专利名称：器官冷藏组合物的制作方法器官移植广泛用于以下器官，如心脏、肺、胰脏、肠(结肠)以及，特别地，肾和肝。对器官不断增长的需求和供体不足导致等待队列增加和使用次优的供体的器官的更大需求。·获得的移植用的器官必须储存并从一个医院运输到另一个医院。需要时间来测试在供体和受体之间的组织相容性，并为受体患者做好准备。器官和组织可以在体外保存的时期根据所述器官、供体年龄以及健康状况、保存方法和温度的不同而不同。目前，用于临床实践以延长捐赠器官的生存能力的标准技术是通过特殊的保藏液来冷冻贮存或冷藏。这些溶液用于第一阶段，在分离之前，用于器官的灌注(清洗)以移除并替换供体的血液，同时将器官冷却到4°C。在第二阶段，用冷藏溶液储存和维持分离的器官，同时直到移植，一直维持在低温(大约4°C )下。冷藏的目的在于通过抑制代谢来保存器官，其次防止并使冷却局部缺血可能导致的变化减到最小。Maathuis 等(Transplantation, 2007; 83:1289-1298)提供对于冷藏溶液的最近综述，其公开了一般要求、以及组合物及其多种性能，例如Euro-C011 ins溶液(EC)、Marshall’ s高渗朽1檬酸盐溶液(HOC)、鹿糖磷酸缓冲液、威斯康星大学(University ofWisconsin)溶液(UW)、组氨酸-色氨酸-酮戊二酸(HTK)溶液、Celsior溶液(CEL)、乔治 洛佩兹学院溶液(IGL-1)。该文献还公开了现有这些溶液中的一些对于肾脏(Ahmadet al. Kidney International2006;69:884-893)、心脏(Michel etal. J. Heart LungTransplant 2002;21:1030-1039)> 肝脏(El-Wahsh M. Hepatobiliary Pancreat DisInt2007;6:12-16)和肠(Wei et al. Gastroenterology 2007; 13:3684-3691)的保存的效力的比较研究。最常用的冷藏溶液是UW溶液，特别是用于肝脏和肾脏；Celsior溶液用于心脏保存；并且Euro-Collins或者Perfadex用于肺保存。就灌注机器来说，这些已经改进，例如对于UW-葡糖酸盐(Belzer MPS)。US 4798824公开了一种冷藏溶液，其包含葡糖酸盐和羟乙基淀粉。US 4879283公开了威斯康星大学溶液(UW或者Belzer溶液)，其包含下列不同组分作为非渗透剂以减少细胞膨胀的乳糖醛酸盐和棉子糖；和避免浮肿的羟乙基淀粉。然而，带有现在的保藏液的冷藏存在明显的局限性。由冷藏引起的组织损伤和炎症反应可能提高免疫原性并引发器官的排异反应。因此，例如在具有排斥反应的肾移植的试验模型中，冷却局部缺血促使由肾衰竭和加速的急性排斥反应导致的死亡率增加(Salahudeen AK. Am JPhysiol Renal Physiol. 2004;287:F181-F187 ；Herrero-Fresnedaet al. Transplant Proc.2005;37:3712-3715)。冷却局部缺血与渗透压调节、能量代谢和需氧代谢的改变有关。Na-K-ATP酶活性和ATP水平的下降允许胞内的钠和水的积累，从而引起细胞膨胀。同样地，通过葡萄糖代谢产生的乳酸导致溶酶体不稳定和线粒体功能改变，引起细胞膨胀，激活线粒体细胞凋亡途径并产生自由基。另一方面，一旦已经进行移植，就会增加由器官的再灌注引发的新的损害，其可能由于它已经受到冷却局部缺血而更敏感。该损害过程包括活性氧自由基、炎症反应和细胞溶质钙的增加，以及蛋白水解酶，例如半胱天冬酶的活化。因此，现有技术中需要提供合适的器官冷藏组合物，以使减少与冷却局部缺血和冷却保存的器官的移植后再灌注有关的损害成为可能。发明简述本发明的第一方面涉及一种器官冷藏组合物，其共同地或者独立地包含， (i)心肌营养素-1 (CT-1)或者其功能等效变体，和(ii)器官冷藏溶液。本发明的另一方面涉及一种器官冷藏组合物的制备方法，其包含将心肌营养素-1或者其功能等效变体添加到器官冷藏溶液中。本发明的另一方面涉及心肌营养素-1或者其功能等效变体用于制备移植用的器官的冷却保护和/或保存组合物的用途。本发明的又一方面涉及根据本发明的用于移植用的器官的冷却保护和/或保存的组合物的用途。本发明的另一方面涉及根据本发明的用于移植用的器官的冷却保护和/或保存的器官冷藏组合物。本发明的另一方面还涉及一种用于器官冷藏的方法，其包含使所述器官与根据本发明的组合物相接触。本发明的另一方面涉及一种通过本发明的方法获得的冷却保存的离体器官。本发明的最终方面涉及一种设计用于制备器官冷藏组合物的试剂盒，其包含(i)心肌营养素-1或者其功能等效变体；和(ii)器官冷藏溶液或者，可选择地，用于制备所述溶液的介质和添加剂。图1. Euro-Collins 溶液(EC)和含有 0. lmg/L 的 CT-1 (EC[C Tl])的 Euro-Collins溶液对威斯塔大鼠的肾脏在用小时表示的不同的时期(t)的冷藏效果(4°C)的比较研究。还包括模拟的大鼠组(Sim)。n=每组5只动物。A)超氧阴离子自由基(SOA)的肾水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。B)肿瘤坏死因子a (TNF a )的肾水平，以pg/mL表示。C)可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)的肾水平，以任意单位表示。D)由肾的IkB (IkB)的水平检测的NFk B转录因子的活化，以任意单位表示。图2.威斯康星大学溶液(UW)和具有0. lmg/L的CT_1 (Uff[CTl])的威斯康星大学溶液对威斯塔大鼠的肾脏在用小时表示的不同的时期(t)的冷藏效果(4°C)的比较研究。还包括模拟的大鼠组(Sim)。n=每组5只动物。A)超氧阴离子自由基(SOA)的肾水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。B)肿瘤坏死因子a (TNF a )的肾水平，以pg/mL表示。C)可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)的肾水平，以任意单位表示。D)由肾的IkB (IkB)的水平检测的NFk B转录因子的活化，以任意单位表示。图3.威斯康星大学溶液(UW)和具有0. 2mg/L的CT_1 (Uff[CTl])的威斯康星大学溶液对威斯塔大鼠的肾脏在不同保存时期(t) 30分钟(30’)、6小时、24小时和48小时的冷藏效果(4°C)的比较研究。还包括模拟的鼠组(Sim)。n=每组5只动物。A)超氧阴离子(SOA)的肾水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。B)肿瘤坏死因子a (TNFa )的肾水平，以pg/mL表示。C)可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)的肾水平，以任意单位表示。D)转录因子的活化。P65蛋白质或肾NFk B (NF k B)的水平，以任意单位表示。E) Ser311-磷酸化P65蛋白质(pNFk B)的肾水平。F) VCAM-1血管的粘着分子(VCAM-1)的肾水平。图4.使用包含0. lmg/L的CT-1的UW溶液(UW[CT1])，并以威斯康星大学溶液(Uff)作为对照，在鼠中同源并正位的肾移植的实验模型中对冷藏肾的影响的研究。对于不同组的预置再灌注时间以天t计(d)分别是1、3、7和14。还包括模 拟的大鼠组(Sim)。每组n>15个移植。A)存活率，表示为活的鼠相对于总数的％。B )肌酸酐(CREAT)的血清浓度水平，以mg/dl表示。C)肌酐清除水平(CRCL)，以相对单位表示。D)超氧阴离子自由基(SOA)的肾水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。E)肿瘤坏死因子a (TNFa )的肾水平，以Pg/mL表示。F)白细胞介素-6 (IL-6)的肾水平，以pg/ml表示。G)由肾的IkB (IkB)的水平检测的NF K B转录因子的活化，以任意单位表示。H) ICAM-1粘着分子(sICAM-1)的可溶形式的水平。I) VCAM-1粘着分子(sVCAM-1)的可溶形式的水平。