专利名称：运动功能改善剂的制作方法通常认为对于提高耐力和肌力等运动功能而言，运动训练和平衡性良好的营养补给很重要。最近，在运动爱好者和运动员中，为了实现更有效的肌力提高，不仅只进行训练，还尝试并用补给品等的营养补给(专利文献I )。但是，在过剩摄取一部分的蛋白质或者氨基酸的状态下进行训练，会有由于对肾功能等造成不良影响的担忧(非专利文献I)。另外，在运动爱好者和运动员以外的人中，由于不合理的节食导致营养成分在体 内补给不足，造成骨骼肌减少和肌力降低；伴随老化和肌肉不使用的肌肉减弱化造成以肌力和耐力为首的运动各功能的衰退；进而伴随运动功能衰退的疲劳，均被视为问题。因此，不仅仅是在以提高成绩为目标的运动爱好者和运动员中，在广大的普通人中也期待有效的运动功能改善技术。从此观点出发，进行具有运动功能改善作用的成分的探索，例如，报告有茶儿茶素所产生的耐力提高作用(日本专利文献2)、聚合物果实多酚(日本专利文献3)和植酸(日本专利文献4)所产生肌力提高作用等。进而，近些年来，逐渐知晓磷脂质可能对运动功能产生影响，报告有由磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)产生的运动时的乳酸蓄积抑制作用(非专利文献2)和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)产生的耐力提高效果(非专利文献3)等。另一方面，我们的生命活动是由被称为代谢的各种物理·化学过程的连锁所产生的三磷酸腺苷(ATP)来支撑。线粒体负有能量代谢中心的作用，通过脂肪酸的β氧化和由电子传递体系的氧化磷酸化来供给ATP。反映生物体内的能量消耗的氧消耗的特征为，在骨骼肌、肝脏、或者心脏中较多，这与线粒体在心肌和肝脏、骨骼肌中大量分布的现象一致，由此可知线粒体在能量代谢中的作用很大。据称生物体内的氧消耗的90%以上是在线粒体进行的。近些年来，逐渐知道线粒体的功能异常与生活习惯病及老化相关疾病密切相关。已知由于老化产生的能量代谢的降低与线粒体DNA的变异和损伤等的线粒体功能的降低相关(非专利文献4)。线粒体功能的降低经由能量代谢的降低，引起能量摄取和能量消耗的不平衡，从而成为生活习惯病的原因(非专利文献5)。因此，认为维持 提高线粒体功能并提高能量代谢，这与生活习惯病的预防·改善相关，有助于提高生活质量(Q0L)。已知运动是增加肌肉的线粒体量的方法之一(非专利文献6)。因此，认为进行运动是与通过增加肌肉中的线粒体，从而增加在生物体中的能量消耗相关。然而，即使是在广泛认识到运动的重要性的现代，在现实中也难以定期进行运动，因此希望能有更加有效地促进能量代谢、增加能量消耗的方法。从此观点出发，进行了提高线粒体功能、能量代谢的成分的探索，作为促进能量代谢的成分，报告有具有交感神经活化作用的咖啡因和辣椒素等(非专利文献7、8)。然而，咖啡因和辣椒素从安全性和刺激性的观点等出发，其实用性被限定而不能满足要求。其它的具有能量代谢促进作用的例子，可以列举含有甜椒素(capsinoids)的组合物(专利文献5)和黄烷类或者黄烷酮类(专利文献6)。另外，近些年来，报告有辣味少、低刺激性的作为辣椒素类近缘体的辣椒素酯的能量代谢促进作用(非专利文献9)。