专利名称：灯盏花乙素注射制剂及其制备方法 灯盏花即菊科植物短葶飞蓬(Erigeron breviscapus(vant)Hand-Mazz)，最早收载于《滇南本草》，1974年收入云南省药品标准(灯盏细辛(灯盏花)，滇Q/W62-1974)，1977年纳入中国药典(一部，245页)。1980年云南省药物研究所从灯盏花中提取出治疗中风及其后遗症的黄酮类成份，并研制成水针剂。1984年云南省卫生厅将从灯盏花中提取的黄酮类成份命名为灯盏花素(灯盏花素，滇Q/W696-1984)，并制订了水针剂的质量标准(灯盏花素注射液，滇Q/WS697-1984)，批准水针剂上市。灯盏花素属黄酮甙(苷)类，不溶于水，但可溶于稀碱溶液(中国医学科学院药物研究所编，《中草药有效成份的研究》，人民卫生出版社1972年版，P220)。灯盏花素注射液实质上是将灯盏花素与碳酸氢钠反应后生成的灯盏花素钠盐，因此，云南省药物研究所解决了灯盏花素(灯盏花黄酮类成份)不溶于水的问题。1989年以后，灯盏花素被制成铁盐、镁盐、钙盐(王兆钺，等，中草药，1989，20(2)23～25)和碱性氨基酸盐(CN1049121C)应用于药理研究或临床。灯盏花素可溶于稀碱溶液中，当PH在8以下不会导致灯盏花素断链或氧化(自1980年至今灯盏花素注射液和注射用灯盏花素的质量标准规定的制剂PH为6～8)。然而，灯盏花素的碱性溶液不稳定一是非黄酮甙(苷)类的黄酮类成份随着时间的延长而聚集成絮状沉淀析出，致使制剂的澄明度不合格；二是与葡萄糖注射液(PH3.2～5.5)等酸性药液混合使用时会析出沉淀。为解决灯盏花素注射剂的不稳定性，公开了不少专利。概括起来，这些解决灯盏花素注射剂的不稳定性的方法，是在灯盏花素注射剂中加入“稳定剂”。如CN1555807A的“一种稳定性提高的灯盏花素注射剂及其制备方法”所述的稳定剂是有机碱、有机酸、抗氧化剂。有机碱中的柠檬酸盐、葡甲胺、泛酸钠、L-半胱氨酸、苯甲胺、烟酰胺、硫脲、乙醇胺、脲中的一种或二种；有机酸中的柠檬酸、醋酸、草酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸中的一种或二种；抗氧化剂有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸中的一种或几种。还有的用金属离子鳌合剂作为稳定剂，如CN1187356A的“灯盏花素注射液稳定的处方和工艺过程”，将EDTA-2Na作为灯盏花素注射液的稳定剂使用，同时还公布了L-半胱氨酸、乌洛托品、焦亚硫酸钠、磷酸盐类、烟酰胺、乙醇胺、丙二醇、亚硫酸氢钠、碳酸盐或碳酸氢盐，硫脲等。CN1476840A公开了“一种稳定的灯盏花素注射液的制备方法”，以CN1187356A为例，否定了上述一系列稳定剂“中国专利CN1187356A 1998年公开，公开了一种灯盏花素注射液稳定的处方，采用一系列稳定剂，将PH值调至7.0～7.8，事实上仍不能解决稳定性问题”。该专利申请提出了认为能解决稳定灯盏花素注射剂的方法以灯盏花素为主要成份，在制备过程中加入精氨酸，并调节PH值到4.5～6.5，并将“制备过程中加入L-精氨酸，调节PH值至4.5～5.6，L-精氨酸的量为40～80mg/100ml”纳入了权利要求。灯盏花素注射剂除了由于制剂本身不稳定，贮藏中容易析出沉淀，导致澄明度不合格外，在灯盏花注射剂与葡萄糖注射液(PH3.2～5.5)、葡萄糖氯化钠注射液混合使用时，如果这些制剂的PH值低于4，则在配制或输液过程中会析出沉淀，带来安全问题。灯盏花素的法定概念是灯盏花中的黄酮类成份(中华人民共和国卫生部药品质量标准中药成方制剂第二十册，P103灯盏花素)，而不是灯盏花乙素(野黄芩苷)。乙素只是灯盏花素中的一种，然而却是主要的药效成份。因此，以灯盏花素冠名的所有制剂的质量标准都是以灯盏花乙素的含量决定制剂中药效成份的量。由于2005年以前的质量标准中法定检测灯盏花乙素含量的方法是紫外分光光度吸收系数法，该法将凡是在335nm波长的吸收值都误认为是灯盏花乙素的吸收值，将不是灯盏花乙素，但在335nm波长也有吸收的物质都当作乙素计算含量，因而测定结果必然偏高，致使现市售灯盏花素制剂(口服剂、片剂、水针剂、粉针剂等)中的乙素含量用高效液相色谱法检测一般都在90％以下。也就是说，现今上市的灯盏花素及其制剂都不是纯的灯盏花乙素制剂，而是含6-11种灯盏花黄酮类物质的混合物。本申请人于2004年申请、2005年公开的“高纯度灯盏花乙素原料药的制备工艺”(申请号分别为CN200410010182.1、CN200410040352.6、CN200410062573.3)公开了灯盏花乙素含量在98％以上(用高效液相色谱法检测)的灯盏花乙素原料药的制备方法，首次制备出灯盏花乙素(而不是灯盏花素)原料药。也就是说，上面所报道的解决灯盏花素注射剂稳定性问题的技术方案都是针对灯盏花素原料药，而不是针对灯盏花乙素原料药。提纯了的灯盏花乙素，由于其结构为4′，5′，6′-三羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷，其葡萄糖上的羧基(-COOH)的氢离子与有机碱或无机碱或碱性盐的金属离子置换，生成的乙素盐而较灯盏花素(4-11种黄酮的混合物)易溶于水，但是，灯盏乙素的注射剂(水针剂、粉针剂)也存在与PH较低的注射液(如PH为3.2-5.5的葡萄糖注射液)混合使用时会出现沉淀的问题；在制备高浓度的灯盏花乙素注射液时，易出现澄明度不合格的问题。中国专利申请CN1640409A“一种高纯度的灯盏花乙素注射剂”中并没有涉及上述灯盏花乙素注射剂的不稳定性问题。但是对于高纯度的灯盏花乙素，其稳定性问题较低纯度灯盏花乙素更为突出。因此，灯盏花乙素注射剂的稳定性问题迄今仍未解决。