图5.威斯康星大学溶液(S/CT-1)和含有0. 2mg/L的CT-1 (C/CT-1)的威斯康星大学溶液对威斯塔大鼠的肺在用小时表示不同的时期的冷藏效果(4°C)的比较研究。n=每组5只动物。A)可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)组织水平，以任意单位表示。对于组0，有或者没有CT-l，*p〈0. 05。B)P65*NFkB (p65NF k B)蛋白质组织水平，以任意单位表示。对于组0，有或者没有CT-1，*p〈0. 05。C)由Ser311-磷酸化p65蛋白质(pNFk B)的组织水平检测的NF K B转录因子的活化，以任意单位表示。对于组0，有或者没有CT-1，以及对于含有CT-1的组48，*p〈0. 05。D)超氧阴离子(SOA)自由基组织水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。对于组O、24小时和48小时，含有CT-1以及对于组0没有CT-1，*p〈0. 05。图6.威斯康星大学溶液(S/CT-1)和含有0. 2mg/L的CT-1(C/CT-1)的威斯康星大学溶液对威斯塔大鼠的心脏在用小时表示不同的时期的冷藏效果(4°C)的比较研究。n=每组5只动物。A)可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)组织水平，以任意单位表示。B)由P65NFk B组织水平检测的NF K B转录因子的活化，以任意单位表示。C)微管蛋白-校准的可溶解的ICAM-1粘着分子(sICAM-1)组织水平，以任意单位表示。D)超氧阴离子(SOA)自由基组织水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。对于组0，24和48小时，含有CT-1，以及对于组0，没有CT-1，*p〈0. 05。对于组0，24和48小时，含有CT-1，以及对于组0，没有CT-1，p〈0. 05。 图7.威斯康星大学溶液(S/CT-1)和含有0. 2mg/L的CT_1 (C/CT-1)的威斯康星大学溶液对威斯塔大鼠的肺-心传导阻滞在以小时表示不同的时期的冷藏效果(4°C)对于以pg/mL表示的保存液中的肿瘤坏死因子- a (TNFa )浓度的比较研究。n=每组5只动物。图8.以仅在保藏液(P)、仅在冲洗液(W)或在保存和冲洗液(P+W)的包含0. 2mg/L的CT-1的威斯康星大学(UW)溶液对威斯塔大鼠的肾的24和48小时的冷藏(4°C)效果的比较研究。n=每组5只动物。A)和G):分别在24和48小时的超氧阴离子(SOA)自由基肾水平，以nmol/mg蛋白质/分钟表示。B)和H):分别在24和48小时的保存液中的肿瘤坏死因子a (TNFa )浓度，以pg/mL表示。C)和I):分别在24和48小时的微管蛋白-校准的可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)肾水平，以任意单位表示。D)和J):分别在24和48小时的微管蛋白-校准的可溶解的ICAM-1粘着分子(ICAM-1)肾水平，以任意单位表示。E)和K):分别在24和48小时测量的微管蛋白-校准的NFk B转录因子的肾活化作为I k B(IkB)组织水平，以任意单位表示。F)和L):分别在24和48小时测量的肾NF k B转录因子的活化作为微管蛋白-校准的Ser311-磷酸化p65蛋白质(phosphop65)组织水平，以任意单位表示。任意单位(AU)。发明详述本发明的作者意外地观察到将心肌营养素-1 (CT-1)添加到器官冷藏溶液中则有可能获得合适的器官冷藏组合物，(尤其对于肾、肺和心脏)，其减少所述器官的与冷却局部缺血和移植后的再灌注相关的损伤。所述效果根据本发明的组合物的能力以 通过减少氧自由基的产生，降低引起的氧化应激(图1A，2A, 5D和6D);通过阻止促炎性信号转导途径(NFk B)的活化(图1D和2D)、减少减少炎症性细胞因子(TNFa、iN0S、IL-6)(图 1B_C、2B_C、4F、5A 和 7)和促炎性粘着分子(VCAM-1、ICAM-1)(图3F和4H-1)的产生，降低炎症反应的活化。本发明的另一目的在于提供移植用的适当的器官冷藏组合物，其提高了固体器官移植的可行性和存活率。本发明的作者还证明了本发明的组合物适于冷藏移植用的肾脏，由于它们阻止由局部缺血-再灌注所引起的肾小管坏死，从而改进肾功能(减少肌酸酐的血清水平并增加肌酐清除率)和存活率(图4)。本发明的组合物因此，本发明的第一方面涉及一种器官冷藏组合物，其共同地或单独地包含(i)心肌营养素-1或者其功能等效变体和(ii)器官冷藏溶液。如在本文中使用的，术语“器官冷藏组合物”或“用于冷藏器官的组合物”涉及一种液体组合物，优选为无菌的，其包含心肌营养素-1 (或其功能等效变体)和器官冷藏溶液。在所述组合物中，CT-1 (或其功能等效变体)可以分散在器官冷藏溶液中，其构成用于组合使用的单独的制剂。可选地，也考虑了这种可能，即本发明的组合物包括独立配制的两种组分，(i )和(ii )，在这种情况下在其施用之前必须混合。根据本发明的组合物是适用于器官冷藏的组合物。“器官冷藏”应理解为是指低温条件下保藏、保护、保存和/或储存器官的能力，通过使用产生抑制代谢并阻止或抵消器官中冷却局部缺血可能导致的变化的试剂，使所述器官的细胞损伤最小化。在本发明中，心肌营养素-1和器官冷藏溶液是适用于器官冷藏的试剂。如在本发明中使用的，术语“心肌营养素-1”或“CT-1”涉及一种属于白细胞介素-6家族的细胞因子，其能结合并活化至少通过由gpl30/LIFRP异质二聚体组成的LIFR受体复合体介导的信号转导。在本发明中，“CT-1”应理解为是指由NCBI数据库中登陆号为NP_001321.1的序列定义的蛋白质，其相应于序列SEQ ID NO :1，对应于人心肌营养素的同工型I ;或由NCBI数据库登陆号为NP_001136016.1的序列定义的蛋白质，对应于人心肌营养素的同工型2。在优选实施例中，CT-1是来源于人的CT-1，优选地具有序列SEQ ID NO:1oSEQ ID NO 1MSRREGSLED PQTDSSVSLL PHLEAKIRQT HSLAHLLTKY AEQLLQEYVQ LQGDPFGLPS 60FSPPRLPVAG LSAPAPSHAG LPVHERLRLD AAALMLPPL LDAVCRRQAE LNPRAPRLLR 120RLEDAARQAR ALGAAVEALL MLGAANRGP RAEPPAATAS AASATGVFPA KVLGLRVCGL 180YREffLSRTEG DLGQLLPGGS A201本发明考虑了 CT-1的功能等效变体的用途。如在本文使用的，“CT-1功能等效变 体”应理解为任何分子，所述分子共享一个或多个在本发明中描述的与CT-1相关的功能，体外和体内，并展现氨基酸序列的最小同一性。CT-1的变体可以是自然的或人造的。表述“自然变体”涉及所有上述的人的CT-1的变体，其自然地存在于其它物种中，也就是说CT-1的同源基因。所述自然变体包括，非限制性地，鼠CT-1，其相应于NCBI数据库登陆号为Q541U3/Q60753的序列或196-氨基酸同工型，其相应于NCBI数据库登陆号为P83714的序列；大鼠CT-1，其相应于登陆号为Q63086的序列；猕猴CT-1，其相应于登陆号为XP_001103315的预测序列；犬CT-1，其相应于登陆号为XP_849072的预测序列；马CT-1，其相应于登陆号为XP_001915457的预测序列；牛来源的CT-1，其相应于登陆号为XP_592709的预测序列；以及黑猩猩CT-1，其相应于登陆号为XP_592709的预测序列。适用于本发明的CT-1的自然变体也可以衍生自通过插入、替换或缺失一个或多个氨基酸形成的所述序列，并包括自然的等位基因(例如人CT-1的变体A92T)，由替换的方法得到的变体，和自然地呈现出的分泌的和去尾的形式的变体。因此，当包括具有与衍生于自然的CT-1相同的氨基酸序列的多肽时，用于本发明的CT-1可以具有自然的序列。该自然序列多肽可以从自然中分离或者通过重组和/或合成的方法制备。因而，本发明的CT-1可以是通过编码CT-1或其功能等效变体的多核苷酸在异源生物体中的表达获得重组蛋白质，所述异源生物体例如细菌、酵母或昆虫或哺乳动物细胞。所述重组蛋白质能够以具有便于其随后纯化的氨基末端组氨酸尾部的融合蛋白形式获得。可以根据本领域技术人员已知的并由现有技术中所描述的方法进行所述蛋白质的表达和纯化。在优选的实施例中，CT-1是人源的，并对应于序列SEQ ID NO :1。在另一优选的实施例中，CT-1来源于大鼠，优选是具有氨基末端组氨酸尾部的融合蛋白，更优选SEQ ID NO2。SEQ ID NO:2MRGSHHHHHH GMASMTGGQQ MGRDLYDDDD KDRffGSMSQR EGSLEDHQTDSSFSFLPHLE 60AKIRQTHNLA RLLTKYADQL LEEYVQQQGE PFGLPGFSPP RLPLAGLSGP APSHAGLPVS 120ERLRQDAAAL SALPALLDAV RRRQAELNPR APRLLRSLED AARQVRALGA AVETVLAALG 180AAARGPVPEP VATSALFTSN SAAGVFSAKV LGLHVCGLYG EWVSRTE⑶L GQLVPGGVA 239
