专利名称：重组产生的过敏原的制作方法狗毛皮垢屑(dander)是室内过敏症的常见原因，室内过敏症的症状包括鼻炎、结膜炎、支气管炎症和哮喘。狗过敏原不但可在将狗作为宠物饲养的室内检测到，而且也可在诸如学校和日托中心等通常没有狗的其它场所检测到。对狗的过敏症伴随且依赖于与从狗毛发和毛皮垢屑释放的蛋白质的致敏。在对狗疑似过敏的情况中，临床研究包括通过皮肤点刺的致敏分析或使用狗毛发和/或毛皮垢屑的提取物的特异性IgE抗体测量。对特异性IgE的实验室免疫测定如Wiadia ImmunoCAP 可使用天然狗毛皮垢屑的提取物来检测大多数对狗致敏的情况，这源于其有利的测定条件和可用于过敏原附着的大固体相。狗毛发和毛皮垢屑提取物包含过敏原性和非过敏原性蛋白的复合物[2，3]。至今已确定四种狗过敏原并详细研究Can fUCan f2、Can f3和Can f5[4-6]0前两种均为脂质运载蛋白(lipocalin)家族的成员，且已被纯化并作为重组蛋白表达W，7]。Can f3 (狗血清白蛋白)是相对保守的蛋白，显示出与其它哺乳动物白蛋白的广泛的交叉反应性[8]。 Can f5(狗前列腺激肽释放酶)最近已被描述为是主要的狗过敏原并显示出与人前列腺特异性抗原(PSA)的交叉反应[5]。在至今已知的狗毛皮垢屑过敏原中，Can fl和Can f5似乎是最重要的，分别结合约50%和70%来自狗过敏症对象的IgE抗体[5，9]。虽然约20-40%的成年狗过敏症个体显示出结合Can f2或Can f3的IgE抗体，但很少的个体显示出仅与或甚至主要与这些抗原中的任一种反应[5，9]。在最近报导的研究中，发现尽管对天然狗毛皮垢屑提取物致敏，但少部分狗过敏症患者显示出不与Can fl、Can f2、Can f3和Can f5结合的IgE抗体[5]。除了上述过敏原外，已报导区别于Can fl和Can f2的IgE反应性、18kDa脂质运载蛋白样蛋白，并将其命名为Can f4[9]。报导称在25名狗过敏症患者中有15名(60%) 患者显示出在免疫印迹中对此ISkDa带的血清IgE反应性，这使其成为潜在地重要狗过敏原组分。然而，此过敏原在SDS PAGE凝胶中仅表征为13个氨基酸N端序列，此序列与来自狗的任何已知蛋白序列均不匹配。因此无法知晓全蛋白序列，且重组蛋白的克隆尚未进行。 此天然蛋白既未被纯化，也未提示如何能实现Can f4的克隆。￠: Saarelainen et al.出片反 Abstract Book of the 3rd International Symposium on Molecular Allergology in Salzburg April 18-20,2008 的摘要中，表明 Can f4特异性mAb识别奶牛毛皮垢屑提取物中的20kDa的蛋白。在科学杂志Allergy的专刊中发表了 2009年6月6_10日在华沙举行的第28次欧洲过敏症和临床免疫学大会的摘要，摘要公开了已克隆编码全长Can f4的cDNA[Allergy 64(Suppl.90) :179-538)。然而，并未说明如何实现此克隆，且未给出核酸或氨基酸序列。
本发明人已确认本领域需要进一步表征和确立过敏原Can f4重要性。如上所述，用于特异性IgE的实验室免疫测定可使用天然狗毛皮垢屑提取物来检测大多数对狗致敏的情况，这源于其有利的测定条件和可用于过敏原附着的大固体相。然而，在小型化或非实验室免疫测定如过敏原微阵列或医生诊所测试中，已发现次有利的测定条件、抗体结合过敏原试剂的较低载量和有限效价的天然过敏原提取物的组合引起不足够的诊断灵敏度。类似的情况也存在于对其它动物上皮的特异性IgE的免疫测定。因此，在一些情况中需要使用纯的过敏原性蛋白以实现在特异性IgE诊断测试中的足够的灵敏度。 组分分解诊断(component-resolved diagnostics)的概念提出了对使用重组过敏原组分另一种需要[24]。根据此概念，分析对单独的过敏原组分而非全部过敏原提取物的IgE应答使得能够更好地区分交叉反应性过敏原致敏和天然过敏原致敏。因此，需要鉴定和作为重组蛋白产生来自特定过敏原来源的全部潜在过敏原组分。本发明人在尝试使用本领域已知的标准方法测序和克隆Can f4时遇到了问题。如以下结果部分所述，此问题仅能通过使用非常规方法解决。本发明基于意想不到的发现，即 IgE抗体与狗和母牛毛皮垢屑提取物均结合，以及基于理解为了鉴定核酸序列且完成Can f4克隆，本发明人必需将Can f4与来自其它生物体的蛋白相关联。一方面，本发明涉及重组产生的Can f4过敏原。另一方面，本发明涉及编码所述重组产生的Can f4过敏原的核酸。再一方面，本发明涉及包括所述核酸的载体和包括所述载体的宿主细胞。又一方面，本发明涉及重组产生的Can f4，其用于体外诊断I型过敏症。本发明另一方面涉及产生过敏原组合物的方法，包括将重组产生的Can f4过敏原加入至包括过敏原提取物和/或至少一种纯化的过敏原组分的组合物中的步骤。另一方面，本发明涉及“掺入(spiked) ”重组产生的Can f4过敏原的过敏原组合物。此类过敏原组合物可为不具有或具有少量Can f4过敏原的过敏原提取物或纯化和/ 或重组过敏原组分的混合物，其中加入重组产生的Can f4过敏原以结合来自患者的IgE， 所述患者的IgE不结合或很差地结合所述组合物中的其它过敏原组分。本发明的此方面也涉及产生此组合物的方法，所述方法包括将重组产生的Can f4过敏原加入至过敏原组合物，如过敏原提取物(任选地掺入其它组分)或纯化的天然或重组过敏原组分的混合物的步骤。