专利名称：肺炎球菌RrgB分化枝的组合物的制作方法肺炎链球菌(S. pneumoniae)具有称为菌毛_1的菌毛，其由141Λ岛(Pl-I)编码， 具有以下7个编码基因RlrA转录调控因子、含LPXTG型细胞壁分选信号的3种菌毛亚基、 参与菌毛聚合物合成和掺入辅助菌毛成分的3种分选酶。RrgB是形成所述结构骨架的主要亚基，而另2个菌毛蛋白(RrgA、RrgC)是辅助结构蛋白[1_4]。RrgA是主要的菌毛-1粘附素；缺乏RrgA的细菌对上皮细胞的粘附低于野生型生物。发明_既述本发明涉及免疫原性组合物，其包括以下物质中至少两种(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO :1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO :1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO :2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO :2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO :3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO :3的至少7个连续氨基酸的片段组成。本发明还涉及包括以下至少两种的多肽(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO 1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO 1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO 2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO 2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和/或(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO 3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO 3的至少7个连续氨基酸的片段组成。本发明还涉及含有以下氨基酸序列的多肽A-{-X-L-}n-B其中各X是如权利要求1定义的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L 是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B是可选的C末端氨基酸序列；η 是2或更大的整数。可选地，所述多肽含有如权利要求1定义的第一、第二和第三多肽中的至少2种。在中，本发明的多肽含有选自SEQ ID NO :11、13、15、17、19和21的氨基酸序列。本发明也涉及表达以下至少两种的细菌3(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO :1具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO :1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO :2具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO :2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO :3具有至少90%序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO :3的至少7个连续氨基酸的片段组成。附图简要说明图1显示用5个RrgB嵌合体和对照的细菌研究结果。图为CFU/ml。各标记显示单个小鼠的数据。图2显示用5个RrgB嵌合体和对照的死亡率研究结果。图为存活天数。各标记显示单个小鼠的数据。图3显示有4条泳道的凝胶。所述泳道从左至右含有分子量标记物；I-II-III 嵌合体；I-II-III嵌合体；BSA标准。箭头指示214kDa的分子量。图4显示被动保护数据，使用针对TIGR4RrgB的4种mAb，或盐水对照。Y轴显示 24小时菌血症的CFU/ml。图4B显示用4种针对TIGR4RrgB的mAb的死亡率研究结果。图5和6显示使用针对TIGR4序列(图5)或6B序列(图6)的mAb的蛋白质印迹。泳道从左至右为标记物；RrgB I-II-III ；RrgB II-I-III ；RrgBII-III-I ；RrgB III-I-II ；RrgB III-II-I ；RrgB TIGR4 ；RrgB 6B ；RrgB 23F ；BSA 对照。图7显示用铝佐剂I-II-III嵌合体、III-II-I嵌合体、TIGR4或单用铝免疫后的 (A)菌血症和(B)死亡率数据。图7A中数据为CFU/ml而图7B中数据为存活天数。图8显示针对TIGR4菌株的OPKA结果，显示随血清稀释变化的OPKA杀伤％。菱形表示阳性对照血清；实心方格是预免疫血清，近χ轴可见 ’另5条线是针对5种嵌合体的血清。图9显示基于SEQ ID NO :1_3和85-96相同性％的树形。标记是SEQID0图10显示针对肺炎链球菌血清型6B的OPKA结果，显示随血清稀释变化的杀伤％。图11显示针对肺炎链球菌血清型6B的OPKA结果，显示随稀释至多1/131220的血清稀释变化的杀伤％。图12显示用III-II-I嵌合体以不同剂量免疫后的㈧菌血症和⑶死亡率数据。 图12A中数据为CFU/ml而图12B中数据为存活天数。图13显示用20 μ g RrgB III-II-I嵌合体免疫后的㈧菌血症和⑶死亡率数据。图13A中数据为CFU/ml而图13B中数据为存活天数。图14表明用MF59佐剂的III-II-I RrgB嵌合体具有保护性。菱形表示有佐剂的 RrgB嵌合体，圆圈表示单独的MF59佐剂。