进而，发现茶儿茶素的抑制伴随老化的能量代谢降低、线粒体功能降低的作用(专利文献7)。另外，作为具有线粒体功能活化作用的例子，可以列举苯并咪唑衍生物或者其盐(专利文献8)、1，2-乙二醇或者其盐(专利文献9)。但是，基本不知道除这些以外的提高能量代谢和线粒体功能的成分。已知鞘磷脂是具有在由神经鞘氨醇碱和脂肪酸构成的神经酰胺骨架上结合胆碱磷酸而成的结构的化合物，在体内多存在于脑和神经组织中。近些年来，随着其生理功能研究进步，已知其具有促进消化道的成熟和发育的效果(专利文献10)、学习能力提高效果(专利文献11)和唾液酸粘蛋白的分泌促进效果(专利文献12)等生理功能。另外，还报告其与肌肉卫星细胞的活化的关联(非专利文献10)以及具抗炎症作用(非专利文献11)。进一步，关于鞘磷脂的利用，已知有脂质的消化吸收功能改善剂(专利文献13)、肠道运动功能不全性疾病治疗剂(专利文献14)等。然而，迄今为止完全不知道鞘磷脂对于肌力和耐力等的运动功能，另外，对线粒体功能、能量代谢产生的影响。现有技术文献专利文献[专利文献I]日本专利特开2002-065212号公报[专利文献2]日本专利特开2005-89384号公报[专利文献3]国际公开2005/074962号小册子[专利文献4]日本专利特开2009-107987号公报[专利文献5]日本专利特开2004-149494号公报[专利文献6]日本专利特开2007-314446号公报[专利文献7]日本专利特开2008-63318号公报[专利文献8]日本专利特开2004-67629号公报[专利文献9]日本专利特开2002-322058号公报[专利文献10]日本专利特开2000-250563公报[专利文献11]日本专利特开2007-246404公报[专利文献12]日本专利特开2007-112793公报[专利文献13]日本专利特开平11-269074号公报[专利文献14]日本专利特开2003-252765号公报非专利文献、非专利文献I :Anderson, JAMA, 223，1973非专利文献2 :Von Allworden, Phospholipids, AOCS Press, 1995非专利文献3 :Kingsley, Med Sci Sports Exerc, 38, 2006非专利文献4 :岩波讲座现代医学的基础1999 12 (2) =55-58.非专利文献5:Ritz P. Diabetes Metab. 2005 2:5S67_5S73.非专利文献6 :Holloszy JO. J. Physiol. Pharmacol. 2008 59:5-18.非专利文献7 =Dulloo AG. Am J Clin Nutr. 1989 49(1) :44-50.非专利文献8 :Kawada T. Proc Soc Exp Biol Med. 1986 183(2) :250-6.非专利文献9 :0hnuki K. Biosci Biotechnol Biochem. 2001 65(12) :2735-40.非专利文献10 Nagata Y. J Histochem Cytochem. 2006 54(4) : 375-384.非专利文献11 Furuya H. Int J Vitam Nutr Res. 2008 78(1) :41-4·9.