可选择地，CT-1可以是通过重组和/或合成的方法获得的CT-1人造的功能等效变体。本发明中考虑的CT-1的变体至少展现CT-1的一个功能，例如，非限制性地-减少氧自由基的产生的能力，其可以由现有技术中所描述的方法来测定，如在本发明的材料和方法部分所示。-阻止促炎性信号转导途径(NFkB)的能力，其可以由蛋白质印迹来测定，如在本发明的材料和方法部分所示。-减少炎症性细胞因子(TNFa、iNOS、IL-6)的产生的能力，其可以由在本发明的材料和方法部分中所描述的方法来测定。
-减少促炎性粘着分子(VCAM-1、ICAM-1)的产生的能力，其可以由蛋白质印迹来测定，如在本发明的材料和方法部分所描述的。-减少组织损伤并因此保护肾功能的能力，其通过血清肌酐(其不增加)的水平和肌酐清除率(其不降低)来测定。在本发明的材料和方法部分描述了合适的测定这些参数的方法。此外，在本发明范围内考虑的CT-1的功能等效变体包括多肽，其显示出与上述不同的 CT-1 的自然变体具有至少 60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、95%、97%、99% 的相似性或同一丨I"生。两个多肽之间的同一性程度通过使用本领域技术人员公知的计算机-执行运算法则和方法来测定。两个氨基酸序列之间的同一性优选使用BLASTP运算法则来测定(BLAST Manual, Altschul, S. et al. , NCBI NLMNIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. , etal.，J.，1990, Mol. Biol. 215:403-410)。本发明人发现了根据本发明的组合物的心肌营养素-1的药理学有效浓度。“药理学有效浓度”应理解为是指能够产生一种或多种上述的可归因于CT-1的效果的浓度，并可以基于本说明书中解释的方法通过标准技术来测定。在本发明的优选实施例中，发现心肌营养素-1的浓度范围在0. 001g/L和5. OOOg/L之间;优选地，在0. 005g/L和1. 000g/L之间;更优选地，在0. 010g/L和0. 500g/L之间；甚至更优选地，在0. 08g/L和0. 20g/L之间；以及甚至更优选地在0. lg/L和0. 2g/L之间。在本发明的优选实施例中，发现心肌营养素-1的浓度范围在0. 001mg/L和5. 000mg/L之间；优选地，在0. 005mg/L和1. 000mg/L之间；更优选地，在0. 010mg/L和0. 500mg/L之间；甚至更优选地，在0. 08mg/L和0. 20mg/L之间；以及甚至更优选地在0. lmg/L 和 0. 2mg/L 之间。在本发明中，表述“器官冷藏溶液”或“器官冷保藏液”涉及一种溶液，其适用于在低体温条件下保藏、保存和储存移植用的器官，其包含在冷却局部缺血、同时所述器官等待移植到受体期间使所述器官中产生的损伤减到最小，以及在移植期间使再灌注过程中产生的损伤减到最小的物质。所述溶液通过产生抑制代谢以及防止并使冷却局部缺血本身可能导致的变化减到最小来实现保藏和保存器官的效果。这些器官冷藏溶液在低体温条件下显示它们的保护性能。“低体温条件”应理解为是指在生理学温度以下的温度，在(TC和25°C之间的范围。在本发明的实施例中，本发明所述的器官冷藏溶液和器官冷藏组合物在(TC和25°C之间的温度范围之间；优选地，在(TC和15°C之间；更优选地，在2°C和7°C之间；甚至更优选地，在约4°C。在本发明中，“冷却局部缺血”理解为是指由于低温条件下保存器官，也就是由于器官遭受到低体温条件在器官中引起的组织损伤和炎症反应。在本发明的范围内，术语“再灌注”涉及冷却局部缺血一段时间后再次建立器官中的血流。在本发明中，“抑制代谢”理解为是指停止或减少所述器官的代谢活动与功能至最小值的行为。所述器官冷藏溶液和由此延伸的本发明的组合物使保存任何种类的固体器官成为可能，例如，但不限于，哺乳动物(灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫、啮齿类、兔子等等)、鸟，但优选人源器官，例如心脏、肺、胰脏、小肠、结肠、肾脏。这些器官可以来自活的供体或来自尸体。在本发明范围内，所述器官冷藏溶液和由此延伸的本发明的组合物尤其适于移植用的肾脏的冷藏。 典型地，所述器官冷藏溶液包括(a)至少一种缓冲剂，(b)至少一种非渗透剂；和(C)至少一种电解质在优选的实施例中，所述器官冷藏溶液的pH值为6. 5至8. 5，并且克分子渗透压浓度范围在300和410m0sm/L之间，两个参数都是在20°C时测定的。在本发明范围内，“缓冲剂”应理解为是指一种试剂，其能够控制溶液的pH，从而阻止可能促使局部缺血损伤到器官的严重的酸中毒。对于本发明的合适的缓冲剂为磷酸盐(一元的和二元的)、碳酸氢盐、硫酸盐、组氨酸、组氨酸-HC1、HEPES、柠檬酸盐及其组合。在特别的实施例中，所述器官冷藏溶液包括缓冲剂，其选自由磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、组氨酸、组氨酸_HC1、HEPES、柠檬酸盐及其组合所形成的组。在本发明的优选实施例中，所述保藏液包括作为缓冲剂的一元的磷酸盐和/或二元的磷酸盐和/或组氨酸-HCl。术语“非渗透剂(impermeating agent)” 和“非渗透剂(impermeabiIisingagent)”在本发明中可交换使用，并涉及具有渗透能力和相对细胞膜不渗透的试剂，其能通过阻止细胞内的水进入来保持细胞外的张力，从而阻止和/或减少细胞的膨胀。对于本发明的合适的非渗透剂为组氨酸、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡糖酸盐、柠檬酸盐、乳糖醛酸盐、棉子糖及其组合，例如乳糖醛酸盐和棉子糖的组合；乳糖醛酸盐和甘露糖醇的组合；海藻糖和葡糖酸盐的组合；葡糖酸盐和葡萄糖的组合；葡糖酸盐和棉子糖的组合；甘露糖醇和柠檬酸盐的组合；甘露糖醇和组氨酸的组合；乳糖醛酸盐、甘露糖醇和组氨酸的组合。在本发明的特别实施例中，所述器官冷藏溶液包括非渗透剂，其选自由组氨酸、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡糖酸盐、柠檬酸盐、乳糖醛酸盐、棉子糖及其组合所形成的组；优选地，选自由乳糖醛酸盐、棉子糖、甘露糖醇及其组合所形成的组；更优选地，该非渗透剂包括乳糖醛酸盐和甘露糖醇；甚至更优选地，该非渗透剂包括乳糖醛酸盐和棉子糖；最优选地，该非渗透剂包括乳糖醛酸盐。在更优选的实施例中，所述器官冷藏溶液包括非渗透剂，其选自由乳糖醛酸盐、棉子糖及两者的组合所形成的组。“电解质”应理解为任何包含自由离子的物质，通常离子在溶液中，其表现为电导体介质。用于本发明的合适的电解质为钠、钾、镁、钙、氯化物及其组合。在本发明的特别实施例中，所述器官冷藏溶液包括电解质，其选自由钠、钾、镁、钙、氯化物及其组合所形成的组。在本发明的另一优选实施例中，所述器官冷藏溶液包括作为非渗透剂的葡萄糖，并且，优选地，冷藏溶液为Euro-Collins溶液(EC)。如在本发明中使用的，表述"Euro-Collins溶液”涉及一种细胞内的器官冷藏溶液，其包括高浓度的葡萄糖和钾，以及低浓度的钠。