再一方面，本发明涉及用于诊断患者中I型过敏症的体外诊断方法，其中使来自所述患者的体液样品如血液或血清样品接触根据在前方面的重组产生的Can f4过敏原或组合物，并检测所述患者的样品是否包含特异性结合重组产生的Can f4过敏原的IgE抗体，其中特异性结合所述Can f4过敏原的此IgE抗体的存在表明存在I型过敏症。此诊断方法可以本领域熟知的任何方式进行。重组产生的Can f4过敏原可例如固定在如常规实验室免疫测定、微阵列或侧向层析测定的固体支持物上。又一方面，本发明涉及用于进行根据在前方面的方法的诊断试剂盒，所述试剂盒包括重组产生的Can f4过敏原。本发明进一步涉及治疗哺乳动物I型过敏症的方法，包括向需要此治疗的个体施用重组产生的Can f4过敏原，或其IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式，如下所述。在一个实施方式中，所述哺乳动物为狗。在另一个实施方式中，所述哺乳动物可为具有显示出与重组产生的Can f4过敏原有同源性的哺乳动物过敏原的任一种哺乳动物，条件是所述个体显示出与所述哺乳动物过敏原如Bos d23k的IgE交叉反应性。本发明的此方面还涉及重组产生的Can f 4在包括如组分分解免疫治疗等此类免疫治疗中的应用。修饰的实例包括但不限于分子的断裂、截短或串联化；内部片段的缺失；氨基酸残基的取代；结构域重排；或通过破坏二硫键或其与另一个大分子结构结合，或通过去除蛋白结合低分子量化合物的能力而破坏至少部分三级结构。另一方面，本发明涉及重组产生的Can f4过敏原，或其IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式，如下所述，其用于治疗I型过敏症。又一方面，本发明涉及药物组合物，其包括重组产生的Can f4过敏原，或其IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式。在上述方面，重组产生的Can f4过敏原可被其与野生型Can f4过敏原共享抗体表位的变体或片段所替代，如下所定义。在上述每一方面的一个实施方式中，重组产生的Can f4过敏原具有根据SEQ ID NO 2的氨基酸序列，且由根据SEQ ID NO 1的核酸序列编码。而且，本发明涉及具有根据SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重组产生的Can f4过敏原，其用于诊断以及用于治疗。本发明还涉及重组产生的Bos d 23k过敏原，其用于I型过敏症的体外诊断。本发明的另一方面涉及产生过敏原组合物的方法，包括将重组产生的Bos d 23k 过敏原加入至包括过敏原提取物和/或至少一种纯化的过敏原组分的组合物的步骤。另一方面，本发明涉及“掺入”重组产生的Bos d 23k过敏原的过敏原组合物。此类过敏原组合物可为不具有或具有少量Bos d 23k过敏原的过敏原提取物或纯化和/或重组过敏原组分的混合物，其中加入所述重组产生的Bos d 23k过敏原以结合来自患者的 IgE，所述患者的IgE不结合或很差地结合所述组合物中的其它过敏原组分。本发明的此方面也涉及产生此组合物的方法，所述方法包括将重组产生的Bos d 23k过敏原加入至过敏原组合物，如过敏原提取物(任选地掺入其它组分)或纯化的天然或重组过敏原组分的混合物的步骤。再一方面，本发明涉及用于诊断患者中I型过敏症的体外诊断方法，其中使来自所述患者的体液样品如血液或血清样品接触根据在前方面的重组产生的Bos d 23k过敏原或组合物，并检测所述患者的样品是否包含特异性结合重组产生的Bos d 23k过敏原的 IgE抗体，其中存在特异性结合所述Bos d 23k过敏原的此IgE抗体表明存在I型过敏症。 此诊断方法可以本领域熟知的任何方式进行。重组产生的Bos d 23k过敏原可例如固定在如常规实验室免疫测定、微阵列或侧向层析测定的固体支持物上。又一方面，本发明涉及用于进行根据在前方面的方法的诊断试剂盒，所述试剂盒包括重组产生的Bos d 23k过敏原。本发明进一步涉及治疗哺乳动物I型过敏症的方法，包括向需要此治疗的个体施用重组产生的Bos d 23k过敏原，或其IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式，如下所述。 在一个实施方式中，所述哺乳动物为牛。在另一个实施方式中，所述哺乳动物可为具有显示出与重组产生的Bos d 23k过敏原有同源性的哺乳动物过敏原的任一种哺乳动物，条件是所述个体显示出与所述哺乳动物过敏原如Can f4的IgE交叉反应性。本发明的此方面还涉及重组产生的Bos d 23k在包括如组分分解免疫治疗等此类免疫治疗中的应用。修饰的实例包括但不限于分子的断裂、截短或串联化；内部片段的缺失；氨基酸残基的取代；结构域重排；或通过破坏二硫键或其与另一个大分子结构结合，或通过去除蛋白结合低分子量化合物的能力而破坏至少部分三级结构。另一方面，本发明涉及重组产生的Bos d 23k过敏原，或其IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式，如下所述，其用于治疗I型过敏症。又一方面，本发明涉及药物组合物，其包括重组产生的Bos d 23k过敏原，或其 IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式的所述Bos d 23k过敏原。在上述方面，重组产生的Bos d 2 过敏原可被其与野生型Bos d 2 过敏原共享抗体表位的变体或片段所替代，如下所述。在涉及Bos d 2 的上述每一方面的一个实施方式中，重组产生的Bosd 2 过敏原具有根据SEQ ID NO 4的氨基酸序列，且由根据SEQ ID NO 3的核酸序列编码。图1显示IgE抗体与非还原的狗毛皮垢屑提取物蛋白结合的免疫印迹分析。