本发明涉及下述(I) (8)。(I)以鞘磷脂作为有效成分的运动功能改善剂。(2)以鞘磷脂作为有效成分的耐力提高剂。(3)以鞘磷脂作为有效成分的肌力提高剂。(4)以鞘磷脂作为有效成分的肌力降低抑制剂。(5)以鞘磷脂作为有效成分的抗疲劳剂。(6)以鞘磷脂作为有效成分的线粒体功能提高剂。(7)以鞘磷脂作为有效成分的能量消耗促进剂。(8)以鞘磷脂作为有效成分的脂质燃烧促进剂。图I表示游泳耐力的发展的图。Ex表示摄取标准食物+运动组，SPM表示摄取O. 25%鞘磷脂食物+运动组。图2表示摘除的比目鱼肌以及趾长伸肌的肌力的图。Cont表示摄取标准食物组，Ex表示摄取标准食物+运动组、SPM表示摄取O. 25%鞘磷脂食物+运动组。图3表示摘除的比目鱼肌的肌力的图。Normal表示摄取标准食物+未处理(非悬尾)组，Cont表示摄取标准食物+悬尾组，SPM表示摄取O. 25%鞘磷脂食物+悬尾组。#表示相对于Normal组的显著差。

本发明的运动功能改善剂、耐力提高剂、抗疲劳剂、肌力提高剂、以及肌力降低抑制剂，对于包括高龄者在内的广大年龄层，在用于运动时、以及包括劳动在内的日常活动时的运动功能的改善、耐力提高、抗疲劳、肌力提高、或者肌力降低抑制的食品、医药品、医药部外品或者饲料中作为有效成分来配合的素材有用。另外，线粒体功能提高剂、能量消耗促进剂、以及脂质燃烧促进剂在用于预防·改善线粒体功能和能量代谢降低的食品、医药品、医药部外品或者饲料中作为有效成分来配合的素材有用。能在本发明中使用的鞘磷脂不特别限定，可以列举化学合成的鞘磷脂、和来自天然的鞘磷脂。例如，作为鞘磷脂的化学合成法，已知有通过I)经由亚磷酰胺的方法(Weis, Chem Phys Lip, 3, 1999)、2)经由环状磷酸盐的方法(Dong, Tetrahedron Lett, 5291, 1991)、或者3)经由环状亚磷酸盐的方法(Byun, Org Chem, 6495, 1994),在神经酰胺的I位轻基上导入胆碱磷酸而转变为鞘磷脂的方法。另外，可以通过将从牛乳中得到的乳脂肪球皮膜成分通过透析、硫酸铵分馏、凝胶过滤、等电点沉淀、离子交换色谱法、溶剂分懼等方法精制(Sanchez-Juanes, Int DairyJ, 273，2009)，由此能够得到高纯度的鞘磷脂。进一步，作为鞘磷脂可以使用市售品。作为这样的市售品，可以列举日油(株)“来自牛乳的鞘磷脂NM-70”和“来自蛋黄的鞘磷脂NM-10”等。如后述实施例所示，鞘磷脂在小鼠中由于可以显著延长游泳时间，显著增大比目鱼肌的肌力，因此具有提高耐力作用、提高肌力作用、以及保证提高这些运动功能的提高的抗疲劳作用。另外，鞘磷脂在通过肌肉不使用(悬尾)处理而造成肌力降低的小鼠中，由于显著抑制肌力降低，因此具有肌力降低抑制作用。由于耐力和肌力是用于活动身体的代表性运动功能，因此鞘磷脂通过对包括人在内的动物进行给药或摄取，对于运动以及包括日常的动作以及劳动在内的广义的运动，可以用于实现运动功能的改善、耐力提高、肌力提高、抗疲劳的方法中，或者用于实现肌力降低抑制的方法中。在本发明中，运动功能改善不仅是指通过提高·改善肌力和耐力等来提高·改善运动员和运动爱好者的运动能力，还指提高·改善由于肌萎缩和运动器官综合症等造成的运动器官功能降低者的身体活动度。另外，运动器官综合症是指运动器官症候群，认为其原因在于运动器官本身的疾病和随着老龄化的运动器官功能不全。作为随着老龄化的运动器官功能不全，可以列举肌力降低、耐力降低、反应时间延长、运动速度降低、精巧性降低、深部感觉降低、平衡能力降低等。进一步，随着老龄化而变得运动不足以及这些肌力和平衡能力降低等互相作用而引起运动器官功能整体降低，出现变得容易跌倒等弊处。