图15显示用RrgB III-II-I嵌合体皮下免疫后的(A)菌血症和(B)死亡率数据。 图15A中数据为CFU/ml而图15B中数据为存活天数。图16显示M小时菌血症试验中，与正常兔血清(NRS)对照相比，RrgB III-II-I 嵌合体在被动保护研究中引起功能性抗体生成。图17显示针对(A)TIGR4和(B) ST35B的OPKA结果，显示随血清稀释变化的杀伤％。菱形表示抗抖，圆圈表示RrgB III-II-I嵌合体，正方形表示NSK。图18显示针对TIGR4菌株的OPKA结果，表明OPA活性由抗RrgBIII-II-I嵌合体的抗体特异性引起。图19显示单一 RrgB结构域赋予的体内保护。三角形表示RrgB嵌合体，菱形表示 Dl结构域，正方形表示D4结构域，圆圈表示铝。图20是不同RrgB结构域(单一结构域Dl、D2、D3和D4，多个结构域片段D1-3、 D2-4、D3-4)的蛋白质印迹分析，测试其与4种针对TIGR4RrgB的保护性mAb的结合。图21显示用结合于经胰蛋白酶消化RrgB的单克隆抗体23F8/C10进行的蛋白质印迹分析。图22 (A)是RrgB结构域Dl氨基酸序列在化脓性链球菌(S. pyogenese)菌毛骨架 Spy0128结构域1晶体结构上的模型。(B)是肺炎链球菌RrgB晶体结构(D2-D3)和模型Dl 结构域。(C)是肺炎链球菌菌毛的3D重建电子密度图。图23显示用RrgB 111_11_1嵌合体结合其他多肽抗原不同组合(20 μ g抗原)进行腹膜内免疫后针对6B-芬兰菌株(静脉攻击)的(A)48小时菌血症和(B)死亡率数据。 图23A中数据为CFU/ml而图23B中数据为存活天数。(A)和(B)中第1列显示spr0057、 spr0096和spr2021的组合；第2列显示SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第3列显示 RrgB III-II-I 嵌合体；第 4 列显示 RrgB III-II-I 嵌合体与 spr0057、spr0096 和 spr2021 的组合；第5列显示RrgB III-II-I嵌合体与SP2216_1、SP1732_3和PsaA的组合；第6列显示铝对照。图M显示用RrgB 111_11_1嵌合体结合其他多肽抗原不同组合(20 μ g抗原)进行腹膜内免疫后针对35B-SME15菌株(静脉攻击)的(A) 48小时菌血症和(B)死亡率数据。 图24A中数据为CFU/ml而图24B中数据为存活天数。(A)和(B)中第1列显示spr0057、 spr0096和spr2021的组合；第2列显示SP2216_1、SP 1732-3和PsaA的组合；第3列显示 RrgB III-II-I 嵌合体；第 4 列显示 RrgB III-II-I 嵌合体与 spr0057、spr0096 和 spr2021 的组合；第5列显示RrgB III-II-I嵌合体与SP2216_1、SP1732_3和PsaA的组合；第6列显示铝对照。图25显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A) M小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR42. 1E+02CFU/小鼠进行腹膜内攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。图沈显示在BALB/c小鼠中用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体的M小时菌血症试验，与以下作比较(i)无标签III-II-I嵌合体，(ii)spr0057、spr0096和spr2021的组合，(iii)spr0057、spr0096和spr2021的组合，进一步联合无标签III-II-I嵌合体和 (iv)铝对照(腹膜内免疫，用TIGR41. 6E+02CFU/小鼠进行腹膜内攻击)。图27显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签111_11_1嵌合体和铝对照的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用35B-SME154.6E+07CFU/ 小鼠进行静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而⑶中数据为存活天数。
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图28显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A) 48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用6B芬兰129. 4E+07CFU/ 小鼠进行静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而⑶中数据为存活天数。图四显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR46. 3E+05CFU/小鼠进行静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。图30显示用20 μ g III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A) 48小时菌血症试验和⑶死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR4静脉攻击)。㈧中数据为CFU/ml而⑶中数据为存活天数。图31显示用20 μ g III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A) M小时菌血症试验和⑶死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR4腹膜内攻击)。㈧中数据为CFU/ml而⑶中数据为存活天数。