显示出所分析的37份血清中的10份。对象编号在上方说明，血清的稀释度在每个泳道下方说明。MW标记蛋白的位置在左侧说明。图2显示通过4个连续步骤的免疫印迹鉴定的16kDa狗毛皮垢屑蛋白的纯化。A 制备型尺寸排阻色谱。合并的级分由垂直条表示。B:阴离子交换色谱。虚线表示电导率 (右侧y轴)。用于进一步纯化的合并的级分由水平括号标记。C:反相色谱。虚线表示乙腈浓度(右侧y轴)。用于进一步纯化的合并的级分由水平括号标记。D:阴离子交换色谱。 虚线表示电导率(右侧y轴)。包含纯靶蛋白的峰用箭头表示。图3显示从纯化的16kDa狗毛皮垢屑蛋白的胰蛋白酶解片段获得的肽序列。图4显示Can f4的cDNA序列(所附序列表中SEQ ID NO 1所示)和推断的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。预测的信号切割位点用箭头标记。图5显示纯化nCan f4和rCan f4的比较生化和免疫学分析。A 分析凝胶过滤。 虚线:nCan f4(右侧y轴)；实线rCan f4(左侧y轴)。6. 5、13. 7、29、43和75kDa校准蛋白的洗脱体积由菱形符号标记。BmCan f4和rCan f4的非还原(ox)和还原(red)样品的SDS-PAGE。相关MW标记蛋白的大小在左侧示出。C 通过ImmunoCAP对IgE抗体结合活性(kUA/L)的分析。分析来自37名狗过敏症对象的血清。虚线表示0. 10和0. 35kUA/L水平。图6表示在37名狗过敏症对象中，针对狗毛皮垢屑提取物(DDE)、rCan fl、rCan f2、nCan f3、rCan f5和rCan f4的IgE抗体的浓度。水平条表示中间值。点线表示0. 35kUA/ L水平。将低于0. lkUA/L的值设定为0. lkUA/L。图7显示rCan f4对IgE抗体结合Bos d 23k的抑制。在测量IgE结合固定化的 Bos d 2 前，用lOOyg/mL rCan f4(黑条)或缓冲液(阴性对照，灰条)预孵育三种Bos d 23k反应性血清(A-C)。图8显示从母牛毛皮垢屑中纯化两种IgE抗体结合蛋白，即Bos d 23k和Bos d2。 A 通过尺寸排阻色谱分馏。将来自标记为A和B的两个峰的顶部级分合并并进行还原SDS PAGE分析(插图)。相关MW标记蛋白的大小在右侧示出。B 通过疏水性相互作用和阴离子交换色谱进一步纯化后，纯化的Bos d 23k和Bos d 2的还原(red)和非还原(ox)样品的SDS-PAGE。相关MW标记蛋白的大小在每个凝胶的左侧示出。图9显示IgE抗体结合Can f4、Bos d 23k(上图)和Bos d 2(下图)的比较。 说明了每个比较的相关系数(r)。分析了来自37名狗过敏症对象的血清。虚线表示0.10 和 0. !35kUA/L 水平。图 10 显示 Can f4(如 SEQ ID NO 2 所示)和 Bos d 23k (如 SEQ ID NO 4 所示) 的氨基酸序列比对。定义Can f4应被解释为由免疫学会联合会过敏原命名委员会(誦.allergen, org)列出的狗过敏原。脂质运载蛋白应被解释存在于广泛生物体中且涉及众多功能的蛋白的大且多样化的组[25-27]。它们表征为某些保守的结构特征，但在氨基酸序列上不是高度保守。月旨质运载蛋白能够结合小的，主要是疏水性分子，包括类固醇、脂肪酸和信息素。存在于哺乳动物嗅觉器官中的脂质运载蛋白的一个亚组被称为气味结合蛋白(odorant binding proteins)，这源于它们可逆地结合和释放参与嗅觉信号传输的挥发性化合物的能力[28]。 一些哺乳动物脂质运载蛋白已被报导为引起致敏人中的呼吸性过敏症状的过敏原[29]。本发明人命名为Bos d 23k的蛋白作为从母牛毛皮垢屑中纯化的23kDa蛋白描述于实施例中，其包括与从牛(Bos Taurus)基因组序列推断出的假定牛基因产物(描述在登录号XP_581277中)一致的氨基酸序列。术语“Can f4”未另外定义，应被理解为全长的，未修饰的完整Can f4。相同的定义经必要修正后也适用于Bos d 23k。与Can f 4过敏原共享抗体表位的Can f 4过敏原的变体和片段应被理解为那些片段和变体，它们与来自代表性Can f4过敏原致敏患者的血清样品的IgE抗体的结合可显著地被Can f4过敏原所抑制。此类抑制测定可根据如WO 2008/079095的实施例8中所述的方案进行。变体和片段也具有与Can f4过敏原类似的IgE结合性质。相同的定义经必要修正后也适用于Bos d 23k。其IgE结合应答被消除或减弱的修饰形式的所述Can f4过敏原在本发明内容中应被理解为是指已经过化学或遗传学修饰以改变其免疫学性质的Can f4过敏原，如以上涉及本发明免疫治疗方面所例举。相同的定义经必要修正后也适用于Bos d 23k。同源过敏原应被理解为是指其中核酸序列能够与其它过敏原的核酸序列杂交的过敏原。杂交的结果可取决于序列的长度、同源性在序列内的分布以及实验条件，如盐浓度、温度、洗涤严格性等。根据本发明的同源过敏原可具有低于通常被认为是同源即 65-70%的整体序列相同性。通过本发明的定义，同源过敏原的核酸序列可显示出较低的与其他过敏原的核酸整体序列相同性，但因序列片段显示出较高序列相同性而仍与此其它过敏原杂交。与过敏原的交叉反应性应被理解为是指个体针对第一过敏原的IgE抗体对于与此第一过敏原同源或不同源的第二过敏原也是反应性的。发明详述以下实施例通过来自狗的脂质运载蛋白样蛋白Can f4的分离和应用来说明本发明。也有说明Can f4和母牛过敏原之间交叉反应性的部分。实施例仅用于说明，且不应被认为是限制本发明，本发明通过所述权利要求的范围来限定。