因此，本发明的鞘磷脂可以用于处理运动器官综合症和老年性骨骼肌减少症(Sarcopenia)，具体来说是可以用于运动器官综合症的发病风险的降低、预防或者改善；老年性骨骼肌减少症(Sarcopenia)的发病风险的降低、预防或者改善。另外，如后述实施例所示，鞘磷脂具有线粒体功能提高作用、能量消耗促进作用、脂质燃烧促进作用。因此，鞘磷脂通过对包括人在内的动物进行给药或者摄取，从而可以在用于实现线粒体功能的提高、能量消耗的促进、以及脂质燃烧的促进的方法中使用。线粒体存在于生物体内的大量细胞中，作为特别重要的功能其负有通过氧化磷酸化反应产生ATP。即，在本发明中线粒体功能是指从糖质和脂质等的营养素中，获取细胞生存/活动能量。另外，因为认为线粒体功能异常与生活习惯病和老化相关疾病等密切相关，因此，本发明的鞘磷脂可以用于以肥胖和糖尿病为首的胰岛素抗性相关疾病、老龄化和不活动造成的虚弱和疲劳的预防和改善。另外，本发明中能量消耗是指营养素(能量源)在生物体各组织中代谢，转化为化学能或者热能，能量消耗量从该过程中所消耗的氧量算出，是指个体水平的宏观的物理化学能量产生量。即，能量消耗促进作用是指增加如上述定义的能量消耗量的作用。另外，月旨质燃烧是指脂肪酸在生物体各组织中代谢，转化为化学能或者热能。脂质燃烧量是从其氧化的代谢过程中所消耗的氧量和排出的二氧化碳量，通过例如下述的Peronnet 等的式(i)算出的值(Peronnet 等，Can J Sport Sci. 1991 16:23-29) ,是指个体水平的来源于脂质的能量产生量。即，脂质燃烧促进作用是指增加如上述定义的脂质燃烧量的作用。脂质燃烧量=1.695X (1-1.701 / I. 695X呼吸商)X氧消耗量(i)(呼吸商=二氧化碳排出量/氧消耗量)另外，鞘磷脂可以作为运动功能改善剂、耐力提高剂、肌力提高剂、抗疲劳剂、肌力降低抑制剂(以下，称为“运动功能改善剂等”)，或者作为线粒体功能提高剂、能量消耗促进齐 、脂质燃烧促进剂(以下，称为“线粒体功能提高剂”)使用，进一步可以在用于制造该运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等中使用。此时，在该运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等中，可以单独使用该鞘磷脂，或者除此之外，还可以使用根据需要而适当选择的载体等的在要配合的后述对象物中所接受的物质。另外，该制剂可以根据要配合的对象物通过常用方法来制造。本发明的运动功能改善剂等可以作为发挥运动功能改善、耐力提高、肌力提高、抗疲劳、肌力降低抑制的各效果的，人或者动物用的医药品、医药部外品、食品或者饲料的有效成分来配合使用。另外，本发明的运动功能改善剂等可以应用于以在运动不足者和中老年者、卧床休息者、或者运动和运动爱好者中的耐力提高、肌力提高、抗疲劳、肌力降低抑制为概念，根据需要表达该宗旨的食品、功能性食品、病人用食品、特定保健用食品中。另外，本发明的线粒体功能提高剂除了可以对人以及动物进行给药之外，还可以作为各种饮食品、医药品、宠物食品等的有效成分来配合使用。作为食品，可以应用于以线粒体功能提高、或者能量消耗促进以及生活习惯病的预防·改善·发病风险的降低等生理功能为概念，根据需要表达该宗旨的饮食品、功能性饮食品、病人用饮食品、特定保健用食品等中。将本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提闻剂等作为医药品、医药部外品的有效成分使用的情况下的给药方式，可以列举例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等经口给药；或者注射剂、栓剂、吸入药、经皮吸收剂、外用剂等非经口给药。