G.M. Collins 在 1969 年(Collins GM et al.，1969，Lancet, 2:1219)最初公开了所述 Euro-Collins 溶液,并且 Eurotransplant Foundation 在 1976 年(AnnualReportEurotransplant International Foundation. Leiden, The Netherlands:EurotransplantInternational Foundation, 1976)通过除去续进行改进，并且所述Euro-Collins溶液包含葡萄糖作为非渗透剂；氯、钾和钠作为电解质；以及K2HP04、KH2P04和NaHCO3作为缓冲剂。Euro-Collins溶液的典型的组合物可以如下195mM葡萄糖、15mM K2HPO4,43mM KH2PO4UOniMNaHC03、15mM氯化物、115mM钾和IOmM钠。然而，所述组合物可以不同；因此，在本发明范围·内，Euro-col I ins溶液将被认为是任何列于文献中或者市售的此名称的溶液。在本发明的特别实施例中，所述器官冷藏溶液是一种溶液，其中该溶液组分(a)选自由磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、组氨酸、组氨酸-HC1、HEPES、柠檬酸盐及其组合所形成的组；组分(b)选自由组氨酸、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡糖酸盐、柠檬酸盐、乳糖醛酸盐、棉子糖及其组合所形成的组；和/或组分(c)选自由钠、钾、镁、钙、氯化物及其组合所形成的组。表示本发明的器官冷藏溶液的特征的参数是pH和克分子渗透压浓度。术语“pH”涉及溶液的酸性或碱性测量。在水溶液中pH典型地为0到14，pH低于7的溶液为酸性溶液，pH高于7的溶液为碱性溶液。pH=7表示溶液为中性的，其中所述溶剂为水。使用现有技术中公知的方法，溶液的PH可以通过电位计(或酸碱计)来精确测定以及通过指示器近似测定。由于PH值可能随温度变化，在本发明范围内，pH是在20°C测量的。本发明的冷藏溶液在20°C测量时，pH值在6. 5和8. 5之间；优选地在7. 0和7. 5之间。在本发明范围内，术语“克分子渗透压浓度”是测量溶液中物质的总浓度，定义为每升溶液的溶质的渗透压克分子数目，其显示渗透压的潜在的变化，该变化基于引导溶液进入体内将在细胞内发生。克分子渗透压浓度可以由克分子渗透压重量浓度值来计算，后者通过使用本领域技术人员已知的方法的渗透压力计来测量。由于克分子渗透压浓度依赖温度，在本发明范围内，克分子渗透压浓度是在20°C下计算的。本发明的器官冷藏溶液的克分子渗透压浓度，测量于20°C，在300和41OmOsm/L之间的范围；优选地，在310和390m0sm/L之间；更优选地，在320和360m0sm/L之间。所述器官冷藏溶液可以另外包含其它的组分。在本发明的特别实施例中，所述器官冷藏溶液还包括至少一种胶体试剂、至少一种新陈代谢试剂、至少一种氨基酸、至少一种抗氧化剂、至少一种维生素和/或至少一种抗生素。“胶体试剂”应理解为由许多悬浮在液体中但不溶解于液体的小颗粒形成的物质，并且其不能穿过半透膜；为此，它们用来在再灌注期间阻止胞间隙的膨胀。下列物质，其中，可以纳入胶体试剂的有轻乙基淀粉(又名pentafraction或HES)、聚乙二醇、右旋糖酐和白蛋白。在本发明的优选实施例中，所述胶体试剂为HES。在本发明的另一优选实施例中，所述胶体试剂为聚乙二醇。在另一甚至更优选的实施例中，所述胶体试剂为选自由羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇或两者的组合所形成的组。在本发明范围内，“新陈代谢试剂”或者“新陈代谢物质”应理解为能量前体试剂。“氨基酸”理解为具有氨基和羧基的有机分子。适于纳入本发明的溶液的新陈代谢试剂和氨基酸其中包括，腺苷、谷氨酸盐或谷氨酸、葡萄糖、酮戊二酸、胰岛素、丙酮酸盐、天冬氨酸和色氨酸。“抗氧化剂”应理解为是指氧活性组分的螯合剂，其能够延迟或阻止其它分子的氧化。抗氧化剂其中可以包括，别嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露糖醇、水溶性维生素E、维生素E、色氨酸、a -生育酚和/或抗坏血酸。术语“维生素”涉及一种不能通过人体合成的物质，且其是辅酶的前体，并在生物化学反应中充当催化剂。可以用于本发明的维生素的例子为，非限制性地，抗坏血酸、生物素、泛酸钙、氯化胆碱、肌醇、维生素D、叶酸、甲萘醌、烟酰胺、烟酸、吡哆醛、核黄素、硫胺素、维生素A、维生素B12和维生素E。 “抗生素”应理解为是指由有机体产生的化学物质或其合成的衍生物，其在低浓度杀死或阻止某些敏感的微生物种类的生长。用于本发明的抗生素的例子为，非限制性地，三甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑、青霉素等等。本发明的器官冷藏组合物可以另外包含其它的药学上可接受的组分，也就是说，由联邦的或州政府的管理机构审定的或者包括在美国药典中的，或者另一种通常认可的药典中的，用于动物和更特别地用于人体的组分。这些药学上可接受的组分包括，但不限于，稀释剂、辅佐剂、赋形剂或用于施用组合物的载体。还可以包括抗凝剂，例如肝素。在本发明的优选实施例中，所述组合物还包含肝素钠。如本领域技术人员将理解，有可能获得这些组分的组的多种组合，导致所述器官冷藏溶液具有多个
，它们所有适于移植用的器官冷藏，并尤其适于移植用的肾脏的保存。所述器官冷藏溶液可以通过添加所需组分来临时获得，但是它们也可以是在现有技术中已知的器官冷藏溶液，其中有一些是市场上可买到的。在现有技术中已知的可使用的所述器官冷藏溶液包括，非限制性地，威斯康星大学溶液(UW)(Belzer FO and SouthardJH. Transplantation, 1988;45:673),乔治 洛佩兹学院溶液(IGL-1) (Ben AbdennebiH et al. Transpl Int 2002;15:348), Celsior 溶液(CEL) (Menasche P et al. EurJCardiothorac Surg, 1994;8:207), Kyoto 溶液(ET-Kyoto) (Chen F etal. Yonsei MedJ,2004;45:1107-1114)，Polysol 溶液(Wei L et al. WorldJ Gastroenterol, 2007;13:3684-3691)，布雷特施奈德或者组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液(HTK) (BretschneiderHJ. Thorac Cardiovasc Surg, 1980; 28:295), Marshall ’ s 溶液(HOC 或者高渗梓樣酸盐)(Southard JH, Belzer F0. Annu Rev Medl995;46:235), Euro-Collins 溶液(EC)(Annual Report Eurotransplant International Foundation. Leiden, TheNetherlands:Eurotransplant International Foundation, 1976),鹿糖憐酸盐缓冲液(Lam FT etal. Transplantation, 1989; 47:767), Perfadex 溶液(Miiller C et al. Transplantation,1999;68:1139-43), St. Thomas Hospital 溶液 I 和 2 (STH-1, STH-2) (Michel P et al. JHeart Lung Transplant, 2002; 21:1030-9), Lyon保藏液(LYPS)(Michel P et al. J HeartLungTransplant, 2000; 19:1089-1097)或者 Stanford 溶液(STF) (Michel P etal. J HeartLung Transplant, 2002;21:1030-9)。