专利名称：以大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位为载体的表位递送系统的制作方法表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant),它是 T 细胞抗原受体(Tcell receptor, TCR)和 B 细胞抗原受体(B cell receptor, BCR)及抗体特异结合的基本単位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibiIitycomplex, MHC)是高度多态性的细胞表面分子,它将多肽片段递呈给T 细胞。与MHC I类分子结合的抗原肽为8 12个氨基酸，是来自内源性抗原经蛋白酶降解后的产物。蛋白酶水解片段通过抗原加工相关转运体(transporter associated withantigen processing, TAP)转运至内质网与新合成的MHC I类分子相结合,MHC肽复合体转移至细胞表面被CD8+细胞毒性T细胞的TCR识别。MHCII类分子结合肽长度变化较大，为9 25个氨基酸，主要由外源蛋白通过溶酶体中的蛋白酶降解而来。在内体-溶酶体中与MHC II类分子结合后，MHC肽复合体也转运至细胞表面，被CD4+T细胞TCR识别。据此可设计出两大类T细胞疫苗，即与相应的MHC I及MHCII类分子相关的⑶8+T细胞疫苗和⑶4+T细胞疫苗。⑶4+辅助性T细胞(helperTCell，Th)又分为分泌不同细胞因子却又交叉调节的两群，即Thl和Th2。Thl亚群主要分泌白介素_2(IL_2)、Y干扰素(IFN-Y )和肿瘤坏死因素-β (TNF-β )，Th2亚群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13。据此人们可设计出诱导Thl或Th2应答的疫苗抗原分子。根据机体对病原体或肿瘤的免疫应答特点，可以选择特异性Th或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位以定向诱导宿主的Th应答或CTL应答，甚至通过选择Thl表位或Th2表位，可诱导机体向Thl或Th2型免疫应答定向发展。作为理想的免疫原，抗原分子中可同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，可诱导出度高特异性的体液或细胞免疫反应，从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用，因此可赋予较广的保护性。通过设计隐藏于抗原分子内部的表位可增强抗原的免疫原性，泛DR辅助 T 细胞表位(pan-DRhelperTcell epitopes, PADRE)或通用 T 表位(universalTepitope)以高亲和力与人群常见人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)分子结合，较少受MHC限制。虽然表位疫苗具有许多优点，并且其研究也取得了重大的进展，但由于缺乏天然蛋白的三维结构，表位疫苗的分子小，免疫原性差，半衰期短，使机体无法产生免疫反应，还可能引起免疫耐受。因此提高与抗体的亲和力、増加免疫原性与稳定性是近年来表位疫苗的研究热点。目前用于解决这ー问题的途径主要有氨基酸修饰、多表位串连展示到某个载体上。选择包含无关Th表位的蛋白分子作为载体，可以避免慢性感染者普遍存在的HLA-II类限制性耐受，诱导Thl类细胞因子占据优势地位。BSA，GST，匙孔血蓝蛋白(keyhole Imipethemocyanin, KLH)和破伤风类毒素(tetanus toxoid, TT)均可成为载体蛋白。通过化学偶联或融合表达的方法将表位与蛋白载体连在一起，免疫小鼠可诱导特异针对肽的免疫反应出现。此外，表位肽的有效性不仅取决于自身，还与不同的载体蛋白相关，良好的载体有利于加强表位的免疫源。大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)是ー种能导致人畜腹湾的毒性因子，为产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia, ETEC)产生的六聚体蛋白，由含240个氨基酸的A亚单位和5个具103个氨基酸的B亚单位(LTB)形成的五聚体构成。除了很强的毒性以外，LT具有很强的免疫原性并且能够辅佐其他抗原通过粘膜免疫途径使机体产生特异抗体，因而LT，尤其是其无毒或低毒突变体、LTB作为粘膜免疫佐剂，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学价值和经济价值。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)为一同源五聚体，它与广泛存在于真核细胞膜上的神经节苷脂(GMl)受体有特异的结合能力，能诱使机体产生较强的免疫反应，并且LTB无毒，因而被广泛用于免疫佐剂。