另外，在调制这些各种剂型的制剂时，可以单独使用本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等，或者适当组合其它药学上可接受的赋形剂、粘合剂、增量剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、矫味剂、香料、包膜剂、载体、稀释剂等使用。另外，这些给药方式中优选的方式为经口给药，在调制经口用液体制剂的情况下，可以加入矫味剂、缓冲剂、稳定剂等根据常用方法来制造。将本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等作为食品的有效成分使用的情况下，作为该食品的形态，除了牛乳、加工乳、乳饮料、酸奶、清凉饮料水、茶类饮料、咖啡饮料、果汁饮料、碳酸饮料、果汁、果冻(jelly)、威化饼、饼干、面包、面、香肠等饮食品和营养食品等各种食品之外，进一步还可以列举与上述经口给药制剂相同的形态(片剂、胶囊齐U、糖浆剂等)的营养补充用组合物。在调制各种形态的食品时，本发明的运动功能 改善剂等、线粒体功能提闻剂等可以单独使用，或者也可以适当组合其它的食品材料和溶剂、软化剂、油、乳化剂、防腐剂、香料、稳定剂、着色剂、抗氧化剂、保湿剂、增粘剂、鞘磷脂以外的有效成分等使用。本发明的运动功能改善剂等可以配合于运动功能改善用食品、耐力提高用食品、抗疲劳用食品、肌力提高用食品、宠物食品等。另外，本发明的运动功能改善剂等对于难以进行适量营养补给的高龄者和卧床休息状态的患者，可以以经肠营养剂等的营养组合物的方式配合。另外，配合有本发明的线粒体功能提高剂等的食品可以作为线粒体功能提高用食品、能量消耗促进用食品、脂质燃烧促进用食品使用。另外，在将本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等作为饲料的有效成分使用的情况下，可以大范围用于所有家畜的饲料，例如，用于牛、猪、鸡、羊、马、山羊等的家畜用饲料；用于兔子、大鼠、小鼠等的小动物用饲料；用于金枪鱼、鳗鱼、鲷鱼、幼年黄蛳鱼、虾等的鱼类和贝类用饲料；用于狗、猫、小鸟、松鼠等的宠物食品等。在饲料中除了本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等之外，还可以适当配合肉类、蛋白质、谷物类、糠类、酒糟类、糖类、蔬菜、维生素类、矿物质类等通常使用的饲料原料；或者溶剂、软化剂、油、乳化剂、防腐剂、香料、稳定剂、着色剂、抗氧化剂、保湿剂、增粘剂等，可以按照常用方法来制造该饲料。相对于含有本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等的饮料，例如乳饮料、清凉饮料水、茶类饮料等，鞘磷脂的配合量(干燥物换算)通常优选为O. 000Γ1. O质量％，进一步优选为O. ΟΟΓΟ. 5质量％，特别优选为0. 0Γ0. 2质量％。在含有本发明的运动改善剂等、线粒体功能提闻剂等的饮料以外的食品和词料、或者医药品，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂等经口用固态制剂；内服液剂、糖浆剂等经口用液体制剂的情况下，鞘磷脂(干燥物换算)通常优选为0. 002 50质量％，进一步优选为0. 02^25质量％，特别优选为0. 2^10质量％。另外，鞘磷脂不限定其存在状态，可以为溶解状态，也可以为分散状态。本发明的运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等的摄取量根据其剂型和用途而不同，可以调整鞘磷脂在医药品、饮食品和饲料中的配合量，以使其相对于成人每I天摄取量为0. I 1000mg/60kg体重，特别优选为I 250mg/60kg体重，更加优选为5 100mg/60kg体重。