可选择地，可以使用适于低体温的灌注机器的器官冷藏溶液，例如上述溶液或其改进，举例来说，改进的UW-葡糖酸盐溶液(Belzer MPS)。因而，在本发明的优选实施例中，所述器官冷藏溶液包括乳糖醛酸盐和HES。在另一实施例中，本发明的冷藏溶液包括乳糖醛酸盐和聚乙二醇。在本发明的还一实施例中，所述冷藏溶液包括乳糖醛酸盐、棉子糖和!!ES，并且，特别地，所述溶液为威斯康星大学溶液(UW)。如在本发明中使用的，表述“威斯康星大学溶液(UW)”涉及一种器官冷藏溶液，其包括!ES作为胶体试剂，以及乳糖醛酸盐和棉子糖作为非渗透剂。典型地，威斯康星大学溶液还包含至少一种缓冲剂，例如KH2PO4和至少一种电解质，例如氯化物、硫酸镁、钾和钠。此外，所述溶液的典型的组合物包括抗氧化剂，例如别嘌呤醇和谷胱甘肽，以及添加剂，例如腺苷。具体地讲，由Belzer和Southard开发的威斯康星大学溶液·(Transplantation, 1988;45:673)包括 HES (50g/L)作为胶体试剂，乳糖醛酸盐(IOOmM)和棉子糖(30mM)作为非渗透剂，KH2PO4 (25mM)作为缓冲剂，氯化物(20mM)，硫酸镁(5mM)，钾(120mM)和钠(25mM)作为电解质，别嘌呤醇(ImM)和谷胱甘肽(3mM)作为抗氧化剂，以及腺苷(5mM)作为添加剂。然而，所述溶液的组合物可以不同，并且在现有技术文献(US4879283)和在商业的溶液中都能找到，UW溶液缺乏一些非必要的组分，例如氯离子，或有关具有轻微地可变的浓度的组分。因此，用于本发明的威斯康星大学溶液包括所有那些溶液，即作为威斯康星溶液被商品化的溶液或列于文献目录中的溶液，不管所述组合物是否与由Belzer和Southard描述的溶液匹配。在本发明的另一实施例中，所述本发明的冷藏溶液包括乳糖醛酸盐、棉子糖和聚乙二醇，并且，特别地，所述溶液为乔治 洛佩兹学院溶液(IGL-1)。在本发明的另一实施例中，所述冷藏溶液包括乳糖醛酸盐、棉子糖和甘露糖醇，并且，特别地，所述溶液为Celsior溶液。在本发明的另一实施例中，所述冷藏溶液包括葡糖酸盐、海藻糖和HES，并且，特别地，所述溶液为Kyoto溶液(ET-Kyoto)。在本发明的另一实施例中，所述冷藏溶液包括葡糖酸盐、海藻糖和聚乙二醇，并且，特别地，所述溶液为Polysol溶液。在本发明的另一实施例中，所述冷藏溶液包括组氨酸和甘露糖醇，并且，特别地，所述溶液为布雷特施奈德溶液(HTK，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸)。在本发明的另一实施例中，所述冷藏溶液包括柠檬酸盐和甘露糖醇，并且，特别地，所述溶液为Marshall’s溶液(HOC或高渗柠檬酸盐)。本领域技术人员将理解本发明的组合物可以是由单个组合物形成，其中心肌营养素-1 (CT-1)或其功能等效变体分散在所述器官冷藏溶液中。然而，本发明认为两种组分是以“试剂盒-部件”的形式分离，从而使最终的组合物可以在合适的时间制备，举例来说，刚好在使用之前，通过结合两种组分制备。如在本文中使用的术语“试剂盒”涉及一种适于获得依据本发明的组合物的一套组分和合适的容器以及用于商业销售的包装等等的组合。在本发明中，“适于获得依据本发明的组合物的组分”涉及任何化合物，该化合物可以用来获得(i)和(ii)，并包括，非限制性地，介质、添加剂、CT-1、电解质、非渗透剂、缓冲剂、器官冷藏溶液等等。因此，举例来说，所述试剂盒可以包括i)具有完全组成器官冷藏组合物的容器，其中心肌营养素-1 (或其功能等效变体)已经与器官冷藏溶液混合；ii)可选择地，具有组成或部分组成器官冷藏溶液的容器；包括心肌营养素-1 (或其功能等效变体)的额外的容器；并且，选择性地，具有器官冷藏溶液的组分或额外的添加剂的其它容器，其中用于制备完全组成本发明的器官冷藏组合物的所述组分的混合是刚好在使用之前进行的；
iii)可选择地，具有必要的介质和组分的用于制备本发明器官冷藏组合物的各种容器，其中至少一种所述容的将包含心肌营养素-1 (或其功能等效变体)。用于制备根据本发明的器官冷藏组合物的介质、组分和添加剂必须是药学上可接受的。术语“药学上可接受的”是指由联邦的或州政府的管理机构审定，或者包括在美国或另一通常认可的药典，用于动物和更特别的在人体中。介质和添加剂应理解为稀释剂、辅佐齐U、赋形剂或用于施用本发明的组合物的载体。该介质和添加剂可以是无菌的液体。因而，本发明的一方面涉及用于制备器官冷藏组合物的试剂盒，所述试剂盒包括( i )心肌营养素-1或其功能等效变体；和(ii)器官冷藏溶液或，可选择地，用于制备所述溶液的介质和添加剂。已经预先在本发明的组合物的内容中描述了通过所述试剂盒获得的器官冷藏组合物的本发明的试剂盒的不同的实施例。本发明的组合物的制备方法本发明的另一方面涉及一种制备器官冷藏组合物的方法，所述方法包括将心肌营养素-1或其功能等效变体加入到器官冷藏溶液中。表述“器官冷藏组合物”、“心肌营养素-1”、“功能等效变体”和“器官冷藏溶液”及其组分和表征参数已经预先在本发明的组合物的内容中详细地定义和描述。在优选的实施例中，所述器官冷藏溶液包括(a)至少一种缓冲剂(b)至少一种非渗透剂；和(C)至少一种电解质。在甚至更优选的实施例中，所述器官冷藏溶液的pH值在6. 5和8. 5之间；并且其克分子渗透压浓度在300和410m0sm/L之间，两个参数都是在20°C下测定的。所述器官冷藏组合物的制备可以临时进行，刚好在使用之前，通过将治疗有效量的心肌营养素-1或其功能等效变体加入到器官冷藏溶液而制备。所述器官冷藏溶液可以是商用的溶液、现有技术已知的溶液、或通过混合至少一种缓冲剂、至少一种非渗透剂和至少一种电解质来获得的溶液，来获得pH值在6. 5和8. 5之间；以及克分子渗透压浓度在300和410m0sm/L之间的溶液，两个参数都是在20°C下测定的。根据本发明的组合物同时可以是预先制备并在其被使用前存在低温条件下。在本发明的优选实施例中，通过所述方法制备的所述器官冷藏组合物可以是包括在本发明的第一方面的内容中描述的任意组合物。在优选的实施例中，制备本发明的组合物的方法通过使用人源的心肌营养素-1进行，更特别地，所述心肌营养素-1对应于SEQ ID N0:1。在优选的实施例中，实施所述方法从而使组合物中的心肌营养素-1的终浓度在0. 00lg/L和5. 000g/L之间；优选地，在0. 005g/L和1. 000g/L之间;更优选地，在0. 010g/L和0. 500g/L之间;甚至更优选地，在0. 08g/L和0. 20g/L之间；并且甚至更优选地，在0. lg/L和0. 2g/L之间。在甚至更优选的实施例中，实施所述方法从而使组合物中的心肌营养素-1的终浓度在0. 001mg/L和5. OOOmg/L之间；优选地，在0. 005mg/L和1. 000mg/L之间；更优选地，在0. 010mg/L和0. 500mg/L之间；甚至更优选地，在0. 08mg/L和0. 20mg/L之间；并且甚至更优选地,在0. lmg/L和0. 2mg/L之间。本发明的冷藏方法本发明的另一方面涉及一种用于器官冷藏的方法，所述方法包括使所述器官与器 官冷藏组合物接触，所述组合物包括(i)心肌营养素-1 (CT-1)或其功能等效变体；和(ii)器官冷藏溶液。表述“器官冷藏溶液”已经在有关本发明的组合物中详细解释。在优选的实施例中，所述器官冷藏溶液包括(a)至少一种缓冲剂(b)至少一种非渗透剂；和(C)至少一种电解质。在优选的实施例中，所述器官冷藏溶液的pH值在6. 5和8. 5之间；和/或克分子渗透压浓度在300和410m0sm/l之间，两个参数都是在20°C下测定的。“器官的冷藏”理解为在低体温条件下保藏、保存、保护和/或储存器官的能力，通过抑制代谢和阻止或抵消在所述器官中由器官的冷却局部缺血和再灌注导致的变化来使细胞损伤程度降到最低。所述器官的冷藏可以对人源或动物源的器官在体外或者在体内和体外进行。在本发明的优选实施例中，所述器官是离体的。“离体”应理解为是指器官已经从供体取出并在它获得的人体或者动物体外。使根据本发明的器官冷藏组合物“接触器官”应理解为是指使所述组合物通过冲洗、浸没或灌注与所述器官接触。所述器官冷藏方法，特别是针对移植用的器官，通常包括第一阶段，其中使用器官冷藏液体对所述器官进行灌注。在本发明范围内，“灌注”应理解为是指通过引导到器官中的套管进行器官的血管内冲洗，从而除去来自供体的可能阻碍随后的保存步骤的血残留物，以及用所述冷藏液体替换血液，从而冷却所述器官到要求的温度。可以在活的或者死亡的供体的生物体上或者在离体的器官上进行所述灌注。发明人已经证明使用根据本发明的组合物灌注器官足以适当地储存和/或保存器官而不需要随后用相同的组合物进行处理。因此，在本发明的特别实施例中，所述组合物通过在供体的体内灌注与器官接触。在更特别的实施例中，使用所述组合物在体内灌注的器官在提取后不需要保持浸没在根据本发明的组合物中。
