人类死亡的前10大疾病。因此，肝硬化已成为全球性的公共健康问题，发病率之高，危害之重，不容忽视。由于导致肝硬化最常见的病因为乙肝(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染，世界人口总数的约1/3 (20亿)感染过或正在感染乙肝病毒，其中有3.5亿人为终身感染者。而我国的HBV感染率已经高达10%。因此，由HBV和HCV感染导致的肝硬化在我国的发病逐年增加。据不完全统计，我国慢性乙型肝炎病人约为2000万人，其中近25 30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化，其中5 20万可能发展为肝癌。而我国每年死于肝硬 化的人数高达20万。因此，如果能够发现易感人群并进行早期诊断和干预，则会大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，降低患者死亡率、减少医疗费用并提高患者的生活质量；同时，肝硬化易感人群的发现对于了解其发病机理并寻找干预手段也有重要科学意义和临床应用价值，这将对人类最终攻克这一顽疾有重要意义。人类血清淀粉样蛋白Al (Serum Amyloid Al, SAA1)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白。其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa，其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAAl是一种急性炎性蛋白，因为在急性炎症中，SAAl可由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成，浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般为910±270微克/升)。此外，SAAl在生理状态下可与高密度脂蛋白(HDL)结合，在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其水平升高。但是，近年来大量研究表明=SAAl已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白，而是作为天然固有免疫的调理素，SAAl可与IL-6、TNF-a等炎症性细胞因子相互作用，参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现SAAl在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(RA)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。在肝脏疾病发生中，香港大学He博士等发现，在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝组织中，SAAl蛋白明显增高。众所周知，乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来。其中，SAAl是否参与上述病变至今未见报道。但是法国巴斯德研究所的研究表明=SAAl蛋白与肝炎病毒的感染有着密切的关系，乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAAl蛋白表达明显受抑，提示SAAl可能与HBV感染和后续病变有关。因此，本发明提出SAAl蛋白与乙肝引起的肝硬化相关、通过SAAl蛋白变化检测或判断肝硬化发病、诊断和干预的新的应用方法。基因多态性(Polymorphism)是指在一个生物群体中，同时存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性(Genetic Polymorphism)或基因多态性。基因单核苷酸多态性(Single Nuclear Ploymorphism, SNP)是指基因序列内的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失，插入和置换。人类基因多态性与疾病发生和诊断与治疗有密切的关系，多态性的变化不仅在阐明机体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性和预测转归上都起着重要的作用。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。因此，基因多态性研究已经成为临床医学及预防医学研究的新领域。由于基因多态性有明显的种族差异，在不同种族之间可能表现出很大差异。所以，开展我国人群中与肝硬化相关的基因多态性研究具有重要的意义。通过对于肝硬化易感基因多态性研究，建立对易感性生物标志物的分析方法，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，便于采取针对性预防、在HBV感染人群中早期诊断肝硬化、对于接受治疗的肝硬化患者通过多态性分析预测其治疗效果和预后转归等都有重要价值。目前已知SAAl有SAAl α、β、γ三种等位基因,可分为α/α，α/β，a / γ , β /β，β/Y , Υ/Υ6种 基因型(表I)。已有研究表明不同的SAAl基因型在人群中所占的比例存在差异性。近年来，越来越多的研究聚焦在了 SAAl基因型与疾病的关系上。众多的研究表明，SAAl基因型和疾病有相关性。例如，Yamada等对321名日本人SAAl基因型的研究发现，α(1.1)、β (1.5), Y (1.3)这3个等位基因在日本人中的分布频率分别为0.310，0.347，0.330。Ishii等发现，在127例RA患者中，发生淀粉样变者最常见的基因型是SAAl y/y (1.3/1.3)。淀粉样沉积物的出现和SAAl y的基因频率高度相关。且在Y /Y纯合子基因型中，血清中SAAl蛋白的浓度水平，以及SAAl与同为急性期反应蛋白CRP的比值高于其他基因型。而在高加索人中，淀粉样变与SAAla等位基因的频率呈正相关。在地中海出血热的研究中，有文献报道，SAAl a型的发病率是其他型别的7倍。而在SAAl的SNP分析研究中，也有报道表明不同的基因型在HDL-C的水平上存在显著差异。但是，有关SAAl基因型与肝硬化的相关性研究至今未见报道。基因多态性研究中目前普遍使用的是“限制性内切酶片段长度检测(RFLP) ”。该方法步骤极为繁琐、重复性差，不易进行大规模SNP分析。因此，开发一种简便、快速、准确又经济的SAAl基因多态性检测方法，对于疾病的诊断有重要意义.。本发明通过设计SAAl等位基因的SNP位点位于下游引物3’端的末端并对其进行硫代磷酸化修饰，采用改进的实时荧光定量等位基因特异性PCR (Real-time andAllele-specific PCR)技术，对SAAl基因型进行分析，并研究SAAl基因型与肝硬化发病的关系。本发明研究结果表明=SAAl基因型在中国人群中的分布与其它人种有很大的差异，而且其基因型的确与肝硬化的发生率有关并可作为生物标记物应用于肝硬化诊断/预后诊断。本发明首次提出SAAl β/β纯合子基因型与肝炎和肝硬化有正相关性、SAAl β/β纯合子基因型作为肝硬化生物标志物和肝硬化高危因子，可用于肝硬化诊断与乙肝型肝硬化预后诊断。因此，本发明还对SAAl β/β纯合子基因型发展为肝硬化诊断指标进行了评估。本发明通过改良的实时检测PCR技术，在进行了较大乙肝、肝硬化患者及正常对照人群的临床样本中SAAl基因型检测分析后，首次发现并提出SAAl β / β纯合子基因型与肝硬化的显著相关性；提出了 SAAl β/β纯合子基因型是肝硬化的危险因子，具有很高的肝硬化预后诊断价值；首次鉴定了 SAAli3/i3纯合子基因型作为肝硬化的生物标志物，对于非侵入性肝硬化诊断试剂的开发具有重大的意义；并且，本发明所设计的特定引物适用于采用实时荧光定量PCR检测人SAA1SNP，本发明方法能够简便、准确、快速地实现对肝硬化易感人群的检测；并且适用于SAA1SNP与其他相关疾病的研究。表1:SAA1基因型相对应的氨基酸变异及位点本发明公开了SAA1 β/β(1.5/1.5)纯合子基因型在肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断中的应用，以及其在制备肝硬化预后诊断和/或肝硬化诊断试剂中的应用。本发明通过实时荧光定量等位基因特异性PCR检测人SAA1 β/β纯合子基因型和非SAA1 β/β纯合子基因型，从而实现对肝硬化易感人群的检测。