用Pseudomonas fluorescens PGM37菌株生产葡甘聚糖的制作方法[0002]葡甘聚糖是由葡萄糖和甘露糖以某种形式连接而成的高分子量非离子型多糖。本发明中的葡甘聚糖是由D-葡萄糖(Glc)和D-甘露糖(Man)按一定的摩尔比通过某种糖苷键结合而成的复合多糖。经检索，没有关于与本专利相关细菌产生葡甘聚糖的相关报道与专利。葡甘聚糖具有独特的理化性质和较强的增强免疫力、降低血脂、抗自由基氧化、抗辐射、延缓衰老的生物活性，并且有很好的吸湿保湿性能，被广泛地应用于食品医学、药学、化妆品、纺织品和食品等工业中，因此，对葡甘聚糖的研究具有重要的意义和价值。目前国内外报道的葡甘聚糖的来源只有以魔芋块茎为代表的植物组织，魔芋块茎中含有丰富的魔芋葡甘聚糖(简KGM)，具有降血脂、血清胆脂及消肿攻毒之功效，也是重要的添加剂和化工原料。通常将新鲜的魔芋加工成魔芋精粉后使用，魔芋精粉的主要成分是KGM，它是魔芋的贮备性多糖，也是一种多糖类半纤维。魔芋植物中所含的葡甘聚糖是由P-D-葡萄糖与3-D-甘露糖以1: 1.6的比例、通过(6-(1,4)糖苷键连接成的杂多糖。微生物是多糖生产的重要来源，但是产生葡甘聚糖的微生物目前还没有报道，与植物葡甘聚糖相比，微生物来源的葡甘聚糖具有生产周期短、产量高、成本低、稳定性好、不受气候和地理环境条件限制以及生理活性强等优点，能够补充葡甘聚糖仅有魔芋这一单一来源的局限，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。在我国已投入工业化生产的微生物多糖只有葡聚糖(Glucan)、黄原胶(Xanthan gum)、结冷胶(Gellan gum)、热凝多糖(Curdlan)和透明质酸(Hyaluronic acid, HA)等少数几个品种,而且产量不足我国市场需求的1/3,大部分需要依靠进口。因此，筛选产糖性状优良的菌株，开发新的具有工业化生产潜力的微生物多糖是促进我国多糖工业发展的关键。
[0003]本发明的目的是提供一种能产生葡甘聚糖的微生物Pseudomonas fluorescensPGM37以及利用该菌株生产葡甘聚糖的方法。[0004]本发明分离纯化出一株来源于小麦面粉中细菌Pseudomonas fluorescensPGM37，其具有产生葡甘聚糖的特性。采用革兰氏染色、荚膜、鞭毛、运动性观察等形态学观察作为菌种的初步鉴定，然后根据《伯杰氏细菌鉴定手册第九版》和《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化实验做进一步鉴定。通过16SrDNA基因测序和系统进化树分析，鉴定结果为 Pseudomonas fluorescens 菌。命名该菌株为 Pseudomonas fluorescens PGM37。菌种保藏单位:中国典型培养物保藏中心。地址:中国武汉，武汉大学。保藏日期为2012年05月27日，保藏号为M2012183 。经GPC测定得到该多糖重均分子量为3619.6kDa，采用气相色谱法、红外光谱法、ES1-LC-MS等方法对Pseudomonas fluorescens PGM37产生的胞外多糖进行组分及结构分析，确定该糖由P-D-葡萄糖和P-D-甘露糖以直链形式间隔排列，含量比 I: 1，为线形 P -D-Glcp-(I，4)-D-Manp-(I，4)-D-Glcp-(I，4)-D-Manp 结构。
[0005]图1:Pseudomonas fluorescens PGM37葡甘聚糖的分子量积分分布曲线
[0006]图2:Pseudomonas fluorescens PGM37葡甘聚糖的气相色谱组分分析图谱

[0007]本发明是通过以下技术路线实现的:
[0008]1、菌种分离鉴定:
[0009]取Ig小麦面粉样品，加入到装有25mL富集培养基的三角瓶中，28°C，150r/min摇瓶培养48h。然后将富集培养液用无菌生理盐水稀释10倍后，取0.1mL涂布PDA培养基平板。28°C倒置培养48h，获得在平板上有粘稠透明外观的菌落，得到能产胞外多糖的细菌，4°C条件下保存。富集培养基由蔗糖20g，酵母膏3g，NaCl 2g, K2HPO4Ig, MgSO40.5g,(NH4)28040.5g组成，加蒸馏水lOOOmL，调pH7.0。按常规方法对菌株进行16SrDNA基因测序，将测序结果与Genebank中Pseudomonas fluorescens的序列进行比对相似度最高。通过进化树分析，结合该菌株形态及生理生化特征，确定为突光假单胞菌Pseudomonasfluorescens,因此命名该菌株为Pseudomonas fluorescens PGM37。该菌种保藏单位:中国典型培养物保藏中心。地址:中国武汉，武汉大学。保藏日期为2012年05月27日，保藏号为 M2012183。
