专利名称：四物汤有效活性部位及有效成分的制作方法 四物汤发挥作用的物质基础是其有效化学成分，其防病治病的功效是其多种化学成分的总体效应所致。但目前对四物汤化学成分的研究十分薄弱，要从根本上研究四物汤复方的配伍组方规律，从细胞、分子水平进行揭示、从理论高度进行阐释四物汤组方原理的科学内涵，必须将配伍机制的研究与四物汤复方产生疗效的物质基础研究紧密结合起来。但是，四物汤作为中药复方其有效成分极其复杂，甚至其每一味单药均可作为一个小复方，因此，我们首先根据极性的不同及分子量的大小对四物汤水煎液进行了化学部位分离，并以外周血象、骨髓造血祖细胞集落培养等指标进行活性追踪；同时应用高效薄层层析(HPTLC)及高效液相色谱(HPLC)技术等方法对各部位的成分进行初步分析鉴定。
本发明的目的在于提供四物汤活性部位。本发明四物汤活性部位，其特征在于由B和C两部分组成，所述有效部位是由四物汤药材煎煮1-3次，过滤，得水煎液；水煎液于20-70℃旋转蒸发浓缩，用15-25％乙醇沉淀，得沉淀，上清液继续进行35-45％乙醇沉淀，得沉淀，上清液继续进行55-65％乙醇沉淀，得沉淀上清液继续进行75-85％乙醇沉淀，得沉淀，上清液浓缩至无乙醇味得浸膏，加溶解进行乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯液，回收溶剂得提取物，余下水液约进行丁醇萃取，合并正丁醇液，回收溶剂得提取物B，余下水液约浓缩至发泡而不能继续，得提取物C。本发明公开一种四物汤活性部位，其特征其特征在于主要含有芍药甙9.7％，果糖16.5％，葡萄糖10.1％，蔗糖22.3％。该有效部位的制备方法为四物汤药材煎煮1-3次，过滤，得水煎液；水煎液于20-70℃旋转蒸发浓缩，用15-25％乙醇沉淀，得沉淀，上清液继续进行35-45％乙醇沉淀，得沉淀，上清液继续进行55-65％乙醇沉淀，得沉淀上清液继续进行75-85％乙醇沉淀，得沉淀，上清液浓缩至无乙醇味得浸膏，加溶解进行乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯液，回收溶剂得提取物，余下水液约进行丁醇萃取，合并正丁醇液，回收溶剂得该活性部位。按药剂学方法，可以将本发明药物组合物制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。本发明药物还可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。芍药甙具有补血作用。以下实验例用四物汤水煎液分离了的化学部位以外周血象、骨髓造血祖细胞集落培养等指标进行活性追踪；同时应用高效薄层层析(HPTLC)及高效液相色谱(HPLC)技术等方法对活性部位的成分进行初步分析鉴定。以下实验例进一步说明本发明。
实验例1、四物汤活性成分的分离第一次部位分离四物汤经水煎、过滤、浓缩、配制成100％药液(即每ml药液含生药1g)，然后逐步加乙醇至20％-80％，分别得20％醇沉物(A)、80％醇沉物(B)、80％醇沉上清提取物(C)。用A、B、C三部分进行初步活性分析(见表1)。
表1四物汤及其第一次部位分离物对血虚证小鼠外周血白细胞的影响(x±s)照后组别动物数时间 对照组四物汤组 A组 B组 C组0 10 13.5±5.0 13.4±1.7 15.1±3.9 15.4±2.9 14.0±1.93 10 1.81±0.2 1.74±0.3 1.62±0.2 2.04±0.4 1.69±0.35 10 2.38±1.0Δ3.49±1.0*2.91±1.3 3.29±0.9*3.06±1.07 10 3.94±1.0 4.40±2.0 5.17±1.8 3.97±1.6 5.55±1.5*1010 3.21±0.5Δ4.29±1.3*3.49±0.9 4.54±1.8*4.15±0.9*1310 3.62±1.1 4.16±0.5 3.45±0.2Δ4.51±1.3 3.80±0.6
注*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；Δ与四物汤组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
