一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法【技术领域】，具体为一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法。[0002]过敏性疾病是二十一世纪人类四大非感染性重大疾病之一，发病率目前约占世界人口的22%，且逐年增加。我国面临过敏性疾病防治的严峻形势，研究解决过敏性疾病预防、诊断和治疗技术问题，能满足国民健康保障与国家经济发展的重大需求。近年来特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病治疗中的作用得到了肯定，是该疾病唯一的对因治疗方法。[0003]建立过敏原国家参考品和标准检定方法是实现中国全境过敏原标准化的必经之路。目前，已经有5种国际标准品(矮豚草、梯牧草、屋尘螨、桦树、家犬，NIBSC保存)和I种国际参考试剂(百慕大草，ATCC保存)制定出来。FDA采用了建立过敏原制剂国家参考品、检定方法、批放行标准的策略。自1990s后FDA开始着手建立自己的过敏原参考品、标准检定方法以及批放行标准。相继建立了一系列体外方法对过敏原成分、效价、含量进行鉴定，先后批准了 19种标准化过敏原，并对全美过敏原生产商实行了统一、有效管理。欧盟发展了围绕重组过敏原作为参考品、以夹心ELISA方法作为检定方法的过敏原标准化策略。经过一系列候选标准的筛选，Bet vl, Phl pi, Phl p5, Ole el, Der pi, Der p2, Der f I, Derf2等8种主要过敏原的天然纯化品和重组品都己得到了系统的研究，并建立了一套完善的结构、生物活性、定量方法等评价体系，以发展重组过敏原为候选参考品，确保重组过敏原与天然纯化过敏原具有可比性以及临床上的安全性、有效性、可控性。但是，我国尚无标准化过敏原参考品。[0004]过敏原标准化是一项世界性难题，我国在此领域与欧美国家差距逐渐拉大。例如，美国为有效管理过敏原制剂，专门成立了 FDA / CBER / LIB实验室，旨在建立过敏原参考品、过敏患者参考血清池、标准的生物效价检定方法、设定有效合理的质量放行标准。1981年，美国市场上有超过5000种非标准化过敏原产品出售，其中绝大部分均没有安全性和有效性验证。而现今，FDA经过多年过敏原标准化体系规范,正式批准的标准化过敏原仅19种。德国生物制品研究所一 PEI研究所(Paul Ehrlich Institute, PEI)执行了同样的策略，强制在德国推行标准化过敏原，加强监管，关闭了数十家过敏原生产企业。欧盟通过连续三届框架科技计划资助，建立了桦树主要致敏蛋白重组参考品rBet vl以及标准的ELISA检定方法，准备写入欧洲药典。
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法，以解决上述中的问题。[0006]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法，包括如下步骤:[0007](I)蟑螂的标准化饲养:由3对纯种美洲大蠊、3对纯种德国小蠊分别在标准化条件下繁殖出公斤级蟑螂，从而保证原料的标准化，灭菌消毒后，在培养72小时条件下无细菌生长；
[0008](2)蟑螂提取物含有5?10种主要致敏蛋白，I?5种次要过敏蛋白；
[0009](3)检测蟑螂提取物总蛋白量:蟑螂提取物在2mg / mL的浓度下使用考马斯亮蓝法检测，使批间差异为0-40% ；
[0010](4)使用Western blot法检测蟑螂提取物主要过敏原蛋白间比例，使批间差异为0-40% ；
[0011](5)使用ELISA法，肥大细胞激发试验检测总生物效价，使批间差异为0_40% ；
[0012](6)检测溶解性，5mg / nL蛋白无沉淀出现；
[0013](7)加入的重组主要过敏原与提取物之间无沉淀反应；
[0014](8)在培养72小时条件下无细菌生长；
[0015](9)蟑螂提取物剂量在5mg / mL条件下，一周内无细胞毒性反应。
[0016]所述蟑螂提取物制作方法为蟑螂在_80°C冰箱中灭活；在手术显微镜下去除肠道；用75%乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于_80°C冰箱保存备用；取适量的冰冻蟑螂在液氮中研磨成粉末；丙酮脱脂2次后，置于_80°C冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末；称取蟑螂粉末lg，加入20L的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4°C摇床上抽提0.5小时至4小时，之后在转速为12000g，4°C条件下离心30min，吸取上清，即为蟑螂提取物。
[0017]所述提取液为高渗磷酸盐缓冲液，其配方为:NaC135.1g?70.2gKC10.2gNa2HP04l.42g KH2PO40.27g,加入 800ml ddH20，调节 pH 为 5.0 ?9.0，定容至 1L。