在本发明范围内，“体内灌注”应理解为在活的人或动物供体的身体上进行灌注。在本发明的另一实施例中，当所述器官从供体分离，所述组合物通过灌注与器官接触。在更特别的实施例中，使用所述组合物灌注的离体的器官在提取后不需要保持浸没在根据本发明的组合物中。在另一特别的实施例中，使用所述组合物灌注的离体的器官保持浸没在根据本发明的组合物中。在离体的器官的灌注应理解为一旦从供体取出即发生。在特别的实施例中，所述器官可以通过“器官冷藏溶液” “在体内”已经灌注，然后一旦分离则使用根据本发明的组合物进行再次灌注。随后，该器官不需要保持浸没在根据本发明的组合物中。在本发明的另一实施例中，所述组合物通过在供体内灌注并通过在分离后浸没与器官接触。本发明也考虑在人或动物的生物体中进行物理介入，其中所述生物体的寿命和健康的维持不是十分重要的。因此，在本发明的另一特别的实施例中，所述器官来自死亡的供 体。在更特别的实施例中，所述组合物通过在死亡的供体内灌注与器官接触。在甚至更特别的实施例中，使用所述组合物灌注的器官在分离后不需要保持浸没在根据本发明的组合物中。在另一实施例中，所述组合物通过灌注和在所述灌注后的浸没与从死亡的供体中提取的离体器官相接触。在另一实施例中，所述组合物通过灌注与从死亡的供体中提取的离体器官相接触，并且在灌注后所述器官不保持浸没在根据本发明的组合物中。本发明范围内，“死亡的”应理解为人或动物体中包括脑干的整个脑的生命活动已经不可挽回地停止并且已经由明确定义的神经学上的临床方案证实并由本领域技术人员熟知的专业实验所支持。在本文中，术语“死亡的”包括，除了尸体之外，处于脑死亡状态的生物体，或者该生物体的心脏和呼吸活动是通过人工来维持的。在本发明范围内，术语“供体”涉及人或动物有机体，其中移植用的器官来源于所述人体或动物有机体。灌注后，可以冲洗和/或浸没器官。在本发明范围内，“冲洗”应理解为是指使用器官冷藏组合物或溶液处理器官的外表面和/或内表面一小段时间。一般而言，在从供体提取器官和移植到受体之间，可以过去几个小时或者甚至几天。这些情况下，提取的器官通过浸没在器官冷藏组合物或溶液中来保存。在本发明范围内，“浸没”应理解为是指将所述器官浸没在保藏液中。例如，所述器官可以浸没在足以覆盖所述器官的本发明的组合物的容器中。可选择地，所述器官可以保存在低体温的灌注机器中。该机器是维持可控的、连续的或脉动的，充满根据本发明的器官冷藏组合物的设备。最后，本发明的组合物也可以在再灌注期间灌注，也就是说，当已经经历冷却局部缺血的器官恢复血流时。在不同情况下，将使用必要量的冷藏液体。可以保持所述器官与本发明的组合物接触几秒到几小时或者几天的时间。典型地，保持所述器官和所述组合物在体外接触至少150秒、至少30分钟、至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少72小时等等；优选地，在24和48小时之间；更优选地，24小时。在根据本发明的组合物和所述器官的整个接触期间，整体必须维持在0°C和25°C之间的温度范围；优选地，在0°c和15°C之间；更优选地在2°C和TC之间；以及甚至更优选地，在约4°C。例如，人的肾脏的灌注可以进行10-15分钟，使用体积为多达肾脏重量10倍的冷藏液体。随后，可以根据需要，将该肾脏保存在冷藏溶液中几秒和72小时之间。在本发明范围内，所述器官可以可选择地根据本发明的组合物中进行灌注、浸没或冲洗；或进行其组合。在本发明的实施例中，使用本发明的冷藏组合物进行器官的第一灌注，并且随后在移植之前将所述器官储存并保存在所述溶液中。第一阶段的灌注可以在活的供体或死的供体的器官上进行。因此，在另一特别的实施例中，所述组合物通过在供体内的体内灌注和在提取之后通过浸没来与所述器官相接触。在另一特别的实施例中，所述组合物通过在死亡的供体内进行灌注并在提取之后通过浸没来与所述器官相接触。本发明同时考虑使用缺乏心肌营养素-1的冷藏溶液进行灌注，而且，随后，根据本发明的组合物通过浸没或冲洗来维持所述器官。在本发明的优选实施例中，所述器官冷藏组合物通过冲洗、浸没、灌注或其组合与所述器官相接触。在优选的实施例中，用于该方法的器官冷藏组合物是如上述在本发明的组合物的内容中解释的冷藏组合物。用本发明的方法接触的器官可以是来自任何物种的任何固体器官，所述物种例如，但不限于，哺乳类(灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、家犬、猫、啮齿类、兔等等)，鸟，但优选人源的。所述器官可以来自相同物种或者与受体不同的物种的活的供体或尸体。用于本发明的冷藏方法的合适的器官可以是，非限制性地，心脏、肺、胰脏、小肠、结肠、肾脏。在本发明的优选实施例中，与本发明的组合物相接触的器官是肾脏。在本发明的另一优选实施例中，与本发明的组合物相接触的器官是肺。而在另一优选实施例中，与本发明的组合物相接触的器官是心脏。本发明的用途本发明的另一方面涉及心肌营养素-1或者其功能等效变体用于制备组合物的用途，所述组合物用于移植用的器官的冷保护和/或冷藏。在本发明的优选实施例中，所述器官冷藏组合物是如上述在本发明的组合物的内容中描述的组合物。本发明的另一方面涉及根据本发明的组合物用于移植用的器官的冷却保护和/或保藏的用途。本发明的另一方面涉及一种组合物，其用于根据本发明的器官冷藏以供移植用的器官的冷却保护和/或保存。“移植用的器官的冷却保护和/或保藏”应理解为是指在低体温的条件下保藏、保存、保护和/或储存器官的能力，通过抑制代谢和阻止或抵消在移植时产生的在器官中由所述器官的冷却局部缺血和再灌注导致的变化来使细胞损伤程度降到最低。在本发明的特别实施例中，移植用的器官的冷却保护和/或保存是在供体的体内进行的，优选地通过体内灌注。所述体内保护和/或保藏发生在人或动物体供体，通常通过灌注根据本发明的组合物。在本发明的另一特别实施例中，所述移植用的器官的冷却保护和/或保藏是分两步进行的首先在供体内使用不包含心肌营养素的“器官冷藏溶液”进行体内灌注，然后提取器官。一旦器官被分离，则在第二步中再次用本发明的组合物进行灌注。一旦使用本发明的组合物灌注器官，在体内或者一旦器官被分离，则可以通过将所述器官浸没在所述组合物中来选择性地保存和/或保护所述分离的器官。因此，在另一特别的实施例中，通过在供体的体内或者在离体器官灌注本发明的组合物以及在移植用的器官从供体中提取后额外地将器官浸没在所述组合物中进行冷却保护和/或保存。在另一特别的实施例中，通过在供体的离体器官中灌注根据本发明组合物以及另外通过将所述器官浸没在所述组合物进行冷却保护和/或保存。本发明也考虑在人或动物的生物体中进行物理介入，其中所述生物体的寿命和健康的维持不是十分重要的。因此，在本发明的另一特别实施例中，通过在死亡的人或者动物体的供体上灌注进行移植用的器官的冷却保护和/或保存。
在本发明范围内，“死亡的”应理解为是指人或动物体中包括脑干的整个脑的生命活动已经不可挽回地停止并且已经由明确定义的神经学上的临床方案证实并和由本领域技术人员熟知的专业实验所支持。在本文中，术语“死亡的”包括，除了尸体之外，处于脑死亡状态的生物体，或该生物体的心脏和呼吸活动是通过人工来维持的。在本发明的优选实施例中，移植用的器官是离体的。“离体的”理解为已经从器官所起源于的人或者动物的生物体中取出的器官和该器官在所述生物体的外面。用于本发明的方法的移植用的器官可以是来自任何物种的任何固体器官，例如，非限制性地，哺乳类(灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫、啮齿类、兔等等)，鸟，但优选人源的。所述器官可以来自相同物种或者与受体不同的物种的活的供体或尸体。用于本发明的冷藏方法的合适的器官可以是，非限制性地，心脏、肺、胰脏、小肠、结肠、肾脏。在本发明的优选实施例中，使用本发明的组合物保护和/或保存的移植用的器官是肾脏。在本发明的另一优选实施例中，使用本发明的组合物保护和/或保存的移植用的器官是肺。而在另一优选的实施例中，使用本发明的组合物保护和/或保存的移植用的器官是心脏。本发明的保藏器官本发明的作者已经证明本发明的组合物能够降低器官中与冷却局部缺血和移植后的再灌注相关的损伤。此外，本发明的作者已经表明本发明的组合物适用于冷藏移植用的肾脏，由于为它们阻止由局部缺血-再灌注引起的肾小管坏死，因此能够改进肾功能(减少血清肌酐水平并增加肌酐清除率)并提高存活率(图4)。因此，本发明的另一方面涉及一种通过本发明的方法获得的冷却-保存的离体器官。如本文使用的，术语“器官”涉及一个身体的区别部分，其具有特殊功能，例子包括，非限制性地，具有特殊功能例如呼吸、分泌或消化的部分。所述器官是“离体”的，也就是说，在它们源自的动物体或人体外。根据本发明保存的离体器官包括，非限制性地，心脏、肾脏、肺、心脏、心肺、肠、脾脏和胸腺。在优选的实施例中，保存的离体器官是肾脏。在另一优选的实施例中，保存的离体器官是肺。而在另一优选的实施例中，保存的离体器官是心脏。保存的器官对基于移植的治疗是特别有用的。