当从细菌细胞中释放出来以后，毒素利用其B亚单位结合于小肠上皮细胞，在那 里它与靶细胞表面上存在的神经节苷脂GMl作用，使毒素定位于细胞膜上。在体外对LTB免疫的小鼠进行分析后掲示LTB显著改变淋巴结内淋巴细胞亚类的分布，在第四天CD8+细胞几乎全部缺失而B细胞比例却升高。LTB与B细胞表面GMl作用后的免疫调节作用有如下特点(I)多克隆的；(2)并不伴随显著的増殖出现；(3)这ー过程包含ー些重要分子的上调作用-即主要组织相容性复合物II (MHC II)，B7,⑶40，胞间粘附分子I(ICAM-I)和IL-2Ra。进ー步研究显示增强的IL_2Ra和MHC II是发生GMl-LTB相互作用后的主要结果，而其他因子则可能是因CD4+T细胞相互作用増加后而增加的。通过化学耦联的方法将抗原表位结合于LTB后，复合结合于细胞，再通过胞吞的形式进入细胞质，通过在内质网、高尔基体等内的代谢后，可将其携帯的表位递呈给MHCI。因而LTB既可以作为B细胞表位载体，也可以作为T细胞表位载体。目前有人利用化学交联的方法在进行相关研究。通过化学交联，虽然能形成免疫原性强的复合物。但化学交联剂价格昂贵、也不能保持复合物质量的均一性。本发明利用LTB作为载体，通过优化连接肽的氨基酸组成，筛选到4种适合于携带B细胞及T细胞抗原表位的核心短肽。这些短肽及它们的组合前后分别连接LTB及表位，在重组大肠杆菌里能实现分泌表达，以保持LTB完整生物学活性的五聚体方式存在，即保证每ー个LTB単体的末尾连上一段表位，通过纯化得到的融合蛋白能实现良好的质量控制。融合蛋白更好地实现载体-表位复合物的递呈，促进B淋巴细胞免疫应答及T淋巴细胞免疫应答。
本发明目的在于提供能在LTB的C末端携带不同抗原表位，在大肠杆菌中分泌表达，能低成本地形成具有生物学活性的五聚体融合蛋白，在免疫动物的过程中，该蛋白具有很强的表位递送能力。以LTB及连接肽构成的表位递送系统将为表位疫苗的研发提供新型载体。本发明的另ー目的在于提供该递送系统的生产方法。本发明的再一目的在于提供该递送系统在表位疫苗研制中的应用。技术方案13以重组质粒pMD18T-LT为模板，用PCR的方法扩增出LTB-Linker片段，进而构建 pMD18T-LTB_Linker 重组质粒。Linker 为 Seql，Seq2，Seq3，Seq4 及它们之间的组合。14以pMD18T-LTB-Linker重组质粒为模板，构建携带大鼠17肽胃泌素B细胞表位EEEE (Pepl)的重组质粒 pMD18T-LTB-Linker_P印 I。15以pMD18T-LTB-Linker重组质粒为模板，构建携带卵清蛋白T细胞表位SIINFEKL (Pep2)的重组质粒 pMD 18T-LTB-Linker_P印2。16 用 NcoI 及 BamHI 双酶切重组质粒 pMD18T-LTB-Linker_P印I 及pMD18T-LTB-Linker-P印2，将目的片段连接至经同样双酶切的表达载体pET22b，构建表达重组质粒 pET22b-LTB-Linker-P印 I 及 pET22b-LTB-Linker_P印2。 17 表达重组质粒 pET22b-LTB-Linker-P印 I 及 pET22b-LTB-Linker_P印2 转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)，构建表达重组工程菌pET22b-LTB-Linker_P印 1/E. coli BL21 (DE3)及 pET22b-LTB-Linker-P印2/E.coli BL21 (DE3)。18表达重组工程菌发酵，取其超声破菌上清进行纯化以获得目的蛋白LTB—Linker—PepI 及 LTB—Linker—Pep2。19LTB-Linker-PepI免疫SD大鼠，Elisa法测定抗体滴度，并检测免疫后的大鼠对17肽胃泌素的胃酸分泌抑制作用。20LTB-Linker-Pep2 免疫 C57BL/6 小鼠，Y 干扰素(IFN- Y )Elispot 法测定其脾脏淋巴细胞中特异CD8+细胞含量。附图lpET22b-LTB-Linker-P印 1/E. coli BL21 (DE3)表达的 SDS-PAGE 图I =LTB-Seql-Pepl (煮)2 =LTB-Seql-Pepl (不煮)3 LTB-Seq2-Pepl (煮)4 LTB-Seq2-Pepl (不煮)5 LTB-Seq3-Pepl (煮)6 LTB-Seq3-Pepl (不煮)7 LTB-Seq4-G-Pepl (煮)8 LTB-Seq4-G-Pepl (不煮)9 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (煮)10 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (不煮)11 LTB-Seq4-Pepl (煮)12 LTB-Seq4-Pepl (不煮)从图中看出，超声上清在煮后在12kD附近有ー浓的目的条带(箭头所示)，而未煮的样品则无，表明在未煮的情况下目的蛋白主要以多聚体形式存在，煮后变为了単体，与LTB的性质吻合。