实施例材料和方法IgE免疫印迹分析对通过使用均勻的12. 5% ExcelGel(GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden)的SDS-PAGE分离的非还原的狗毛皮垢屑提取物进行免疫印迹分析，并印迹在 Hybond ECL 硝酸纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences)上。使用 LMW 试剂盒(GE Healthcare Life Sciences)作为分子量(MW)标记。将蛋白印迹物用封闭缓冲液(50mM 磷酸盐 PH 7. 4,0. 1% (ν/ν)吐温-20、0·9% (w/v)NaCl,0. 3% (w/v)Dextran T10)在室温下封闭1小时，并随后用在封闭缓冲液中稀释1. 5-30倍的每个患者的血清孵育过夜。在含 0.5% (ν/ν)吐温-20的封闭缓冲液中清洗后，将膜用含125I-标记的抗人IgE抗体的封闭缓冲液在室温下孵育4小时，清洗后，结合的IgE使用储存磷光质屏和Typhoon 9410多功能成像仪(GE Healthcare Life Sciences)通过放射摄影术检测。从狗毛皮垢屑纯化16kDa蛋白狗毛皮垢屑(Allergon，Valinge，Sweden)在2OmM MOPS pH 7. 6,0. 5M NaCl(MBS) 中提取，通过离心净化，通过0. 45 μ m混合纤维素酯过滤器(Millipore，Billerica, ΜΑ)过滤并加入到尺寸排阻色谱(SEC)用的Superdex 75柱(GE Healthcare Life Sciences)。 将在免疫印迹分析中观察到的含16kDa带的级分使用YM-3过滤器在Amicon Stirred Cell(Millipore)中浓缩，在 kphadex G25 超细柱(GE Healthcare Life Sciences)上脱盐至20mM Tris-HCl pH 8.0。随后将脱盐的制备物加入到阴离子交换色谱(AIEC)用的 Source Q 柱(GE Healthcare Life Sciences)并用 0-0. 5M 线性梯度 NaCl 洗脱。进一步的纯化通过使用Source 15 RPC柱(GE Healthcare Life Sciences)和用在含0. 05%三氟乙酸(TFA)的水中的0巧4%线性梯度乙腈洗脱的反向色谱(RPC)进行。包含靶蛋白的级分通过SDS PAGE鉴定并合并。在还原、烷基化和胰蛋白酶裂解后，纯化蛋白的肽通过RPC分离并通过氨基酸测序分析。为了通过ImmimoCAP评价IgE抗体结合，通过使用阳离子交换色谱(CIEC)对16kDa蛋白进行最终的处理步骤，所述阳离子交换色谱使用在20mM柠檬酸盐 pH 4.0 中平衡的 SP Sepharose FF 柱(GE Healthcare Life Sciences)且用 0-1M 线性梯度NaCl洗脱。从母牛毛皮垢屑纯化IgE结合蛋白提取母牛毛皮垢屑(Allerg0n)并通过上述的SEC分馏。将含显著的23kDa带的级分合并、用NH4SO4调节至IM的终浓度，并通过使用苯基kpharose HP柱(GE Healthcare Life Sciences)的疏水相互作用色谱(HIC)来进一步纯化。将23kDa带在通过级分的流中洗脱，并在kphadex G25超细柱(GE Healthcare Life Sciences)上脱盐至20mM Bis-Tris丙烷pH 8. 5，并随后加入到用相同缓冲液平衡的Source 15Q柱(GE Healthcare Life Sciences)。洗脱使用0_0. 4M线性梯度NaCl进行，并合并含23kDa带的级分。最终制备物的蛋白浓度使用计算出的每mg/mL为1. 04的消光系数，在^Onm吸光度下确定。将含显著的19kDa带的级分合并并通过上述HIC进一步纯化。将19kDa蛋白在 20mM Tris-HCl pH 8. 0中的O-IM线性梯度NH4SO4中洗脱，并收集峰级分。如上所述，进行脱盐和在Source 15Q柱上的AIEC。最终产生物的蛋白浓度使用计算出的每mg/mL为1. 04 的消光系数，在^Onm吸光度下确定。蛋白分析除非另有说明，还原β-巯基乙醇)和非还原蛋白样品的SDS-PAGE分析使用 10% NuPAGE 凝胶 anvitrogen，Carlsbad, CA)和作为 MW 标记的 Markl2 (Invitrogen) 进行。在电泳分离后，蛋白通过考马斯亮蓝染色来显像。提取的蛋白带的N端序列分析使用 Hewlett-Packard G1000A 仪器(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)进行。分析 SEC 在用 MBS 平衡的 Superdex 75HR 10/30 柱(GE Healthcare Life Sciences)上进行。柱的 MW 平衡使用LMW凝胶过滤平衡试剂盒(GE Healthcare Life Sciences)进行。对于通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-T0F)质谱(MS)的肽质量指纹图谱(PMF)分析，包括还原、烷基化和胰蛋白酶消化的溶液中RPC纯化蛋白的样品产生使用 Bruker Daltonics Autoflex 2 仪器(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)基本上按照 [10]所述进行。进行串联MS(MS/MS)分析以鉴定选择的肽。为了确定与所得PMF和MS/MS 结果匹配的蛋白，使用Mascot服务器(Matrixscience，London, UK)搜索MSDB数据库。来自SDS-PAGE的单独蛋白带的凝胶内胰蛋白酶消化基本上根据Sievchenko et al. [11]进行。样品制备和肽质量指纹图谱进行如上。