本发明通过下列实施例进行描述，其必须认为是仅对本发明的阐述，而非认为是对本发明范围的限制。

分离肾脏的另一部分以通过蛋白质印迹来测定蛋白质。首先，在裂解缓冲液(25mMHEPES,pH7. 5 ；150mM NaCl ；lmM EDTA ； 1%IGEPAL CA-630 ;10%甘油；10mM MgCl2 ；0. 25%脱氧胆酸钠；10y g/ml抑肽酶；10ii g/ml亮抑酶肽；IOmM苯基甲基磺酰氟化物(PMSF); IOOmM原钒酸钠Na2VO4 ;和25mM氟化钠(NaF))中将样品均质化，以lml/100mg组织的比例并在冰中保持30-60分钟。随后，以4°C，以12，OOOg离心样品25分钟；收集上清液并在_80°C等份冷冻，直到使用为止。测定轺氣阴离子O2= (SOA)的产牛为了测定在肾脏中的SOA产生水平，在通过02_自由基减少细胞色素C的基础上，使用由Boveris描述的对线粒体的改进技术[Boveris A. MethodsEnzymol. 1984; 105:429-435]。简要地-准备光谱测定法的比色皿(1-ml比色皿)，通过添加100ill的细胞色素C(75uM),20u I的过氧化物歧化酶(SOD ;约264U)，25yl的样品和缓冲溶液(0.1M磷酸钾+0.1mM EDTA ；pH7. 8)，将总体积定容至 IOOOu I ；-准备对照比色皿，不加样品，通过加入IOOiU的细胞色素C(75iiM)，20iU的SOD和缓冲溶液，直到总体积为1000 ill ；-准备另一个类似的比色皿，其不包含S0D，目的是研究细胞色素C的非特异性的减少；-通过分光光度读数来减少细胞色素C[在具有1-cm的光通道的1-mL比色皿中，在入为550nm ；pH7. 8和温度25°C，以6秒的间隔持续I分钟]，在2个阶段，1.-细胞色素C的非特异性的减少(没有S0D)，和2.-依赖过氧化物的细胞色素C的减少(具有S0D)；-在反应混合物中将吸光度单位的增加转变为具有摩尔消光系数SOA的nmolAE550/21. OxlO3M-1Cnr1,在假设对照比色皿中的细胞色素C完全被氧化并且观察到的吸光度的增加仅仅表示减少的产物的吸光度的情况下，△吸光度减少的-氧化的；-这样，SOA超氧阴离子的产生以nmol/mg蛋白质/分钟来表示。测丨定细胞因子TNF a和IL-6通过ELISA，根据制造商的说明书，使用DuoSet ELISA开发系统大鼠TNF a /TNFSF1A试剂盒(R&DSystems;Minneapolis，USA)来测定TNFa在肾脏组织、在血清和在保藏液中的水平。
同样地，通过ELISA，使用商业的DuoSet ELISA开发系统大鼠IL-6试剂盒(R&DSystems)来测定IL-6的水平。在两种情况下，所述水平以pg/ml表示。通讨蛋白质印迹测丨定iNOS、SlCM-U sVCAM-K I k B和NF k B为了通过蛋白质印迹对蛋白质进行定量，在裂解液中稀释所述组织样品(I 20)并在Lowry方法的基础上,使用Bio-Rad试剂盒。使用5 u L,用于样品和标准曲线,在96-孔板上进行反应(Microtest 96，BectonDickinson Labware, NJ, USA)。每个测量进行三次。在这之前，在具有已知浓度的BSA的标准溶液的基础上制作校准曲线。随后，添加25 ii L的试剂A (每mL的试剂A补充有20 ii L的试剂S，由于样品包含净化剂IGEPAL CA-630)。此后，添加200 u L的试剂B。培养混合物至少15分钟并在750nm测量吸光度。基于Laemmli方法通过电泳分离蛋白质。根据待加载的蛋白质的大小和样品体 积，将蛋白质装载到1. 5-mm厚的包含17%丙烯酰胺混合加载凝胶(29. 2%丙烯酰胺，0. 8%双丙烯酰胺)的三-甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶，和具有可变的厚度的丙烯酰胺混合分离凝胶。还加载分子量标记物(Low/Broad range, Bio-Rad Laboratories, CA, USA or BenchMark Pre-StainedProtein Ladder, Invitrogen Corporation, CA, USA)。使用的组织提取液的量是200 y g蛋白质/每孔。每个样品与等体积的上样缓冲液(1%2-巯基乙醇，2% 十二烷基硫酸钠[SDS]，10% 甘油，125mM Tris, pH6. 8,0. 0005%w/v 溴酚蓝)混合；在100°C使蛋白质变性5分钟，并随后将少量的上样缓冲液加到没有样品的孔中，使用电泳缓冲液(192mM甘氨酸，0. 1%SDS, 25mM Tris碱，pH8. 3)填充所有孔的剩余空间。在供给IOOV恒压的电泳缓冲液中进行电泳。分离的并包括在丙烯酰胺凝胶中的蛋白质被转移到膜上。所述转移是在具有转移溶液(190mM甘氨酸，20mM Tris, pH8. 3)的比色皿中进行的，保持400mA的恒定电流，具有预先浸透的材料(吸墨水纸和海绵)并将凝胶和硝化纤维膜(Hybond-ECL AmershamBiosciences)在转移缓冲液中平衡15分钟。一旦转移结束，就使用 TTBS 冲洗缓冲液(0. l%v/v TWEEN-20 ；150mM NaCl ；20mMTris, pH7. 5)冲洗膜，并且，紧接着，在连续搅拌下使用IOml的封闭缓冲液进行培养，从而防止在免疫检测期间的非特异性结合。使用第一抗体培育，在合适的稀释度和相应缓冲液的温度下，在连续搅拌下，根据每个蛋白质进行不同次数。接着使用第一抗体培育，用冲洗缓冲液进行4次5分钟冲洗，并且，随后，使用相应的第二抗体培养膜，在合适的稀释度，对于每个蛋白质进行特定的时间。最后，使用冲洗缓冲液再进行4次5分钟冲洗。通过化学发光试验检测不同蛋白质的特异条带；为此，以1:1比例的商业性开发溶液(Amersham Biosciences, United Kingdom)的混合物在室温连续搅拌I分钟，并且，随后，去除开发溶液。此后将膜放置在室内以捕获图像(ImageQuant RT ECL Imager, GEHealthcare)。一旦捕获到图像,就使用程序(ImageQuant TL software)来定量获得的条带的光密度。每次测定后，使用商用的溶液(Re-Blot Plus Strong AntibodyStrippingSoIution, Chemicon International, CA, USA)来进行“剥离”，从而随后定量a -微管蛋白，其用作上样对照。使用的抗体是