附图2pET22b-LTB-Linker-P印2/E. coli BL21 (DE3)表达的 SDS-PAGE 图I LTB-Seql-Pep2 (煮)2 LTB-Seql-Pep2 (不煮)3 LTB-Seq2-Pep2 (煮)4 LTB-Seq2-Pep2 (不煮)5 LTB-Seq3-Pep2 (煮)6 LTB-Seq3-Pep2 (不煮)7 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (煮) 8 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (不煮)9 =LTB-Seq4-Seq3-P印2 (煮)10 LTB-Seq4-Seq3-Pep2 (不煮)11 LTB-Seq4-Pep2 (煮)12 LTB-Seq4-Pep2 (不煮)从图中看出，超声上清在煮后在12kD附近有ー浓的目的条带(箭头所示)，而未煮的样品则无，表明在未煮的情况下目的蛋白主要以多聚体形式存在，煮后变为了単体，与LTB的性质吻合。附图3 纯化后 LTB-Linker-P印I 的 SDS-PAGEI :LTB-Seql_ (不煮)2 =LTB-Seql-Pepl (煮)M :蛋白质分子量标准3 LTB-Seq2-Pepl (不煮)4 LTB-Seq2-Pepl (煮)5 LTB-Seq3-Pepl (不煮)6 :LTB_Seq3_Pepl (煮)7 LTB-Seq4-G-Pepl (不煮)8 LTB-Seq4-G-Pepl (煮)9 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (不煮)10 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (煮)11 LTB-Seq4-Pepl (不煮)12 LTB-Seq4-Pepl (煮)从图看出，纯化的工程菌表达的目的蛋白在未煮的情况下以五聚体的形式存在，在煮后以单体形式存在，与LTB的性质一致。附图4 纯化后 LTB-Linker-P印2 的 SDS-PAGEM :蛋白质分子量标准I LTB-Seql-Pep2 (煮)2 LTB-Seql-Pep2 (不煮)3 LTB-Seq2-Pep2 (煮)4 LTB-Seq2-Pep2 (不煮)5 LTB-Seq3-Pep2 (煮)6 LTB-Seq3-Pep2 (不煮)
7 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (煮)8 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (不煮)9 LTB-Seq4-Seq3-Pep2 (煮)10 =LTB-Seq4-Seq3-P印2 (不煮)11 LTB-Seq4-Pep2 (煮)12 LTB-Seq4-Pep2 (不煮)从图看出，纯化的工程菌表达的目的蛋白在未煮的情况下以五聚体的形式存在，在煮后以单体形式存在，与LTB的性质一致。附图5不同免疫组动物的累积泌酸量由图看出免疫LTB-Linker-P印I后，大鼠胃酸分泌量显著减少P < 0.01。说明LTB-Linker-Pepl免疫后，大鼠体内产生了抗胃泌素抗体，中和了胃泌素的泌酸作用。附图6LTB-Linker-Pepl四次免疫大鼠后(每次100 μ g，间隔3周免疫一次)，血清稀释至100倍时的抗体滴度。由图看出免疫了 LTB-Linker-P印I的大鼠产生了特异抗G17抗体。附图7小鼠免疫LTB-Linker-P印2后，脾淋巴细胞中⑶8+细胞的形成。由图看出免疫了 LTB-Linker-P印2后，小鼠脾脏淋巴细胞中抗原特异性的CD8+淋巴细胞显著増加，表明复合物能显著增强表位递呈。

实施例3, LTB-Linker-Pep I 及 LTB-Linker_Pep2 的表达。重组工程菌pET22b-LTB-Linker-Pepl/E. coli BL21 (DE3)及pET22b-LTB-Linker-Pep2/E. coliBL21 (DE3)分别进行IL发酵表达，加入IPTG至终浓度为O. lmmol/L，在18°C诱导表达过夜。表达结果分别见附图I及附图2。实施例4, LTB-Linker-Pep I 及 LTB-Linker_Pep2 的纯化离心收取发酵细菌，用TF,AN(20mmo1 /T, Tris, 2mmol/L EDTA,3mmol Na3N,300mmol/LNaCl, pH 8.0)重悬，超声破菌，离心收取上清。将上清上经TEAN平衡的固相化半乳糖柱(Immobilised D-glactose),用TEAN复平衡,用含O. 3mmol/L半乳糖的TEAN洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。