重组Can f4的克隆、表达和纯化使用RNAqueous试剂盒(Ambion，Austin, Texas)，从狗舌头的外侧段来产生总 RNA。使用mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Life Sciences)从总RAN中分离聚腺苷酸化 RNA，且使用第一链cDNA合成试剂盒(GE Healthcare Life Sciences)制备第一链cDNA。 根据Fr0hman[12]，使用均带有克隆用的末端NdeI限制性位点的嵌套正向寡核苷酸引物 5，-ATGAAGATCCTACTGTTGTGTC-3，和 5，-CAGCTACCCCTTCCTAATG-3，进行 3，RACE。将 7 个独立的3’ RACE克隆分离并对它们全部测序，由此可确定Can f4编码序列。DNA测序使用 Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,Foster City,CA)进行。DNA和氨基酸序列的分析以及计算使用GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA, USA)的程序进行。信号肽预测使用 SignalP(www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)进行。出于蛋白表达的目的，Can f4编码序列使用引物5’ -GTCAGCATATGCAGCTACCCCTTCCT AATG-3，和 5，-ACTGACTCGAGTTCATGGTTGGGACAGTTGTC-3，扩增，并克隆于载体 pET_23a(+) (Novagen, Madison, WI, USA)的 NdeI 和 XhoI 位点之间。使用 3-L 生物反应器(Belach Bioteknik, Solna, Sweden)，在大肠杆菌(E. coli)BL21制备作为C末端6个组氨酸标记蛋白的重组Can f4。对于rCan f4纯化，将收集的细胞重悬在20mM Tris-HCl pH 8. O中，并使悬液在 15000-17000kPa 下通过 Emulsiflex C5 勻浆器(Avestin he.，Canada)来裂解。在通过离心和过滤净化后，将上清液加入到用NiSO4装载的Chelating Sepharose FF柱(GEHealthcare Life Sciences)。柱清洗通过在 20mM Tris-HCl pH 8· 0 中的 20mM 咪唑，0· 15M NaCl进行，且重组蛋白在相同缓冲液中的20-500mM线性梯度咪唑中洗脱。重组蛋白的进一步纯化通过使用 Q Sepharose FF 柱(GE Healthcare Life Sciences)在 2OmM Tris-HCl pH 8. O中通过AIEC进行。蛋白使用0-0. 5M线性梯度NaCl洗脱，且根据SDS-PAGE结果合并级分。最终制备物的蛋白浓度使用计算出的每mg/mL为0. 78的消光系数，在^Onm吸光度下确定。重组蛋白的完整性使用N末端测序确认。狗过敏症对象和花粉过敏症对照将来自西班牙(n = 23)、瑞典(n = 10)和北美(n = 4)的37名狗过敏症对象的血清用于本研究中(表2)。全部患者具有医生诊断的狗过敏症，其症状例如哮喘、鼻结膜炎和风疹，且经过阳性皮肤点刺测试和针对狗毛皮垢屑提取物的特异IgE的阳性ImmimoCAP 测试(Phadia，Uppsala, Sweden) 0将未诊断或未报导有狗过敏症症状的44名花粉过敏症对象的血清用于对照。在每个中心的当地伦理委员会许可下收集全部样品和临床数据。特异性IgE抗体测量使用常规和实验的ImmimoCAP 测试(Phadia)检验纯化的重组和天然过敏原的 IgE抗体结合活性。实验的ImmimoCAP 测试如[13]所述进行。实验测试的测定特异性使用阴性对照血清评价，此阴性对照血清掺入终浓度为0、1000或3000kU/L的骨髓瘤IgE。在测定IgE抗体与固定在ImmimoCAP固相上的23kDa母牛毛皮垢屑蛋白结合前，IgE抑制实验通过使用终浓度100 μ g/mL的重组Can f4预孵育血清样品来进行。以两次确定的平均值来计算结果。结果来自狗过敏症对象的血清的免疫印迹分析对来自10名狗过敏症对象的血清样品使用非还原狗毛皮垢屑提取物进行IgE免疫印迹分析(图1)。对于相同的血清，特异性IgE对rCan fl、rCan f2、nCan f3和rCan f5的ImmimoCAP数据可用于比较。免疫印迹分析揭示IgE结合至少8种不同的蛋白带。在这些带中，23kDa区域中的带与结合rCan fl和rCan f2的ImmunoCAP IgE有关(对象5、 24,31和33), 28kDa区域中的带与rCan f5反应性有关(对象1、3、5、15、31、33和36)，且约60kDa的带与nCan f3反应性有关(对象9、15和33)。结合16kDa带的免疫印迹IgE通过4名对象(1、9、14和36)的血清检测，其中一名对象(对象14)的血清引起特别强的信号。在ImmimoCAP分析中此血清未显示出IgE与 rCan f UrCan f2、nCan f3或rCan f5中任一种结合的事实提示16kDa带代表新过敏原。