[0010]2、突光假单胞菌Pseudom onas fluorescens PGM37胞外多糖的生产方法:其特征在于培养基组分、发酵条件、制备方法以及所得胞外多糖的结构:
[0011]产糖培养基组分(g/L):蔗糖40，酵母膏 3，NaCl 1，CaCl20.2，K2HPO4I, pH 7.0。
[0012]发酵条件:装液量为每250mL三角瓶装IOOmL培养基，接种量为5% (v/v)，初始pH值为 7.0，28°C，150r/min 培养 48h。
[0013]生产步骤:
[0014](I)菌种活化:将保存菌种接于PDA斜面培养基中，于28°C恒温培养24h后，保存在4°C冰箱备用。
[0015](2)接种培养制备种子液:种子液培养基组分为(g/L):蔗糖20，酵母膏2.5,NaCl1，K2HPO4I, pH 7.0，装液量每250mL摇瓶装IOOmL培养基。将步骤(1)中的PDA斜面菌种接种于种子液培养基，于28°C摇床培养2d，摇床转数为150r/min。
[0016](3)产糖培养基与产糖培养:产糖培养基组分与含量为(g/L):蔗糖40，酵母膏3，NaCl 1，CaCl20.2，K2HPO4I, pH 7.0。将步骤(2)发酵好的种子液以5% (v/v)接种量接种于产糖培养基，其特征在于发酵培养条件为:装液量为250mL三角瓶装IOOmL培养基，接种量为 5% (v/v)，28°C，150r/min 培养 48h。
[0017](4)多糖的制备:将步骤(3)得到的发酵培养物3600rpm离心5min离心去除菌体后，将发酵液浓缩至原体积的1/2，再将pH调至8，最后用2倍95%乙醇沉淀，在4°C冰箱内静置过夜，3600rpm离心IOmin得到白色沉淀,沉淀溶于水，将得到的复溶液3600rpm离心IOmin,除去不溶物。复溶液再次沉淀多糖，沉淀用无水乙醇洗两次，即得PseudomonasfluorescensPGM37生产的葡甘聚糖。
[0018]3、多糖鉴定:
[0019](I)多糖纯度鉴定:称取冻干后的粗多糖样品20mg，用ImL蒸馏水使其溶解，3600r/min离心IOmin,每次取上清液0.5mL过Sephacryl S-300HR凝胶层析柱,用超纯水洗脱，流速lmL/2min。经自动部分收集器收集后，各层析组分用苯酚-硫酸法检测糖分布，以管序号为横坐标OD49tol值为纵坐标作图。结果表明产品为均一正态峰。
[0020](2)多糖分子量测定:水相 GPC (Gel Permeation Chromatography)方法，以不同大小分子量(T5、T10、T20、T50、T100)的系列蓝色葡聚糖(Sigma)为标准，用无菌超纯水配制成浓度为5mg/mL的标准溶液，以洗脱体积为横坐标，IgM(分子量对数值)为纵坐标，绘制成标准曲线。样品操作方法同标准品，通过样品出峰时间和标准曲线计算出重均分子量为 3619.6kDa(见附图1)。
[0021]操作条件:使用AgilentllOO型高效液相色谱仪测定；SB_804HQ型凝胶柱；以Ig/L的Na2SO4为洗脱液，流速为0.5mL/min ;示差检测器(RI);操作温度为40°C ;进样量为20 u L0
[0022] (3)多糖结构鉴定:将PGM37生产的葡甘聚糖多糖样品用三氟乙酸水解后糖醇乙酸酯法衍生进行气相色谱分析，确定该糖由葡萄糖和甘露糖以1:1的比例构成(见附图2，峰面积比1:1)。通过红外光谱分析确定该多糖的构型为(6-吡喃糖，且由P-D-葡萄糖和3-D-甘露糖组成。多糖经酶解后通过液相-电喷雾质谱联用技术得到降解寡糖的分子量片段，结合酶和降解底物的专一性确定多糖的连接方式为(6-(1,4)糖苷键，且为直线型多糖，连接方式为 P -D-Glcp- (I，4)-D-Manp- (I，4)-D-Glcp- (I，4)-D-Manp。