另外,运动功能改善剂等、线粒体功能提高剂等可以根据任意的给药 摄取计划来进行给药，优选分为I天I次 数次进行给药·摄取。本发明的运动功能改善剂等没有特别限定，优选在身体活动时进行给药或者摄取，特别优选在给药或者摄取时组合运动。在组合运动的情况下，优选在运动前后I小时以内摄取。作为组合的运动，可以列举通过持续进行可以抑制肌力降低的强度或者能提高肌力的强度的运动。另外，上述制剂优选一周内给药或者摄取3天以上，特别优选5天以上，更加优选每天给药或者摄取。另外，给药或者摄取的持续期间优选为2周以上，更加优选为4周以上。作为给药或者摄取对象者，只要是有需要者就没有特别限定，因为本发明的运动功能改善剂等可以实现运动功能的提高 改善，所以特别是对运动爱好者和运动员、运动器官综合症患者、老年性骨骼肌减少症(Sarcopenia)患者、神经·肌病(炎症性肌病、内科疾病伴发肌病、肌肉萎缩症、先天性肌病、线粒体脑肌病、糖原病等)患者、运动不足者、卧床休息者、外科疾病/内科疾病后的康复训练者进行给药或者摄取有效。
另外，线粒体功能提高剂等没有特别限定，优选在日常活动时，例如在做家务或者工作中、上班上学等时进行给药或者摄取。另外，上述制剂优选I周内给药或者摄取3天以上，特别优选5天以上，更加优选每天给药或者摄取。另外，给药或者摄取持续期间优选为2周以上，进一步优选为4周以上。作为给药或者摄取对象者，只要是有需要者就没有特别限定，本发明的线粒体功能提高剂等可以实现线粒体的功能的提高、能量消耗的促进、脂质燃烧的促进，因此，特别是对肥胖者、糖尿病患者等的胰岛素抗性发病者、高龄者、其它线粒体功能障碍相关疾病(肌阵挛性癫痫发作伴破碎红纤维(myoclonus epilepsy with ragged red fibers,MERRF)>Leigh综合症、线粒体糖尿病、Leber病、Pearson综合症、Kearns-Sayre综合症、脑卒中样症候群等的线粒体病、脂肪肝疾病等)患者进行给药或者摄取有效。实施例制造例I鞘磷脂的调制取牛乳磷脂质PC_500(由Fonterra Japan公司得到,含有鞘磷脂8. 8质量％(以下表示为“°/。”))201g,加入丙酮4000mL,在冰冻条件下用均质混合机(T. K. Auto Homo Mixer,特殊机化工业公司制造)分散。之后，通过离心分离，除去丙酮可溶馏分(中性脂质)。向得到的丙酮不溶懼分A中加入氯仿800mL、甲醇400mL、水300mL,通过液液提取,取氯仿层。减压浓缩氯仿层，得到氯仿馏分A 154g。向得到的氯仿馏分A中，添加氢氧化钾28. 05g和甲醇lOOOmL，在氮气下、37° C下搅拌15小时，进行水解。反应结束之后，加入氯仿2000mL、水750mL，进行液液分配，取氯仿层。将氯仿层减压浓缩之后，用醋酸15mL中和，加入氯仿400mL、甲醇200mL、水150mL，再次进行液液提取。取氯仿层，减压浓缩，得到氯仿馏分B 90g。向得到的氯仿馏分B中加入丙酮1200mL，在冰冻条件下用均质混合机(T. K. AutoHomo Mixer，特殊机化工业公司制造)分散。之后，通过离心分离，除去丙酮可溶馏分(游离脂肪酸)。进而重复同样的操作2次，得到丙酮不溶馏分B 44g。向得到的丙酮不溶馏分B中添加己烷400mL、甲醇400mL、水150mL、28%氨水50mL，进行液液提取，取己烷层。向己烷层中进一步添加甲醇400mL、水150mL、28%的氨水50mL，并清洗。将得到的己烷层减压浓缩，得到己烷馏分27g。使用得到的己烷馏分中的22g，用硅胶柱色谱法进行精制。即，使己烷馏分的氯仿溶液吸附于硅胶(Silica Gel 60，Merck公司制造)lkg，然后用氯仿/甲醇混合溶剂溶出杂质，然后用甲醇21L溶出，得到精制鞘磷脂馏分16g (收率8%)。试验例I銷憐脂的耐力提闻、肌力提闻效果