由免疫印迹鉴定的16kDa狗毛皮垢屑蛋白的纯化包括SEC以及随后AIEC和RPC的三步纯化方法产生90_95%纯度的16kDa蛋白的制备物(图幻。此蛋白的N末端序列分析未读出，提示其N末端已被封闭。为了克服此问题，将蛋白还原、烷基化和用胰蛋白酶消化以产生内部肽。4种此类胰蛋白酶解肽可通过 RPC分离并通过N末端测序分析，产生的序列显示在图3中。使用这些肽序列进行的BLAST 搜索未确定出与任何已知的狗蛋白的正确匹配。然而，肽1至4与代表来自母牛和猪的气味结合蛋白的数据库条目的不完全匹配，这提示纯化的狗蛋白可能与此蛋白家族有关。而且，使用降低的严格性设置，用肽4在狗基因组数据库进行TBLASTN搜索，得到与在X染色体末端区域中三个相连区段的概念翻译的匹配。纯化蛋白的PMF分析未得到与已知蛋白序列的任何显著匹配。16kDa狗毛皮垢屑蛋白的IgE结合活性通过ImmunoCAP免疫测定来评价，随后进行最终的CIEC处理步骤以进一步增加制备物的纯度。分析37名狗过敏症个体的血清，且在 ImmunoCAP中IgE与纯化蛋白的结合很好地与在狗毛皮垢屑提取物免疫印迹分析中检测出的16kDa带相关联，说明纯化蛋白代表在免疫印迹中观察到的16kDa带。来自狗和母牛的上皮过敏原之间的联系我们实验室中在来自其它动物种类的上皮过敏原上进行的分开的实验意想不到地帮助了 16kDa狗过敏原的鉴定和克隆。在狗和母牛过敏原研究之间共享的一种血清显示出IgE抗体与狗和母牛毛皮垢屑提取物均显著结合，而在ImmunoCAP中对全部rCan Π、 rCan f2,nCan f3和rCan f5均无反应性，这引出此血清可能定义新型狗过敏原的可能性。发现母牛毛皮垢屑提取物中的23kDa蛋白结合来自此血清的IgE且能够通过SEC 高度富集(图8A)。发现SEC分馏中的相邻峰包含主要过敏原Bos d2，其是一种19kDa的脂质运载蛋白，经PMF分析确认(未显示)。通过HIC和AIEC对这些蛋白的进一步纯化(未显示)导致适合作为免疫测定试剂的更高纯度的制备物(图8B)。23kDa蛋白通过PMF数据与数据库条目XP_581277(如SEQ ID NO :4所示)的显著匹配(ρ <0.05)来鉴定，代表被注解为“类似于气味结合蛋白”的牛脂质运载蛋白。而且，23kDa蛋白的N末端序列分析揭示出序列EAQGDASQFT，其匹配相同数据库条目的残基 19-28，因此证实了 PMF匹配。下文将此蛋白称为Bos d 23k。通过Bos d 23k和Bos d 2进行的实验ImmunoCAP测试被用于评估IgE结合16kDa 狗毛皮垢屑蛋白的相关性。分析来自37名狗过敏症对象中的血清，且结果显示在图9中。 尽管16kDa狗毛皮垢屑蛋白和Bos d 2在IgE结合上未显示出相关性(r = 0.01)，但观察到与Bos d 23k的显著相关性(r = 0. 89)，这提示在狗过敏原和Bos d 23k之间存在交叉反应性和结构相似性。16kDa狗毛皮垢屑蛋白的克隆和序列分析16kDa狗毛皮垢屑蛋白和Bos d 23k之间的潜在序列相似性有助于针对鉴定狗蛋白或其基因序列的数据库搜索。用牛蛋白序列(XP_581277)在狗基因组数据库进行 BLASTN搜索，得到登录号AAEX02025758(狗基因组序列4314Mbp区段)的核苷酸位置 338441-338307的翻译的匹配[14]。有趣地是，此基因组区域的理论翻译包含Can f4的所报导N末端序列的氨基酸残基9-13的最佳的5残基匹配。发现在更上游(339006-338926)， 编码氨基酸的核苷酸序列匹配Can f4的残基1-8以及推定的信号肽。出于克隆对应于AAEX02025758鉴定区段的cDNA (假定编码Can f4)的目的，进行 3’ RACE实验。使用寡核苷酸引物以及从狗舌头的多聚A RNA制备的第一链cDNA作为模板，此寡核苷酸引物基于编码推定信号肽的第一部分的基因组序列和在预测断裂位点后的延伸。获得清楚的扩增产物，将此产物克隆、分析并随后用于蛋白表达实验。所克隆cDNA的完整DNA序列和氨基酸翻译显示在图4中。确定出编码174个氨基酸残基的开放阅读框，其中SignalP预测开始的16个残基将形成信号肽。从所克隆cDNA 推导出的成熟蛋白由158个氨基酸残基组成，包括两个半胱氨酸，且具有17. 6kDa的预测分子量和6. 53的等电点。为了评估序列多样性的存在，将7个独立的3’ RACE克隆分离并测序。在这些克隆中发现很少的核苷酸取代(未显示)，但没有一个取代引起蛋白的氨基酸序列改变。在所分析的全部克隆中，在终止开放读框的终止密码子之后且在多聚A尾之前是 213个核苷酸的未翻译区段。在残基16和17之间的预测的信号肽断裂位点将使得17位的谷氨酰胺残基成为成熟蛋白中的第一个。N末端谷氨酰胺残基可经历焦谷氨酸环化，其已知会通过Edman降解来阻断N末端测序(15)，这与我们无法获得从完整蛋白读出的序列相符。而且，基于对天然蛋白PMF结果的复查，鉴定出1759. 98Da分子量的胰蛋白酶解片段，其准确地对应于对所预测一级翻译产物的残基17-32的预测，此一级翻译产物经焦谷氨酸环化修饰。此外，鉴定出匹配氨基酸残基33-51、56-63、66-73和95-104的胰蛋白酶解片段。由所克隆cDNA编码的氨基酸序列进一步包含从纯化的天然16kDa蛋白获得的四个胰蛋白酶解肽序列(图幻，其与肽2-4和肽1中的两个保守的氨基酸取代很一致。总之， 通过PMF鉴定的蛋白片段和肽测序代表Can f4的推断氨基酸序列的58%的覆盖率(表1)。 结合在一起，这些结果提供了很强的证据，即纯化的16kDa过敏原和由所克隆cDNA编码的蛋白均代表狗过敏原Can f4。