抗-a-微管蛋白(#2144#Cell Signaling Technology)iNOS/NOS II 型(BD Transduction Laboratories, 610332)抗ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, INC. sc-1511)抗VCAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, INC. sc-1504)抗I K B-P (R&D Systems, MAB3425)抗NF k: B (Santa Cruz Biotechnology, NF k B p65 (F_6) : sc-8008)抗pNF k: B (Santa Cruz Biotechnology, p-NF k B p65 (A_8) : sc-166748)肾功能(肌酐和肌酐清除率)的分析 为了测量肾功能，测定肌酐的血浆浓度和测量肾小球滤过率的肌酐清除率。使用以下公示来计算肌酐清除率(CCr)CCr=FU x CrO/CrP,其中FU是尿流速度(ml/分钟)，CrO是尿液中的肌酐浓度(mg/ml)以及CrP是肌酐的血衆浓度(mg/ml)。通过半自动分析仪(Reflotron, Roche)检测尿液和血衆中的肌酐浓度。统计学通过复式方差分析进行数据的统计分析，然后根据数据是参数的还是非参数，进行Scheff6或Kruskal-Wallis检验。p值低于或等于0. 005被认为是差异显著。使用NCSS2000 统计程序(Dr. Jerry L. Hintze, Utah, USA)来进行分析。实施例1.器官冷藏组合物的制备使用Euro-Collins溶液(EC)或者可选择地，威斯康星大学溶液(UW)作为基础器官冷藏溶液，制备补充有心肌营养素-1 (CT-1)的不同的器官冷藏组合物。因为是在试验性的大鼠模型中分析冷藏溶液，为了补充介质，使用由DROBiosystems 供应的鼠 CT-1。它在大肠杆菌 BL21 (Invitrogen, Barcelona, Spain)中以具有氨基末端组氨酸尾部的融合蛋白产生。在25°C下2小时内用终浓度为0.5mM的IPTG (Sigma)诱导重组蛋白的表达。在均质化细菌小球后，通过镍亲和柱色谱法(Qiagen, Barcelona, Spain)纯化 His-CT-1 融合蛋白。使用的 CT-1 的序列是 SEQ ID NO 2 MRGSHHHHHH GMASMTGGQQ MGRDLYDDDD KDRffGSMSQR EGSLEDHQTDSSFSFLPHLE 60AKIRQTHNLA RLLTKYADQL LEEYVQQQGE PFGLPGFSPP RLPLAGLSGP APSHAGLPVS 120ERLRQDAAAL SALPALLDAV RRRQAELNPR APRLLRSLED AARQVRALGA AVETVLAALG 180AAARGPVPEP VATSALFTSN SAAGVFSAKV LGLHVCGLYG EWVSRTE⑶L GQLVPGGVA 239EC 溶液购买自 Laboratorios Esteve (Barcelona, Spain)以及 UW 溶液购买自Bristol-Myers-Squibb (ViaSpan;Bristol-Myers-Squibb S. L. ;Madrid;Spain)。为了器官保存和移植试验，通过添加不同量的CT-1到基础溶液中来制备不同的器官冷藏组合物。表I和2示出了制备的不同的器官冷藏组合物的组合物。
表1. EC器官冷藏溶液的组合物和根据本发明的EC[CT1]组合物

1.器官冷藏组合物，所述组合物共同地或单独地包含 (i)心肌营养素-1或其功能等效变体和 (ii)器官冷藏溶液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述器官冷藏溶液包含 (a)至少一种缓冲剂 (b)至少一种非渗透剂，和 (C)至少一种电解质。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述缓冲剂是选自由磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、组氨酸、组氨酸-HC1、HEPES、柠檬酸盐及其组合所形成的组；所述非渗透剂选自由组氨酸、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡糖酸盐、柠檬酸盐、乳糖醛酸盐、棉子糖及其组合所形成的组；和/或所述电解质选自由钠、钾、镁、钙、氯化物及其组合所形成的组。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述器官冷藏溶液为Euro-Collins溶液(EC)。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中所述器官冷藏溶液还包含至少一种胶体试剂、至少一种代谢剂、至少一种氨基酸、至少一种抗氧化剂、至少一种维生素和/或至少一种抗生素。
6.根据权利要求2、3或5所述的组合物，其中所述非渗透剂选自由乳糖醛酸盐、棉子糖及两者的组合所形成的组。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，其中所述胶体试剂选自由羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇或两者的组合所形成的组。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述器官冷藏溶液为威斯康星大学溶液(UW)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中心肌营养素-1是人源的。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中人源的心肌营养素-1为具有SEQID N0:1。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述心肌营养素-1的浓度在0.01 mg/L 至 0. 50 mg/L 之间。
12.器官冷藏组合物的制备方法，所述方法包含将心肌营养素-1或者其功能等效变体添加到器官冷藏溶液中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述器官冷藏溶液包含 (a)至少一种缓冲剂； (b)至少一种非渗透剂；和 (C)至少一种电解质。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂选自由磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、组氨酸、组氨酸-HC1、HEPES、柠檬酸盐及其组合所形成的组；所述非渗透剂选自由组氨酸、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、葡糖酸盐、柠檬酸盐、乳糖醛酸盐、棉子糖及其组合所形成的组；和/或所述电解质选自由钠、钾、镁、钙、氯化物及其组合所形成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述器官冷藏溶液为Euro-Collins溶液(EC)。
16.根据权利要求12到14中任一项所述的方法，其中所述器官冷藏溶液还包含至少一种胶体试剂、至少一种代谢剂、至少一种氨基酸、至少一种抗氧化剂、至少一种维生素和/或至少一种抗生素。
17.根据权利要求13、14或16中任一项所述的方法，其中所述非渗透剂选自由乳糖醛酸盐、棉子糖及两者的组合所形成的组。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的方法，其中所述胶体试剂选自由羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇及两者的组合所形成的组。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述器官冷藏溶液为威斯康星大学溶液(UW)。
20.根据权利要求12到19中任一项所述的方法，其中心肌营养素-1是人源的。
21.根据权利要求20所述的方法，其中人源的心肌营养素-1为具有SEQID NO:l。
22.根据权利要求12到21中任一项所述的方法，其中所述心肌营养素-1的浓度在.0.01 mg/L 和 0. 50 mg/L 之间。
23.心肌营养素-1或者其功能等效变体在制备组合物中的用途，所述组合物用于移植用的器官的冷却保护和/或冷藏。
24.根据权利要求1到11中任一项所述的组合物的用途，用于移植用的器官的冷却保护和/或冷藏。
25.根据权利要求24所述的组合物的用途，其中所述移植用的器官是离体的。
26.根据权利要求24或25中任一项所述的组合物的用途，其中所述移植用的器官是肾脏。
27.根据权利要求24或25中任一项所述的组合物的用途，其中所述移