〈方法〉鞘磷脂是基于上述制造例I的方法，由牛乳磷脂质(PC-500, Fonterra Japan公司)来提取。将进行I周预饲养之后的9周龄的雄性BALB/c小鼠(CHARLES RIVERLABORATORIES JAPAN, INC.)以体重和游泳耐力[按照后述方法，使用小鼠用流水池(京大松元式运动量测定流水槽长X宽X深90 X 45 X 45cm,水深38cm,水温34° (XMatsumoto, JAppl Physiol. 81:1843-1849, 1996))测定极限游泳时间]相等的方式分成3组(Cont组、Ex组、SPM组)(每组8只)。分组之后，对Cont组和Ex组的小鼠，用对照食物(10%脂质、20%干酪素、55. 5%土豆淀粉、8. 1%纤维素、O. 2%蛋氨酸、2. 2%维生素(商品名维生素混合AIN-76, OrientalBioService, Inc. )、4% 矿物质(商品名矿物质混合 AIN-76, Oriental BioService, Inc.))进行喂食，另外，对SPM组的小鼠，用通过制造例I得到的含有鞘磷脂的试验食物(10%脂质、20%干酪素、55. 25% 土豆淀粉、8. 1%纤维素、O. 2%蛋氨酸、2. 2%维生素、4%矿物质、O. 25%鞘磷脂)进行喂食，喂食13周。在喂食期间，对Ex组和SPM组的小鼠，使用小鼠用流水池每周测定I次极限游泳时间。极限游泳时间是从游泳开始，在7L/min的流量下，直至小鼠在7秒内不能为呼吸而浮上水面的时间。另外，在此期间，为了使小鼠习惯运动，每周进行2次游泳训练(6L/min，30min)。饲养13周后供给解剖，测定摘除的比目鱼肌以及趾长伸肌的肌力。摘除肌的肌力测定是基于Cannon等的方法(Biomed Sci Instrum, 2005)进行。S卩，从小鼠摘除比目鱼肌和趾长伸肌，使用缝合线(#5-0丝线)固定于转换器(transducer) (WPI，F0RT100)上，浸溃在37° C的Krebs溶液中(以95%02、5%C02通气)。通过2根钼电极，进行40Hz、330ms、IOV的电刺激，测定从转换器得到的信号作为肌力(g/mg肌肉)。〈结果〉图I中，显示鞘磷脂对游泳耐力所产生的影响。在鞘磷脂给药的小鼠中，从给药开始后的早期开始就确认有耐力的提高，在给药开始5周之后，对于Cont组确认有显著的耐力提高。另外，在图2中，显示鞘磷脂对肌力提高所产生的影响。在鞘磷脂给药的小鼠中，显示比目鱼肌以及趾长伸肌的肌力为显著高的值。耐力和和肌力是用于活动身体的代表性运动功能，另外，还认为通过提高运动功能，可以提高对身体疲劳的耐性。因此，在本试验中可知，鞘磷脂在运动功能的改善、耐力提闻、肌力提闻以及抗疲劳方面有效。试验例2鞘磷脂的肌力降低抑制效果〈方法〉将雄性BALB/c小鼠(9周龄)预饲养I周，基于体重分成3组(Normal组、Cont组、SPM 组)(各组 n=8)。分组之后，对Normal组和Cont组的小鼠，用对照食物(10%脂质、20%干酪素、55. 5% 土豆淀粉、8. 1%纤维素、O. 2%蛋氨酸、2. 2%维生素、4%矿物质)进行喂食，另外，对SPM组的小鼠，用从制造例I得到的含有鞘磷脂的试验食物(10%脂质、20%干酪素、55. 25%土豆淀粉、8. 1%纤维素、O. 2%蛋氨酸、2. 2%维生素、4%矿物质、O. 25%鞘磷脂)进行喂食，喂食2周。在用试验饲料喂食2周之后，对Cont组和SPM组的小鼠进行悬尾处理，对后肢肌组(比目鱼肌等)去除重力负荷。减少负荷的肌肉呈废用性肌萎缩(disuse muscleatrophy),肌质量和肌力下降。对Normal组的小鼠不进行悬尾处理。进行悬尾处理7天之后，将小鼠供于解剖，测定摘除的比目鱼肌的肌力。摘除肌的肌力测定用与试验例I同样的方法进行。〈结果〉图3中显示摘除的比目鱼肌的肌力。伴随着悬尾处理，Cont组和SPM组的肌力显著降低。另一方面，SPM组的肌力相对于Cont组显示显著的高值。因此，从本结果可知鞘磷脂所产生的肌力降低抑制效果。