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供一种以高纯度灯盏花乙素为原料药的、稳定的注射制剂。
本发明的另一目的在于提供这种注射制剂的制备方法。
本发明所述的灯盏花乙素注射制剂是由灯盏花乙素-Na与PH为7-8的药用有机碱和有机酸组成的水溶液稳定系统组成的水针剂，或再加药用赋形剂组成的冻干粉针剂。
所述的灯盏花乙素-Na为纯度大于98％的灯盏花乙素原料药与碳酸氢钠反应后生成的灯盏花乙素钠；所述的有机碱为L-精氨酸；所述的有机酸为冰醋酸；所述的水溶液稳定系统为L-精氨酸∶冰醋酸的质量比为1∶0.28～0.33所组成的水溶液系统。在本制剂中灯盏花乙素∶L-精氨酸的重量比为1∶0.3～0.6；L-精氨酸的浓度为1500～3000mg/100ml注射液。所述的药用赋形剂为甘露醇、低分子右旋糖酐、甘氨酸等中的一种或2种。
本发明所述的灯盏花乙素注射剂(水针剂和冻干粉针剂)是以98％以上的灯盏花乙素为药效成份，以乙素钠的形式溶解于水，以L-精氨酸-冰醋酸为稳定系统，PH为7-8。
本发明所述的灯盏花乙素注射制剂的制备方法由以下步骤组成配制灯盏花乙素钠水溶液；配制PH为7-8的L-精氨酸-冰醋酸稳定系统；二者混合补加注射用水至所需浓度，除菌过滤分装，即为水针剂；或再加赋形剂，补加注射用水至所需浓度，除菌过滤分装，冻干，即为冻干粉针剂。
具体步骤为一、配制稳定系统取所述量的L-精氨酸，加入注射水中溶解后，加入所述量的冰醋酸；混匀，补加注射用水，测PH为7-8，即为L-精氨酸-冰醋酸稳定系统；二、制备灯盏花乙素-Na溶液称取灯盏花乙素原料药，加入注射水中，加热助溶，加入NaHCO3调PH至7-8，混匀，即为灯盏花乙素钠盐溶液；三、将步骤(一)、(二)混合，补加注射用水至1000ml，使其中L-精氨酸的浓度为1500～3000mg/100ml注射液，除菌过滤或高压灭菌，分装，即得到灯盏花乙素注射液；或注射液再加赋形剂，除菌过滤或高压灭菌，分装，冷冻干燥，即为注射用灯盏花乙素冻干粉针剂。
本发明是以纯度达98％以上的纯乙素单体为原料药，因而本发明所述的灯盏花乙素注射制剂是一种全新的注射制剂。本发明与CN1476840A有着本质的区别1.本发明是灯盏乙素单体注射剂，而不是灯盏花素(总黄酮)注射剂。2、稳定系统由L-精氨酸与冰醋酸组成。(3)加入稳定系统的PH为7-8，即注射液PH为7-8，而不是4.5～6.5。4、L-精氨酸的浓度CN1476840A为40-80mg/100ml，本专利为1500～3000mg/100ml，为CN1476840A专利用量的37.5倍。5、CN1476840A灯盏花素∶精氨酸＝1∶2.5，L-精氨酸用量为药效成份的近2.5倍；本发明专利灯盏花乙素∶L-精氨酸＝1∶0.3～0.6，只是药效成份的30％～60％。
本发明与CN155807A的区别CN155807A未提及L-精氨酸。在CN155807A所涉及的上百种技术方案中，均未涉及到本发明的L-精氨酸-冰醋酸系统。
因此，本发明的灯盏花乙素水溶液的稳定系统，是全新的稳定系统。
1、本发明的稳定性试验经HPLC检测，乙素纯度达98％以上；实施例1注射液在PH为3.2、浓度为5％的葡萄糖注射液中＞8小时溶液清亮，无沉淀析出；在PH为4.2的上述葡萄糖溶液中＞24小时溶液清亮，无沉淀析出。不加本发明稳定系统的灯盏花乙素钠盐注射液在PH为3.2、5％的葡萄糖注射液中2分钟溶液混浊，并有颗粒状沉淀析出，在PH为4.2的5％的葡萄糖注射液中6小时混浊，并有颗粒状沉淀析出(见表1)。
表1在不同PH值的5％葡萄糖注射液(250ml)中纯度达98％以上的灯盏花乙素注射液(50mg/ml)的稳定性对比表

