专利名称：膜定位葡萄球菌肠毒素a及其基因序列的制作方法超抗原(superantigen，SAg)是Janice White等在1989年研究了金黄色葡萄球菌肠毒素Staphylococcal enterotoxin, SE)对T淋巴细胞具有很强的刺激作用后提出的免疫学新概念。目前报道的可用于临床抗肿瘤作用的SAg只有SE，而SE是由金黄色葡萄球菌分泌的一组具有超抗原活性的细菌毒素，SE是目前已知的人淋巴细胞最强的刺激剂和最有力的细胞因子诱生剂。是第一个被发现的超抗原，也是目前研究最多、临床使用最为广泛的SAg。SE主要包括有金黄色葡萄球菌肠毒素A (SEA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B (SEB)、金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)。尽管超抗原具有强大的诱生抗肿瘤效应，但目前只有个别超抗原进入临床试验阶段，主要原因是超抗原对机体的毒副作用较大。仅需极微量(1 IOng/ mL)的超抗原就可以激活大量T细胞，分泌多种足量的细胞因子，使机体免疫调节紊乱，导致一些急性和慢性疾病的发生，如毒素中毒综合征(高热、皮疹和休克)、自身免疫性疾病 (风湿性关节炎、风湿热、川奇病和非特异性皮炎)等。同时，超抗原诱发的超抗原依赖的细胞介导白勺细胞毒作用(Superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity, SDCC)对表达MHC II类分子的正常细胞具有很强的杀伤作用。因此不解决SEA对机体的毒副作用， SEA就难以进入临床应用。
针对以上提出的问题，本发明的目的在于，构建一种膜定位葡萄球菌肠毒素 A(SEAtm)基因，所表达的膜定位葡萄球菌肠毒素A能够有效地定位于细胞膜表面。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案本发明一方面涉及一种膜定位葡萄球菌肠毒素A(SEAtm)，所述膜定位葡萄球菌肠毒素A含有如下氨基酸序列的片段METDTLLLWVLLLWVPGSTGDSEKSEEINEKDLRKKSELQGTALGNLKQIYYYNEKAKTENKESHDQFLQHTILFKGFFTDHSWYNDLLVDFDSKDIVDKYKGKKVDLYGAYYGYQCA
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KVQRGLIVFHTSTEPSVNYDLFGAQGQYSNTLLRIYRDNKTINSENMHIDIYLYTSGSGGGGSGGGGSGGGGSDNLLPSffAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV。本发明另一方面还涉及一种膜定位葡萄糖菌肠毒素A的基因，其含有如下基因序列0 GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT60 CCACTGGTGACAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTG120 AATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTA180 AAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCT240 TTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTG300 TTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTG360 CGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATA420 ATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATA
480 CAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATC540 TTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATG600 GGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACG660 ATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATA720 AAACGATTAACTCTGAAAACATGCATATTGATATATATTTATATACAAGTGGATCCGGTG780 GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCCT840 GGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCT900 TTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCC960 CTGTATAAAGATCTGC本发明另外一方面还涉及一种载体或质粒，其特征在于上述基因片段。本发明还涉及上述载体或质粒在细菌、生物体内所表达的产物。本发明另外一方面还涉及构建构建载体的方法，其特征在于包括如下步骤1、扩增葡萄糖菌肠毒素A基因全长片段；2、扩增 CD80 基因；3、使用中性linker将SEA和CD80跨膜区序列融合；4、将融合的片段克隆到载体中。在本发明的一个优选实施例中，上述载体构建方法所使用的中性linker片段为 GGGGSGGGGSGGGGS。在本发明的一个优选实施例中，上述序列融合优选采用重叠引物进行融合。在本发明的一个优选实施例中，融合时所使用的重叠引物为SEA-Forward GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCAT TTAC ；
SEA-Reverse GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT ；CD80-Reverse CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT ；CD80-Forwardl GGTGG CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC ；CD80-Forward2 CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT。本发明还涉及膜定位葡萄糖菌肠毒素A和/或其基因片段在制备抗肿瘤药物中的应用。 本发明的膜定位葡萄球菌肠毒素A具有以下优点SEAtm 一方面能够使表达的SEA 有效的锚定与细胞表面，充分发挥超抗原的作用，另一方面可以大大地降低SEA的毒性和免疫耐受现象的出现。转染的pIRES2-SEAtm质粒能够在细胞中高效表达，同时利用免疫荧光技术检测到SEAtm，能够定位到细胞表面。


图1 左侧图免疫荧光技术检SEAtm，显示其特意的定位于细胞表面；中间图转染到细胞中的pIRES2-EGFP-SEAtm中绿色荧光蛋白发出的荧光，证明细胞中本质粒成功转染；右侧图使用染核的染料复染细胞，并将不同激发波长下的图片重叠，即可看到膜定位的SEAtm，复染的细胞核，以及细胞整体发出的EGFP绿色荧光。



本发明公开了一种膜定位葡萄球菌肠毒素A(SEAtm)及其基因序列，该膜定位葡萄球菌肠毒素A一方面能够使表达的SEA有效的锚定与细胞表面，充分发挥超抗原的作用，另一方面可以大大地降低SEA的毒性和免疫耐受现象的出现，提高了其在抗肿瘤中的临床应用价值。