专利名称：用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒的制作方法JAK2基因属于JAK基因家族，编码JAK —种酪氨酸蛋白激酶，属于非受体型酪氨酸蛋白激酶。JAK2蛋白激酶与JAKs家族具有相同结构功能区，其结构由4部分组成，分别为 C端激酶区、假激酶区、假SH2区和N端FERM区。JAK2蛋白酪氨酸激酶激活的信号通路是细胞分化的主要细胞因子信号传导通路之一。受体信号转导起始于JAK2，通过活化JAK2， 进一步活化其下游的STAT蛋白，活化的STAT将信号直接导入细胞核内，调节基因表达，从而参与包括造血和免疫系统在内的多条信号通路。JAK2可以介导多种细胞因子和生长因子信号转导，包括红细胞生成素(ΕΡ0)，白细胞介素(IL-3)、生长因子(GH)、血小板生成素 (TPO)，粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，从而调节细胞生长、增值和分化。JAK2激酶的持续活化，会激活JAK介导的下游STAT的持续活化，其持续活化可诱发包括骨髓增殖性肿瘤在内的多种肿瘤。骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasms, MPN)是骨髓里一种血细胞恶变导致的肿瘤，主要包括真性红细胞增多症(Polycythemia vera, PV)、原发性血小板增生多症(Essential thrombocythemia，ET)、特发j"生骨髓纤维化(Idiopathic myelofibrosis, IMF)、慢性骨髓细胞性白血病(Chronic myelogenous，CML)。研究发现，骨髓增殖性肿瘤发生通常伴有JAK2基因第1849位突变，导致第617位的缬氨酸(V)变为苯丙氨酸(F)。 JAK2 V617F 突变率在 PV 患者中约有 90% (Lippert，Boissinot et al. Blood 108(6) 1865-1867. 2006)，在 ET 和 IMF 的突变率为 50-60% (Sazawal，Bajaj et al. Indian J Med Res 132 =423-4272010)。JAK2基因V617F突变在MPN的发现，使2008年世界卫生组织(WHO) 修订MPN的诊断标准，将JAK2V617F的突变作为MPN主要诊断指标之一。因此，检测JAK2 基因V617F突变的对临床MPN患者的诊断和筛查有重要意义。针对JAK2基因V617F突变靶点设计药物已经成为治疗ET，PV, IMF等疾病的最重要的靶点之一。目前的临床药物TG101348和AZD1480是特异性作用于JAK2激酶开发的一类治疗肿瘤的药物，其可以阻断肿瘤细胞JAK2下游的STAT3信号通路的传导，抑制肿瘤的生长和增值，从而达到治疗肿瘤目的。因此，检测JAK2基因是否存在V617F突变，不但可以帮助临床医生进行MPN的诊断，而且可以为临床医生的科学用药提供参考依据。目前检测JAK2基因突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30% ；检测操作复杂，效率低，通常要1-2天才可出检测结果。 特别是对于小样本的病理组织的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。包括JAK2基因在内的驱动性基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点，而且多数驱动性突变的检测为小样本组织。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求，迫切需要开发一种高灵敏度与高特异性的JAK2 基因驱动突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对JAK2基因驱动性突变的检测，从而为临床个体化用药方案提供科学参考依据。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏，快速、操作简便的JAK2基因突变检测方法和检测试剂盒。本检测方法设计运用一种新型“双环探针”技术，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构，通过与特异性引物相结合，阻止了非特异性扩增。该检测方法的灵敏度可达到0. 1%，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
本发明的目的在于提供一种用于JAK2基因突变检测的引物和双环探针，通过对其驱动性突变的检测实现骨髓增殖性肿瘤的早期筛查和化疗预后，其特异引物与双环探针包括如下序列表IEGFR驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列 V617FSEQ. ID NOJAK-F: GCAGTGACCTCCAGAGACAGTCTATCTTTGAAGCAATACGTATGA01SEQ. ID NOJAK-R: GCAGTGACCTCCAGAGACACTTACTTCGTCTCCACAGAA
02
Γ--,,-,SEQ. ID NO
JAK-P: 5-FAM GTCATGCTTGCAGT|^C|GCTTGC^CTG|-3-BHO1。3
Control
SEQ. ID NO
E2-T-S5: GCAGTGACCTCCAGAGACACGACAAGCTCAC
04
SEQ. ID NO
E2-T-R5: GCAGTGACCTCCAGAGACAAACAAGGACAC
05
SEQ. ID NO
E2-P-C3: CGACTCCAGCAGCTGGTTCAATAACCAAG
06
SEQ. ID NO
T2-primer: TCAAGCCGACAGTAGCCTA
07本发明另一方面提供一种用于检测JAK2基因驱动突变检测试剂盒，其PCR反应扩
增体系如下
4IXPCR缓冲液
模板DNA5 mL
JAK2特异引物5 μΜ