2、对兔血小板聚集率的影响用实施例1注射用灯盏花乙素用家兔进行了血小板聚集抑制试验。日本大耳兔36只，分为5、10、20、40、80mg/kg五个给药组和1个生理盐水对照组。每组自耳静脉给药1次，连续注射3周，于第21天静脉给药后10分钟自静、动脉插管取血，用北京普利生精密仪器研究中心生产的LBY-NJ血液凝集仪测血小板聚集率，用Born氏法计算血小板聚集抑制率，用SPSS 11.5计算机软件多次给药单因素方差分析法处理试验数据，结果80mg/kg体重组对血小板聚集的抑制率为37.46％(见表2)。
表2多次耳静脉注射灯盏花乙素冻干粉针剂对兔血小板聚集率的影响

注x±S，n＝6，单因素方差分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3、安全性试验对2％兔红血球无溶血作用；小鼠急性毒性试验测得半数致死量LD50为1677.212mg/kg(95％可信区为1477.412～1904.02mg)，远高于灯盏花素的半数致死量1314mg/kg；32只Begle犬连续静注40mg/kg(2400mg/60kg)以上13周，恢复期4周，未见任何毒性反应；食蟹猴3只连续静脉注射200mg/kg(12000mg/60kg)，试验周期10周，未观察到明显毒性反应。因此，本发明制备的灯盏花乙素注射剂更安全有效。

实施例1注射液(50mg/ml/瓶)(1)灯盏花乙素-Na的配制(PH7.5)∷灯盏花乙素(纯度98％以上)50gNaHCO3(配制成10％水溶液) 8.5～9.5g注射水加至 750ml(2)稳定系统配制(PH 7.5)L-精氨酸17g冰醋酸 5ml注射水加至 200ml(3)注射用灯盏花乙素
灯盏花乙素-Na(1) 750ml稳定系统(2)200ml注射水补加至 1000ml分装成1000瓶注射液。
实施例2注射冻干剂(100mg/2ml/瓶)(1)灯盏花乙素-Na的配制(PH7.5)灯盏花乙素(纯度98％以上) 100gNaHCO3(配制成10％水溶液) 17～19g注射水补加至 1500ml(2)稳定系统配制(PH7.5)L-精氨酸 34g冰醋酸 10ml注射水加至 400ml(3)注射用灯盏花乙素配方灯盏花乙素-Na 1500ml稳定系统 400ml甘露醇(干粉) 100g注射水加至 2000ml分装成1000瓶，冻干，即得冻干制剂。


本发明涉及药剂学领域。本发明所述的灯盏花乙素注射制剂是由灯盏花乙素－Na与pH为7－8的药用有机碱和有机酸组成的水溶液稳定系统组成的水针剂，或再加药用赋形剂组成的冻干粉针剂。制备方法由以下步骤组成配制灯盏花乙素钠水溶液；配制pH为7－8的L－精氨酸－冰醋稳定系统；二者混合补加注射用水至所需浓度，除菌过滤分装，即为水针剂；或再加赋形剂，补加注射用水至所需浓度，除菌过滤分装，冻干，即为冻干粉针剂。本发明的灯盏花乙素水溶液的稳定系统，是全新的稳定系统。