结果提示B、C两部分与四物汤的活性相当后，进行第二次部位分离四物汤经水煎、过滤、浓缩、配制成100％药液(即每ml药液含生药1g)，逐步加乙醇20-80％，分别得到20-40％、40-60％、60-80％醇沉物(B1)、(B2)、(B3)；醇沉上清液浓缩去乙醇，然后依次经乙酸乙酯、正丁醇萃提，回收溶剂得提取物为(C1)、(C2)，剩余水部分浓缩得提取物为(C3)，进一步进行活性评价。
表2四物汤及其B部位分离物对血虚证小鼠外周血白细胞的影响(x±s，n＝10)照射后 组别时间(天) 模型组 四物汤组 B1组 B2组 B3组014.22±3.0 14.59±2.5 15.61±2.6 13.37±2.1 14.66±1.931.28±0.21.42±0.41.12±0.31.10±0.2Δ1.75±0.4**52.18±0.3ΔΔ2.78±0.4** 2.56±0.82.44±0.62.58±0.5*74.52±0.6ΔΔ6.42±1.3** 4.62±1.5Δ4.96±0.9ΔΔ4.34±0.8ΔΔ10 3.90±0.8Δ5.24±1.5* 3.68±1.1Δ4.40±1.23.94±0.8Δ13 3.70±0.8Δ4.74±1.2* 4.08±1.04.10±1.13.84±1.4注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；Δ与四物汤组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01表3四物汤及其C部位分离物对血虚证小鼠外周血白细胞的影响(x±s，n＝10)四物汤组照射后时间(天)模型组 组别 C1组 C2组 C3组0 14.22±3.0 14.59±2.513.49±3.115.37±3.913.86±1.63 1.28±0.2 1.42±0.4 1.29±0.3 1.51±0.4 1.29±0.25 2.18±0.3ΔΔ2.78±0.4** 2.32±0.5Δ2.54±0.4*3.00±0.4**7 4.52±0.6ΔΔ6.42±1.3** 5.22±1.0Δ5.46±1.2*5.72±1.4*103.90±0.8Δ5.24±1.5*3.67±1.2Δ3.70±1.8 4.38±1.3133.70±0.8Δ4.74±1.2*4.26±1.1 5.10±1.1** 4.74±1.1*
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；Δ与四物汤组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01实验结果表明，以外周血白细胞、骨髓造血祖细胞为指标对四物汤提取物进行活性追踪，提示80％醇沉物(B)及80％醇沉上清(C)活性较强；对二者进一步分离提取物的活性追踪实验提示B3、C2、C3部位活性相对较强，均能升高辐射损伤性血虚证小鼠外周血中白细胞数。但B1、B2及B3的补血作用均不及B。
表4四物汤及其提取物对血虚证小鼠造血祖细胞增殖的影响(x±s，n＝10)CFU-GM CFU-EBFU-ECFU-mix组别(个/105/MNC) (个/105/MNC)(个/105/MNC) (个/105/MNC)正常对照 84.2±5.5*** 45.8±8.9*** 39.8±8.0*** 30.0±8.7**模型对照 34.8±3.9 13.5±4.2 11.3±2.25.0±1.8四物汤组 61.3±7.1*** 23.8±5.1*47.0±10.2***12.5±2.5**C1组 12.6±4.0*** 9.3±2.8 10.3±2.6* 8.0±0.8*C2组 46.5±4.8**18.5±4.0 15.0±3.713.3±4.0**C3组 43.2±2.6**16.5±4.2 14.5±2.15.5±1.7B组 44.4±7.2* 27.5±12.137.5±13.5** 34.0±14.9**芍药甙组 64.0±10.5*** 27.5±8.2*22.0±5.4* 33.3±7.5***注*与模型对照比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001体外造血祖细胞集落培养结果进一步追踪验证了四物汤分离提取物的补血活性，而且首次发现芍药甙具有补血作用。
实验例2四物汤复方活性部位的初步分析鉴定一、HPTLC表明四物汤B活性部分主要由芍药甙、单糖、二糖(很可能是蔗糖)组成 见图1、2。