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试验例3鞘磷脂的能量消耗及脂质燃烧促进作用如下进行对鞘磷脂的能量消耗和脂质燃烧促进作用的评价。鞘磷脂按照上述制造例I的方法从牛乳磷脂质(PC-500, Fonterra Japan)中提取。进行I周预饲养后，将9周龄的BALB/c小鼠(雄性Oriental BioService, Inc.)以体重相等的方式分成2组(各组8只)。之后，用对照食物(10%脂质、20%干酪素、55. 5% 土豆淀粉、8. 1%纤维素、O. 2%蛋氨酸、2. 2%维生素(商品名:维生素混合AIN-76, Oriental BioService, Inc. )、4%矿物质(商品名矿物质混合AIN-76, Oriental BioService, Inc.));或者用含有鞘磷脂的试验食物(10%脂质、20%干酪素、54. 5%土豆淀粉、8. 1%纤维素、O. 2%蛋氨酸、2. 2%维生素、4%矿物质、O. 25%鞘磷脂)进行喂食9周，在第10周进行呼气分析。将小鼠移入呼气分析用腔室中，进行48小时环境驯化之后，使用Arco-2000system (Alco Systems)测定24小时各小鼠的氧消耗量以及呼吸商。在此,氧消耗量是指能量消耗量(每Imin的每Ikg小鼠体重的氧消耗量mL (mL/kg/min)),呼吸商是指二氧化碳排出量和氧消耗量的比。从这些氧消耗量和呼吸商，使用Peronnet的式子(Peronnet F，and Massicotte D (1991) Can J Sport Sci 16:23-29.),算出脂质燃烧量。在表2中表示24小时的平均能量消耗(mL/kg/min)、平均脂质燃烧量(mg/kg/min)。取饲养13周之后的各组的小鼠的腓肠肌,使用RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen),得到RNA样品。定量各RNA样品，在每I次反应的RNA量为125ng的反应液中(I XPCR 缓冲液 II (Applied Biosystems 公司)、5mM MgCl2> ImM dNTP mix>2. 5 μ M Oligod[T] 18 (New England Biolabs 公司)、lU/ml RNase 抑制剂(TAKARA BIO 公司))进行逆转录反应，得到cDNA。反应条件为42°C下10分钟，52°C下30分钟，99°C下5分钟。以得到的cDNA 作为模板，利用 ABI PRISM 7700 Sequence Det ector (AppliedBiosystems公司)进行定量PCR。将36B4mRNA的表达量作为基准进行补正，作为相对的mRNA表达量来表示。作为引物，使用 36B4 (GenBank :NM_007475、正向GACATCACAGAGCAGGCCCT(序列号 I)、反向TCTCCACAGACAATGCCAGG (序列号 2))、PGC-1 a (GenBank :ΝΜ_008904、正向CCGAGAATTCATGGAGCAAT (序列号 3)、反向TTTCTGTGGGTTTGGTGTGA (序列号 4))。结果如表I所示。
[表I]饲养13周后的腓肠肌线粒体功能相关基因表达


本发明提供一种以鞘磷脂作为有效成分的运动功能改善剂、耐力提高剂、肌力提高剂、肌力降低抑制剂、抗疲劳剂、线粒体功能提高剂、能量消耗促进剂或者脂质燃烧促进剂。