图32显示用20 μ g III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A) 24小时菌血症试验和⑶死亡率数据(腹膜内免疫，用35B-SME15静脉攻击)。㈧中数据为CFU/ml而(B) 中数据为存活天数。图33显示用20 μ g III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A) 24小时菌血症试验和⑶死亡率数据(腹膜内免疫，用6B芬兰12静脉攻击)。㈧中数据为CFU/ml而(B) 中数据为存活天数。图34显示用III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A)48小时菌血症试验和(B) 死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR4静脉攻击)，用过量表达菌毛的TIGR4菌株(T4+)攻击与菌毛表达量很低的TIGR4菌株(T4-)作比较。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。图35显示用II-I-III和111_11_1嵌合体免疫后的48小时菌血症试验，其中 (A)用过量表达菌毛的6B芬兰12菌株攻击(腹膜内免疫，用过量表达菌毛的6B芬兰 127. 0E+09CFU/小鼠进行静脉攻击)和(B)用菌毛表达量很低的6B芬兰12菌株攻击(腹膜内免疫，用菌毛表达不足的6B芬兰127.3E+09CFU/小鼠进行静脉攻击)。(A)和(B)都显示以下的数据spr0057、spr0096和spr2021的组合；6B芬兰-CRM197偶联物；和铝。(A) 中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。图36是MLST数据库的计算机模拟分析，显示急性中耳炎肺炎链球菌分离物集合， 相较易受抗生素影响的菌株，菌毛-1在耐受抗生素(红霉素耐受、青霉素耐受和多药耐受) 的菌株中更普遍。发明详述RrgB菌毛亚基具有至少3个分化枝。所述3个分化枝的参比氨基酸是本文的SEQ ID N0:l、2和3。所述分化枝在其N和C末端较好保守，但在中间偏离。SEQ ID NO :1和2 有46%的相同性；SEQ ID NO :1和3有51%的相同性；SEQ ID NO :2和3有65%的相同性。已发现针对给定RrgB分化枝的血清对表达该分化枝的肺炎双球菌 (pneumococci)有活性，但对表达另外2种分化枝之一的菌株无活性，即存在分化枝内交叉保护，但没有分化枝间交叉保护。因此，根据本发明，免疫原性组合物包括至少2种不同 RrgB分化枝。这些可能以单独多肽形式存在于免疫原性组合物中，或可融合为单一多肽链。将多个RrgB分化枝纳为疫苗成分改善免疫原性组合物抵御含菌毛肺炎双球菌的菌株覆盖率。此外，观察到在菌毛-1存在和抗生素耐受间存在显著相关性；此发现提示用含多个RrgB分化枝的免疫原性组合物免疫会具有抵御耐受抗生素处理的肺炎双球菌的额外优势。因此，本发明提供免疫原性组合物，其包括以下至少2种(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列 ⑴与SEQ ID NO 1具有至少序列相同性和/或(ii)由来自SEQ IDNO 1的至少χ个连续氨基酸的片段组成；(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列 (i)与SEQ ID NO 2具有至少序列相同性和/或(ii)由来自SEQ IDNO 2的至少y个连续氨基酸的片段组成；和/或(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列 ⑴与SEQ ID NO 3具有至少序列相同性和/或(ii)由来自SEQ IDNO 3的至少ζ个连续氨基酸的片段组成。本发明还提供包括以下至少两种的多肽(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO :1具有至少序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO :1的至少χ个连续氨基酸的片段组成；(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO :2具有至少序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO :2的至少y个连续氨基酸的片段组成；和/或(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列⑴与SEQ ID NO :3具有至少序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO 3的至少ζ个连续氨基酸的片段组成。本发明还提供含有以下氨基酸序列的多肽A-{-X-L-}n-B其中Χ是如上定义的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B是可选的C末端氨基酸序列；11是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。可选地，所述多肽含有如权利要求1定义的第一、第二和第三多肽中的至少2种。通常，η是2或3，X部分选自下列
~~ΠζΠζΠζ
—2 第一氨基酸序列第二氨基酸序列
—2 第二氨基酸序列第一氨基酸序列
第一氨基酸序列第二氨基酸序列第三氨基酸序列
第一氨基酸序列第三氨基酸序列第二氨基酸序列
第二氨基酸序列第三氨基酸序列第一氨基酸序列
第二氨基酸序列第一氨基酸序列第三氨基酸序列


肺炎球菌菌毛亚基RrgB具有至少3种分化枝。针对给定分化枝的血清对表达该RrgB分化枝的肺炎双球菌有活性，但对表达另外2种分化枝之一的菌株无活性，即存在分化枝内交叉保护，但没有分化枝间交叉保护。因此，免疫原性组合物可包括至少2种不同RrgB分化枝以改善针对含菌毛肺炎双球菌的菌株覆盖率。所述多种分化枝可作为单独多肽存在于免疫原性组合物中或可作为单一多肽链融合。