通过将所克隆的cDNA序列与登录号AAEX02025758的基因组序列比对，发现 Can f4基因的编码部分跨越总共5916bp，且包含6个外显子339006-338929 (外显子 1) ,338447-338307 (外显子 2) ,335150-335082 (外显子 3) ,334581-334468 (外显子 4)、 333609-333511 (外显子5)和333114-333091 (外显子6)。外显子3和4之间的确切剪切位点无法明确地从序列中推断出，且这些外显子的边界可分别更换为335150-335079和 334578-334468 ο氨基酸序列从Can f4 cDNA推断出，且基因区段在5个位置彼此背离。在成熟Can f4序列位置20处，cDNA翻译中异亮氨酸残基对应于基因衍生序列的缬氨酸残基，在位置 30处天冬氨酸残基对应于谷氨酸残基，在位置38处蛋氨酸残基对应于亮氨酸残基，在位置 51处丝氨酸残基对应于亮氨酸残基，且在位置81处酪氨酸残基对应于天冬氨酸或半胱氨酸残基，这取决于外显子3和4之间的确切剪切位点。除了上述Can f4基因序列外，发现数据库条目AAEX02025758包含两个其它的Can f4相关区段，这解释了用胰蛋白酶解肽4序列在狗基因组中进行TBLASTN搜索获得的三个匹配。三个Can f4相关区段彼此以5.4和6. 71Λ的距离串联排列，其中上述的一个位于最远的下游。位于中间的Can f4相关区段具有与上述Can f4基因类似的外显子/内含子结构，且其推断的氨基酸序列与Can f4基因相比在M个位置不同，与Can f4 cDNA相比在观个位置不同。有趣地，其与胰蛋白酶解肽1的序列完全一致，此胰蛋白酶解肽1的序列在2 个位置与cDNA编码的氨基酸序列背离。在位于最远上游的Can f4相关区段中，未能鉴定出对应于外显子4的序列。Can f4属于脂质运载蛋白超家族，且显示出与牛(XP_581277)和猪[16] (NP_998961)的气味结合蛋白38-39%的序列相同性。Can f4和Bos d 23k的氨基酸序列比对如图10所示。注意到，除了类似或相同残基的分散模式，蛋白的C末端部分以及两个半胱氨酸残基(Can f4中的位置62和154)高度保守。作为脂质运载蛋白特征的其它保守元件[17]包括临近N末端的GxW基序(位置13-15)、甘氨酸残基(位置118)。脂质运载蛋白的另一典型基序[17]kxxYxG存在于Bos d 23k(位置74-80)中，但在Can f4中仅部分保守。有趣地，尽管属于相同的蛋白家族，但Can f4仅显示出与Can f 1和Can f2分别为和的氨基酸序列相同性。重组Canf4的产生不包括信号肽的重组Can f4在大肠杆菌中作为C末端6个组氨酸标记蛋白表达。 重组蛋白通过IMAC和AIEC从可溶性细胞级分中纯化。为了评估重组蛋白的聚集状态，对制备物的样品以及同时对天然的纯化天然Can f4进行分析SEC。如图5A所示，在两种情况中， 色谱图以单一对称峰为主，对应于约16. 5kDa的MW，由所用校准器所定义。在SDS-PAGE (图 5B)中，天然和重组的Can f4均显示出基于还原的迁移率的移位，这提示存在于蛋白中的两个半胱氨酸残基均参与到二硫键中。应注意到，由最初免疫印迹分析表明的Can f4的表观分子量(图1)受到以下事实的影响，即将用于分析的狗毛皮垢屑提取物以非还原形式加入到分离凝胶中，导致涉及对蛋白大小的低估，所述蛋白大小由纯化蛋白还原样品的随后分析所表明。与天然蛋白相比由Can f4显示的大小增加与在重组蛋白中加入C末端6个组氨酸标记和几乎完全保留起始的甲硫氨酸残基相一致。特异性IgE抗体与狗过敏症对象中rCan f4结合的分析对比从狗毛皮垢屑纯化的天然蛋白来评价重组Can f4的免疫活性。将每种蛋白固定在ImmimoCAP 固相上，且使用来自37名狗过敏症对象的血清样品检验它们的IgE抗体结合(图5C)。两个数据组显示出非常强的相关性(r = 0. 99)，这表明对于IgE抗体结合决定簇，重组过敏原十分类似于其天然对应体。图6说明了与其它狗毛皮垢屑过敏原相比，IgE抗体对Can f4反应性的频率和数量级。狗过敏症对象和它们的致敏模式上更全面的数据组显示在表2中。在所分析的37 个血清中，13个(35% )显示出IgE抗体结合Can f4。13个Can f4反应性血清中的一个显示IgE不结合所测试的其它狗过敏原。可在Can f4和Can Π或Can f2之间观察到在 IgE结合中无相关性，这与它们高度分歧的一级结构相一致。实验Can f4 ImmimoCAP测试的分析特异性通过基于测试用至多3000kU/L骨髓瘤IgE突起化的阴性对照血清获得的低结果来表明(表3)。为了检查Can f4特异性IgE抗体在对狗不过敏的遗传性过敏症个体中的存在，测试未诊断或未报导有狗过敏症症状的44名花粉过敏症对象的血清，以及可获得的全部狗过敏原组分和一系列花粉提取物(表4)。那些血清中的7个(16%)显示出对狗毛皮垢屑提取物为阳性应答，有一个在2kUA/L或更低的水平的例外，其中之一也显示IgE抗体结合 rCan f4。对狗毛皮垢屑为阴性的血清未显示出对rCan f4为阳性应答。rCan f4和Bos d 23k之间的交叉反应性为了研究在IgE抗体结合中由它们相关性所表明的Can f4和Bos d 23k之间交叉反应性的程度，通过三种牛蛋白反应性血清进行IgE抑制实验。纯化的牛蛋白附着于 ImmunoCAP固相，且测量来自用rCan f4或缓冲液预孵育的血清的IgE结合。从图7中可见，在全部三个血清中rCan f4几乎完全(彡96% )抑制IgE结合母牛毛皮垢屑蛋白，这表明由实验中所用血清识别的结合牛蛋白的IgE的全部决定簇被rCan f4共享。