JAK2双环探针4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探针2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%本发明另一方面提供一种用于检测JAK2基因驱动性突变方法，其方法包括以下步骤(1)根据COSMIC数据公布的人类JAK2为野生型基因序列，针对JAK2的驱动性突变点，来设计特异性简并引物和特异性双环探针。(2)提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、全血和血浆等组织中的DNA。(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果检测反应体系的FAM和HEX 荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct > 16)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0 或31:阴性；Ct值小于31:阳性。本发明的有益效果是本发明采用了特异性引物和双环探针技术，可以特异性地检测人类JAK2基因驱动性突变。此方法(1)建立了实时PCR体系实现对JAK2基因V617F 驱动突变快速检测；(2)灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；(3)特异性强，IOng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；(4)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。


图1为实施例1阴性对照PCR图。图2为实施例1检测JAK2基因V617F突变的PCR图。图3为实施例1灵敏度分析试验结果PCR图。图4为实施例1选择性试验结果PCR图。图5为实施例2检测临床样本JAK2突变阳性PCR图。

框的部分结合成另一环，双环探针环形结构的消失引起荧光的产生。双环探针可以在该反应中，将完全匹配的靶序列检测出来。只有突变的DNA扩增产物可以与双环探针结合，发出荧光信号而被检测出来。该技术与“特异引物技术”相结合，可以阻止非特异性扩增，使检测基因突变的灵敏度和准确性得到大幅度提高，运用上述基本原理，设计JAK2基因V617F 突变位点的双环探针。应用I^emier 6. 0引物设计软件设计双环探针和特异引物核苷酸序列，设计的特异性引物和双环探针的序列如表1所示。(2)检测样本处理与DNA的提取检测样本包括全血和血浆，对于全血、血浆其体积不少于200 μ L，按如下操作步骤提取DNA。加入蛋白酶K和Buffer ATL，56°C消化裂解1小时，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L无水乙醇充分混勻，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000 X g (8000rpm) 离心Imin，加入500 μ LBuffer Affl,6000Xg(8000rpm)离心Imin，小心打开盖子加入 500 μ L Buffer AW2,6000 X g (8000rpm)离心 lmin，空管离心 20000 X g (14000rpm)离心 3min，加入 100 μ L Buffer ATE 于膜中央，温育 5 分钟，20000 X g (14000rpm)离心 lmin。所提DNA经紫外分光光度计检测提取质量，要求所提DNA的0D26(1/0D28(1在1. 8 2. 0之间。然后用Tris-HCl (10mmol/L,PH 8. 0)溶液调整DNA浓度到2ng/ μ L作为PCR模板，取5 μ L进行PCR反应扩增。(3)建立PCR扩增反应体系应用上述设计合成的双环探针和特异引物，取5μ L提取的DNA作为反应模板，采用如下PCR反应体系进行扩增，PCR扩增反应体系为
IXPCR缓冲液
模板DNA5 mL
JAK2特异引物5 μΜ
JAK2双环探针4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探针2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，1个循环；95°C变性25秒，60°C退火20 秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93 °C变性25秒，56 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31个循环。
6后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准检测FAM和HEX荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct > 16)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31 阴性；Ct值小于31 阳性。以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。实施例1本实施例以质粒和细胞系检测本发明体系，经基因工程构建的突变质粒模板1株 (含V617F)，细胞系2株，分别为H1650 (JAK2基因野生型)和SW480 (JAK2基因野生型)。 利用本发明实时荧光PCR检测JAK2基因V617F突变的方法包括如下步骤(1)样本DNA提取将蛋白酶K和Buffer ATL，加入到800 μ 1的细胞液中，56 °C消化裂解1小时， 90°C孵化lh，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L无水乙醇充分混勻，将上清小心转移到 QIA 2mL 离心柱中，6000Xg(8000rpm)离心 lmin，加入 500μ 1 Buffer Affl, 6000Xg(8000rpm)离心 lmin，小心打开盖子加入 500 μ L Buffer AW2,6000 X g (8000rpm) 离心lmin，空管离心20000Xg(14000rpm)离心3min，加入100 μ L Buffer ATE于膜中央， 温育5分钟，20000 Xg (14000rpm)离心lmin。所提DNA经紫外分光光度计检测提取质量， 要求所提 DNA 的 0D260/0D280 在 1. 8 2. 0 之间。然后用 Tris-HCl (10mmol/L,PH 8. 0)溶液调整DNA浓度到2ng/ μ L作为PCR模板，取5 μ L进行PCR反应扩增。(2)荧光PCR扩增反应体系将上述所提DNA样本应于如下实时荧光PCR扩增体系进行扩增，JAK2荧光PCR扩增体系为
IXPCR缓冲液
模板DNA5 mL
JAK2特异引物5 μΜ