二、HPLC表明四物汤正丁醇部分含有芍药甙见图3三、ESIMS表明四物汤正丁醇部分含有芍药甙见图4、5、6四、TLC表明四物汤正丁醇部分的单糖主要为果糖和葡萄糖见图7实验例3四物汤正丁醇部分芍药甙、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量测定经HPLC测定(方法略)，四物汤正丁醇部分浸膏中，含有芍药甙9.7％，果糖16.5％，葡萄糖10.1％，蔗糖22.3％。


图1、2四物汤B活性部分HPTLC3四物汤正丁醇部分HPLC4、5、6四物汤正丁醇部分ESIMS7四物汤正丁醇部分TLC图下列实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1四物汤正丁醇提取物(B)及活性部位C的制备方法四物汤药材600g，第一煎加水3000ml，浸泡1h，煎30min，三层纱布过滤，第二煎加水2100ml，煎20min三层纱布过滤，得水煎液3700ml。水煎液≤60℃旋转蒸发浓缩至600ml，20％乙醇沉淀，得沉淀(G部分，14.91g)，上清液685ml继续进行40％乙醇沉淀得沉淀(F部分，58.5g)，上清液500ml，继续进行60％乙醇沉淀，得沉淀(E，15.47g)，上清液725ml继续进行80％乙醇沉淀，得沉淀(D，59.33g)，上清液1320ml，浓缩至无乙醇味得浸膏(86.2g)，加水300ml溶解得水液约500ml，进行乙酸乙酯萃取(500ml、500ml、300ml)，合并乙酸乙酯液，回收溶剂得提取物A(1.934g)，余下水液约500ml，进行正丁醇萃取(500ml、400ml，300ml)，合并正丁醇液，回收溶剂得提取物B(11.5g)，余下水液约500ml浓缩至发泡而不能继续，得提取物C(74.8g)。
实验例2胶囊剂的制备本发明有效部位B 500g、C 500g，药用淀粉1000g，混合均匀，装入1号胶囊，每粒0.2g，每次口服2-3粒，每日两次。
实施例3片剂的制备本发明有效部位B 200g、C 800g，药用淀粉400g，糊精100g，混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.25g，口服，每次2片，每日两次。
实施例4颗粒剂的制备本发明有效部位B 15g、C 85g，，糖粉100g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。口服，一次5g，一日两次。
实施例5
四物汤药材600g，第一煎加水3000ml，浸泡1h，煎30min，三层纱布过滤，第二煎加水2100ml，煎20min三层纱布过滤，得水煎液3700ml；水煎液≤60℃旋转蒸发浓缩至600ml，20％乙醇沉淀，得沉淀14.91g，上清液685ml继续进行40％乙醇沉淀得沉淀58.5g，上清液500ml，继续进行60％乙醇沉淀，得沉淀15.47g，上清液725ml继续进行80％乙醇沉淀，得沉淀59.33g，上清液1320ml，浓缩至无乙醇味得浸膏86.2g，加水300ml溶解得水液约500ml，分别用500ml、500ml、300ml乙酸乙酯进行萃取，合并乙酸乙酯液，回收溶剂得提取物1.934g，余下水液约500ml，分别用500ml、400ml，300ml正丁醇进行萃取，合并正丁醇液，回收溶剂得该活性部位，主要含有芍药甙9.7％，果糖16.5％，葡萄糖10.1％，蔗糖22.3％。所得有效部位加入糖粉适量，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。口服，一次5g，一日两次。


本发明公开四物汤活性部位，其特征在于由B和C两部分组成，所述活性部位是由四物汤药材煎煮1－3次，过滤，得水煎液；水煎液低于50－60℃旋转蒸发浓缩，用20％乙醇沉淀，得沉淀，上清液继续进行40％乙醇沉淀，得沉淀，上清液继续进行60％乙醇沉淀，得沉淀上清液725ml继续进行80％乙醇沉淀，得沉淀，上清液浓缩至无乙醇味得浸膏，加溶解进行乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯液，回收溶剂得提取物，余下水液约进行丁醇萃取，合并丁醇液，回收溶剂得提取物B，余下水液约浓缩至发泡而不能继续，得提取物C。