纯化的LTB-Linker-P印I 及 LTB-Linker-P印2SDS-PAGE 分别见附图 3 及附图 4。实施例6，LTB-Linker-Pepl的免疫原性与生物活性测定(I)动物免疫8-10周龄雌性SD大鼠皮下免疫七组(4只/组)分别用含LTB100 μ g的 200 μ L PBS (pH7. 4)，含 LTB-Linker-P印 1100 μ g 的 200 μ L PBS (ρΗ7. 4)进行皮下多点免疫。间隔三3周免疫一次，总共免疫4次。第四次免疫后10天进行胃泌酸实验。(2)急性胃瘘泌酸实验动物实验前禁食不禁水24小时；戊巴比妥钠麻醉；分离胃，结扎幽门端；胃上插入导管；用35°C生理盐水洗去胃内容物。动物保温半小时后尾静脉注射50μ!7只(200yg/mL)的大鼠胃泌素(IOOng/只)；注射后结扎贲门端；收集导管流出的胃液，45分钟后取胃，0. 9% NaCl溶液0. 5mL冲洗胃内分泌物，碱滴定測定计算胃酸总量。结果见附图5。(3)Elisa法測定特异抗体用大鼠十七肽胃泌素包被96孔板，将进行胃泌酸实验当天采集的耦联蛋白免疫组与PBS对照组动物血清均稀释至100倍作一杭，山羊抗大鼠IgG-HRP作ニ抗，OPD作底物显示，读取492nm处光吸收值，用表位疫苗免疫组读数减去对照组读数作图见附图6。
实施例7，LTB-Linker-P印2的免疫原性与生物活性测定(I)动物免疫6周龄雌性C57BL/6小鼠皮下免疫八组(4只/组)分别用100 μ L PBS (ρΗ7· 4)、含 LTB50 μ g 的 100 μ L PBS (ρΗ7· 4)，含 LTB-Linker-P印250 μ g 的100 μ LPBS (ρΗ7. 4)进行皮下多点免疫。间隔2周免疫一次，总共免疫3次。(2)Elispot :最后一次免疫后10天处死动物，无菌条件下取脾脏，研磨、过滤得到脾细胞，用红细胞裂解液去除红细胞后，脾淋巴细胞用淋巴细胞培养液清洗及重悬至浓度为2X107cells/mL。Elispot检测用BD公司的Y干扰素(IFN-Y )Elispot试剂盒參照厂家指示进行。Elispot板以用PBS稀释到终浓度为5 μ g/ml抗鼠IFN- Y抗体在4°C包被过夜，R-10洗涤一次，然后用R-10封闭2小吋。每孔加入2. 5X IO5脾淋巴细胞，加入或不加入表位肽在37°C，5% CO2刺激16小时，用去离子水5分钟裂解2次。用含0. 05% Tween-20的PBS洗孔三次。用含2% FCS PBS稀释生物素化的抗IFN- Y抗体至终浓度2 μ g/ml，加入孔内孵育2小时，用含0. 005% Tween-20的PBS洗板3次，然后用含2% FCS的PBS溶解的浓度为50mg/ml的亲合素耦联辣根过氧物酶孵育。用含0. 005% Tween-20的PBS洗板4次,PBS洗板2次,用AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole (Sigma))底物溶液孵育。底物溶液配制AEC 用ニ甲基甲醒(Dimethyl formaldehyde)溶至 10mg/ml,其后用含 0. 005% H2O2的0. IM醋酸盐缓冲液(148ml 0. 2M醋酸和352ml 0. 2M醋酸钠加水至IL pH 5. 0)稀释至O. 333mg/ml。5-10分钟后，用自来水洗板，晾干，读取斑点数(SFU)。有抗原刺激组为无抗原组斑点数4倍以上，背景不多于100SFU/106即为阳性。结果见附图7。SEQUENCE LISTING〈110〉冯强Feng, Qiang<120>以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位为载体的表位递送系统<130>a<140>a<141>2011-03-05<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>3<212>PRT〈213〉人工合成<400>1Gly Pro GlyI<210>2<211>4<212>PRT〈213〉人工合成<400>2Gly Ser Gly SerI<210>3<211>5<212>PRT〈213〉人工合成<400>3Gly Gly Gly Ser SerI5<210>4<211>6<212>PRT〈213〉人工合成<400>4Tyr Ala Pro Val Asp ValI

本发明涉及一种抗原表位递送系统的的设计技术及制备纯化技术，涉及该系统在表位疫苗研制中的应用。本发明的特征在于将大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与特定的连接肽通过DNA重组技术连接起来，再将相应的B淋巴细胞表位或T淋巴细胞表位连于其后。实验表明，本发明的表位递送系统携带B淋巴细胞表位能有效促使动物产生针对该表位的抗体；而携带的T淋巴细胞表位则能有效促使动物产生针对该表位的CD8淋巴细胞。这提示所发明的抗原表位递送系统可在表位疫苗的研制中发挥重要作用。