JAK2双环探针4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探针2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，1个循环；95°C变性25秒，60°C退火20 秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93 °C变性25秒，56 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31个循环。 后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。(3)检测结果判定
采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX 的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31 阴性；Ct值小于31 :阳性。细胞系和质粒的PCR检测结果分别见图1和图2。灵敏度分析将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释。每次反应加入5 μ L DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出，见图3。选择性分析固定每次PCR反应总DNA用量，IOOng/反应和IOng/反应。先将野生型细胞系(SW480) DNA浓度都调整为20ng/ μ L和2ng/ μ L。这样每个反应加5 μ L模板即为IOOng/反应和IOng/反应。然后将105拷贝/ μ L的突变质粒DNA用20ng/ μ L和2ng/ μ L的SW480细胞系的DNA连续10倍稀释。结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在IOng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0. 1%，见图4。重复性试验每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝和10拷贝，重复 10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0. 2个循环。检测结果表明，本发明的检测体系可以高灵敏、准确地检测上述混合体系的JAK2 基因突变。实施例2运用本发明检测临床样本，取送我公司检测的临床骨髓增殖性肿瘤血液样本50 例，其中PV患者14例，IMF患者25例，ET患者11例。年龄为30-72岁，平均年龄为56岁。 利用本发明双环探针和荧光PCR体系检测50例临床样本的JAK2基因驱动突变步骤如下。(1)临床病理样本DNA提取将上述样本各取800 μ 1的血液，按如下步骤进行DNA提取。加入蛋白酶K和 Buffer ATL，56 "C消化裂解1小时，加入200mL Buffer AL混勻再加入200 μ L无水乙醇充分混勻，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000Xg(8000rpm)离心lmin，加入 500 μ LBuffer Affl,6000Xg(8000rpm)离心 lmin，小心打开盖子加入 500 μ L Buffer Aff2, 6000 X g (8000rpm)离心 lmin,空管离心 20000 X g(14000rpm)离心 3min,加 Λ 100 μ L Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000Xg(14000rpm)离心lmin。所提DNA经紫外分光光度计检测提取质量，要求所提DNA的0拟60/0D280在1. 8 2. 0之间。然后用 Tris-HCl (10mmol/L, PH 8. 0)溶液调整 DNA 浓度到 &ig/μ L 作为 PCR模板，取 5 μ L 进行 PCR 反应扩增。(2)荧光PCR扩增反应体系将上述所提DNA样本应于如下实时荧光PCR扩增体系进行扩增，JAK2荧光PCR扩
增体系为IXPCR缓冲液
模板DNA5 mL
JAK2特异引物5 μΜ
JAK2双环探针4 μΜ
Taq 酶1. 5 U
E2_s5 引物2. 5μΜ
E2-R5 引物5 μΜ
E2-P-C3 探针2 μΜ
dNTP12. 5 mM
MgCL210 mM
甲酰胺1. 5%实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，1个循环；95°C变性25秒，60°C退火20 秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93 °C变性25秒，56 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31个循环。 后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。(3)检测结果判定采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX 的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31:阴性；Ct值小于31:阳性。在所检测的50例骨髓增殖性肿瘤的临床样本中，包括PV患者14例、IMF患者25 例、ET患者11例。同时，在足够量样本下，采用直接测序法进行对比检测，结果表明本发明体系与直接测序法的符合率达到100%，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表 2。本发明荧光PCR反应体系可检测JAK2基因V617F驱动性突变，检测方便快捷，准确性高，可满足JAK2基因驱动性突变的快速检测。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100%，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力均远高于传统测序方法。表1:引物和探针序列


本发明公开了用于检测人类JAK2基因驱动突变的引物、探针及试剂盒，涉及到基因突变的检测。本发明的方法包括(1)提供7条引物和探针；(2)检测样品DNA模板的提取；(3)配制检测JAK2基因驱动突变的荧光PCR反应体系；(4)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，根据FAM和HEX荧光强度判定结果。本发明的方法可以检测JAK2基因V617F驱动突变，该方法具有灵敏度高，特异性强，检测速度快，检测方便等特点。