[0018]所述蟑螂为美洲大蠊或德国小蠊。
[0019]所述主要致敏蛋白为:美洲大蠊的Per al> Per a2> Per a3> Per a4> Per a6> Pera7、Per a9、Per alO 或德国小爐的 Bla gl.02、Bla g2、Bla g4、Bla g5、Bla g6.01、Blag7、Bla gGSTDl、Bla g9、Bla glO ;次要过敏蛋白包括美洲大蠊的Per a5，德国小蠊的Blag3、Bla g8。
[0020]与己公开技术相比，本发明存在以下优点:以本发明质量方法获取的第二代蟑螂过敏原制剂能最大程度的获得蟑螂主要过敏原蛋白，生物效价稳定，提取物可重复性好，误差小于30%。



[0021]图1为本发明中不同NaCl浓度提取液抽提德国小蠊I小时各过敏原成分WesternBlot鉴定结果。

[0022]为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]实施例1
[0024]一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法，包括如下步骤:
[0025](I)蟑螂的标准化饲养:由3对纯种美洲大蠊、3对纯种德国小蠊分别在标准化条件下繁殖出公斤级蟑螂，从而保证原料的标准化，灭菌消毒后，在培养72小时条件下无细菌生长；
[0026](2)蟑螂提取物含有主要致敏蛋白 Per al、Per a2> Per a3> Per a4、Per a6> Pera7> Per a9> Per alO,次要过敏蛋白 Per a5 ；
[0027](3)检测蟑螂提取物总蛋白量:蟑螂提取物在2mg / mL的浓度下使用考马斯亮蓝法检测，使批间差异为20% ；
[0028](4)使用Western blot法检测蟑螂提取物主要过敏原蛋白间比例，使批间差异为25% ；
[0029](5)使用ELISA法，肥大细胞激发试验检测总生物效价，使批间差异为20% ；
[0030](6)检测溶解性，5mg / mL蛋白无沉淀出现；
[0031](7)加入的重组主要过敏原与提取物之间无沉淀反应；
[0032](8)在培养72小时条件下无细菌生长；
[0033](9)蟑螂提取物剂量在5mg / mL条件下，一周内无细胞毒性反应。
[0034]本实施例中蟑螂为美洲大蠊。
[0035]实施例2
[0036]一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法，包括如下步骤:
[0037](I)蟑螂的标准化饲养:由3对纯种美洲大蠊、3对纯种德国小蠊分别在标准化条件下繁殖出公斤级蟑螂，从而保证原料的标准化，灭菌消毒后，在培养72小时条件下无细菌生长；
[0038](2)蟑螂提取物含有主要致敏蛋白Bla gl.02、Bla g2、Bla g4、Bla g5、Blag6.01、Bla g7、Bla gGSTDl、Bla g9、Bla glO，次要过敏蛋白 Blag3、Bla g8 ；
[0039](3)检测蟑螂提取物总蛋白量:蟑螂提取物在2mg / mL的浓度下使用考马斯亮蓝法检测，使批间差异为25% ；
[0040](4)使用Western blot法检测蟑螂提取物主要过敏原蛋白间比例，使批间差异为15% ；
[0041](5)使用ELISA法，肥大细胞激发试验检测总生物效价，使批间差异为10% ；
[0042](6)检测溶解性，5mg / mL蛋白无沉淀出现；
[0043](7)加入的重组主要过敏原与提取物之间无沉淀反应；
[0044](8)在培养72小时条件下无细菌生长；
[0045](9)蟑螂提取物剂量在5mg / mL条件下，一周内无细胞毒性反应。
[0046]本实施例中蟑螂为德国小蠊。
[0047]实施例3
[0048]一种蟑螂过敏原制剂的质量控制方法，包括如下步骤:
[0049](I)蟑螂的标准化饲养:由3对纯种美洲大蠊、3对纯种德国小蠊分别在标准化条件下繁殖出公斤级蟑螂，从而保证原料的标准化，灭菌消毒后，在培养72小时条件下无细菌生长；
[0050](2)蟑螂提取物含有主要致敏蛋白 Per al> Per a2> Per a4> Per a6> Per a7> PeralO,次要过敏蛋白Per a5 ；
[0051](3)检测蟑螂提取物总蛋白量:蟑螂提取物在2mg / mL的浓度下使用考马斯亮蓝法检测，使批间差异为10% ；
[0052](4)使用Western blot法检测蟑螂提取物主要过敏原蛋白间比例，使批间差异为15% ；
[0053](5)使用ELISA法，肥大细胞激发试验检测总生物效价，使批间差异为20% ；
[0054](6)检测溶解性，5mg / mL蛋白无沉淀出现；
[0055](7)加入的重组主要过敏原与提取物之间无沉淀反应；
[0056](8)在培养72小时条件下无细菌生长；
[0057](9)蟑螂提取物剂量在5mg / mL条件下，一周内无细胞毒性反应。
[0058]本实施例中蟑螂为美洲大蠊。
[0059]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。