讨论如本申请所述，我们已经分离、克隆并表征了来自狗毛皮垢屑的IgE结合蛋白，将其称为Can f4。在本工作之前，仅知道此过敏原的13个残基的N末端序列。发现Can f4 属于不同的脂质运载蛋白，且显示出与包括母牛和猪的其它物种的气味结合蛋白具有相似性。发现Can f4与从母牛毛皮垢屑纯化的23kDa气味结合蛋白交叉反应。天然Can f4的纯化导致很差的产率，这源于蛋白在毛皮垢屑提取物中的缺乏和低色谱分辨率。Can f4在RPC中若干峰中的存在和宽Can f4峰在CIEC步骤中的存在表明蛋白的一些异质性程度。虽然对此特性存在一些解释，包括蛋白修饰、部分降解和存在同种型，但N连接的糖基化是不可能的，因为Can f4序列不包含用于N-聚糖结合的潜在位点。 在所得的四种胰蛋白酶解肽序列中，与从cDNA克隆和所鉴定的基因组区段推断出的氨基酸序列相比，一种肽序列显示出在2个位置处的背离。因此，即使在7个独立的cDNA克隆的 DNA测序中未获得序列可变性的证据，但仍可能在天然蛋白纯化期间同种型变化已导致所观察到的异质性。此外，胰蛋白酶解片段测序和MALDI-T0F分析共同确认从cDNA克隆推断出的58%的氨基酸序列，这提示出有限的多态性。即使不能排除所鉴定的其它Can f4相关基因组区段中的至少一种被表达且可引起Can f4的变体形式，我们对此仅指出背离cDNA 编码序列的胰蛋白酶解片段1的两个氨基酸残基的匹配。没有优先与其它Can f4相关区段和全部cDNA克隆匹配的其它肽序列明确地源于Can f4基因，对于此Can f4基因，本申请中详述了核苷酸位置。无论可能的同种型变化，所产生的Can f4的重组形式在生物化学和免疫学上显示出与纯化的天然蛋白高度一致。在分析SEC中以确切的相同体积洗脱的两种蛋白和它们的 IgE抗体结合显示出很高的相关性。最重要地，未观察到IgE结合天然过敏原以及重组过敏原的例子。事实上，对具有重组蛋白的实验测试观察到略高的IgE结合，但这很可能是因为由差的纯化产率导致的低于天然蛋白的最佳偶联浓度。作为狗毛皮垢屑过敏原的Can f4的重要性通过对来自37名狗过敏症对象的血清进行ImmimoCAP测试来评价。在包括相同种群的最近研究中，我们报导了 49%显示出IgE 抗体结合Can fl，22%显示出IgE抗体结合Can f2，16%显示出IgE抗体结合Can f3且 70%显示出IgE抗体结合Can f5。在此工作中，我们发现37名对象中的13名(35% )对 Can f4致敏。因此，Can f4得到比rCan f2禾口 nCan f3更普遍的认识，rCan f2禾口 nCan f3 在本研究种群中表现为次要过敏原。在13个Can f4反应性血清中，一个显示IgE不结合所测试的其它狗过敏原，这提示Can f4可作为狗过敏症中的独立致敏物质以及组分分解诊断的重要补充而相关联。此观念得到Can f4相比于Can f 1和Can f2在序列和IgE结合中均具有独特性的支持。没有狗过敏症的44例花粉过敏症对照中仅一例显示出对Can f4 弱的IgE抗体应答，此事实提示此过敏原的IgE识别并不由于其它气源性过敏原致敏的原因经常发生。相对于狗毛皮垢屑提取物，母牛毛皮垢屑提取物似乎包含更高含量的过敏原，因此给出了更令人满意的纯化结果。从母牛毛皮垢屑提取物的SDS-PAGE分析判断，10-40kDa 范围内的主要抗原为Bos d 2和本文所报导的23kDa蛋白(Bos d 23k)，二者似乎以相似的量存在。Bos d 2已被很好地确立为母牛毛皮垢屑中的主要过敏原，作为重组过敏原产生并在结构上表征[18-22]。相反，有关Bos d 23k所知甚少，虽然其与之前报导的通过母牛毛皮垢屑提取物免疫印迹分析所揭示的IgE结合的、22kDa蛋白带相同[21-23]。Bos d 23k的巧4个残基的氨基酸序列预测出17. 8kDa的分子量，这几乎完全与 Can f4的分子量相同。尽管有此事实，其在SDS-PAGE中显示出比Can f4显著低的迁移率。 由于两种蛋白在序列上相关且可被假定具有类似的折叠，糖基化的差异或许将是所观察到的电泳不一致的可能解释。确实，序列的检查揭示Bos d 23k在成熟蛋白的天冬酰胺残基 45位处包含潜在的N糖基化位点，而其不存在于Can f4的序列中。在已知的狗和母牛毛皮垢屑过敏原中，血清白蛋白(分别为Can f3和Bos d 6) 代表唯一被很好认可的对其它物种过敏原的交叉反应性。因此，Can f4和Bos d 23k之间的交叉反应性提供了狗和母牛毛皮垢屑过敏原之间的新型免疫学联系。考虑到它们相对低水平的整体序列相同性(37%)，二种蛋白之间广泛的交叉反应性似乎有些使人惊奇。然而，有可能所观察的交叉反应性是因为蛋白的部分具有比整体评分更高的序列相似性。特别地，两种蛋白的C末端部分显著保守，其中在位置136/133和155/152之间20个残基的区段显示出75%的相同性。尽管两种蛋白之间有可论证的交叉反应性，但对于所测试的全部血清，IgE对Can f4的应答比对Bos d 23k的应答更高，这暗示在我们研究的种群中Can f4是主要的致敏物质，而非Bos d23k。总之，本申请报导了狗过敏原Can f4的克隆和表征。重组Can f4对狗过敏症的组分分解诊断很重要，且其与大量牛毛皮垢屑蛋白的交叉反应性在过敏症与狗和母牛毛皮垢屑之间建立起可能的联系。表1Can f4蛋白片段鉴定


本发明涉及过敏症的领域。更具体地，本发明涉及从哺乳动物中鉴定新型过敏原以及针对哺乳动物过敏症的诊断和治疗。具体地，本发明涉及重组产生的Can f4过敏原以及其在用于体外诊断和治疗过敏症的诊断组合物和方法中的应用。本发明进一步涉及重组产生的Bos d 23k过敏原以及其在用于体外诊断和治疗过敏症的诊断组合物和方法中的应用。