专利名称：一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术的制作方法人类医学上，利用噬菌体及其裂解酶，特定蛋白质作为控制耐药菌株的工具之一。 噬菌体作为抵抗病原宿主菌的有力工具在水产上得到应用，可以采取水体投放的方式，或者创口涂抹，口服，以至于浸泡等方式。在水产应用中，除利用水体投放有效降低宿主致病菌的浓度外，在水产动物体内的预防和治疗实际上主要依赖于浸泡、口服的方式，其对肠道病原菌有良好的抑制效果，但是对体内血液的致病菌的效果变差。在动物感染病原体时，1小时内浸泡使用噬菌体，保护率达到100%，感染时间延长，再使用噬菌体效率下降，到24小时后，保护率下降到48% (C R Merril, B Biswas, R Carlton, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8): 3188 - 3192)。在水产上，要在感染病原菌数小时内及时投放噬菌体，有较大难度。因此长期保持生物体内有足够量的噬菌体，在预防疾病上有重要意义。噬菌体在动物体内存活时间短，在人体体内不超过Mh，即使在鱼等低等脊椎动物体内，一般也不超过48h。因此一直没有有效方式，保证噬菌体及时杀灭病原宿主菌，有效保护养殖动物。水产无脊椎动物幼体培育中，密度大，水体变化也大，因此，弧菌病害严重；同样， 亲本培育过程时间长，相对而言，养殖环境不能及时更新，弧菌病害也严重干扰，因此制作在养殖期动物体内长期存活的噬菌体将有利于长期防御宿主菌，也有利于长期保持水体中相当量的噬菌体浓度。这种体内长期存活的噬菌体对于具有特定抗体体液免疫的脊椎动物，将会引发免疫反应，影响动物生长和生存能力，但是对于特异性免疫反应不同的无脊椎动物，没有致病能力的噬菌体大多数情况下不会严重影响道该无脊椎动物生长和生存能力。C R Merril 等人在其发表的文章(C R Merril, B Biswas, R Carlton, N C Jensen, G J Creed, S Zullo, and S Adhya. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8) : 3188 -3192.)中，为防治多重细菌病原耐药性研究了长循环噬菌体，其中，对大肠杆菌coli和伤寒沙门氏菌噬菌体，他们利用一种连续通道(serial-passage)技术在鼠体内选择能够在长周期内保留于循环系统内的噬菌体变异体，其研究表明在25h时，与对照组比较，血液中噬菌体保留浓度高4-5个数量级。1998年Adhya，Sankar L. Carlton, Richard Μ.， Merril, Carl R.申报美国专利(U. S，Patent，5811093) “Bacteriophage genotypically modified to delay inactivations by the host defense system，，,对这类大肠杆菌coli 和伤寒沙门氏菌噬菌体在细菌浸染的宿主防御系统失活(减少数量，减低裂解活性)的非遗传工程技术的连续通道(serial-passage)技术申报专利。2005年Christal L. Vitiello, Carl R. Merril, Sankar Adhya ( Virus Research, 114 (2005) 101 _ 103)发文认为是该噬菌体突变导致衣壳蛋白的一个氨基酸变化引起其在血液中循环周期的变化，λ噬菌体浸泡鼠后Mh，比一般多13，000 - 16，000倍保留于血液中，Capparelli等人在2007年用 Sia/^j^ococciAs atfreiAs 的噬菌体观察到相似的结果(Ant. Agents. Chem. 51 (8): 2007,2765-2773)o 2009 ^Ξ Joas L. Da Silva; Rosario D. C. Hirata; Mario H. Hirata 等(Braz. J. Microbiol. 40 (3) :1517_8382，2009)再一次认为这种技术对目前状况特别是医院感染是适用的。利用噬菌体抑制水产动物宿主病原菌，已经有多个专利。专利200710078116. 7利用多种噬菌体处理净化环境病原菌，其中包括霍乱弧菌，副溶血弧菌；专利200910038392. X分离副溶血弧菌噬菌体并用以杀菌，用于水体环境，包括养殖环境；专利申请号 201110050243. 2分离哈维氏弧菌，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，防治刺参腐皮综合症。上述研究和发明专利，在脊椎动物中长循环噬菌体强化了保护效果和延长了时间，但是对于水产动物而言，并不适用。以浸泡噬菌体方法，不适合于规模化养殖的水产产业；噬菌体在体内存活的时间还是不能满足要求，水产动物(如对虾)要求数十日，以至于终生(如贝类)保持在体内保持噬菌体，并一直保持对宿主菌的裂解活性，这种类似于“活体疫苗”的噬菌体，将可以有效控制细菌性疾病。但是这有必要的条件需要满足，即噬菌体对养殖动物无害或低害，不影响生长，养殖动物对该噬菌体低水平免疫反应，噬菌体在体内可以保持对宿主菌的裂解性。本发明涉及的弧菌噬菌体产生很低毒素水平，无脊椎动物没有以抗体为基础的特异性免疫反应，奠定了本发明的基础。
本发明目的在于提供一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术，采用该技术可得到无毒无害的噬菌体，且所得到噬菌体在水产无脊椎动物体内可长时间保持对宿主裂解活力，同时还可以满足水产无脊椎动物幼体与亲本的生产需要。为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术，包括如下具体步骤(1)从养殖水体按常规分离弧菌属菌株及其噬菌体，得到噬菌体裂解液；(2)将步骤(1)获得的噬菌体裂解液经离心回收，0.22Mffl滤膜过滤后，用双平板法测效价，得到浓度为1.5 X IO11 8. 5 X IOltlPfVml的噬菌体液，于4°C保存，作为保存液，备用；(3)将步骤(2)获得的保存液以蛋白胨水稀释，以双平板法计数，得到浓度为 0.8 X IO9 1. 5 X IO9 pfu/mL的噬菌体液，作为浸泡使用液；(4)第一次浸泡将步骤(3)获得的浸泡使用液投放于养殖海水中，使浸泡使用液终浓度为IXlO6 IXlO7 pfu/ml，然后向养殖海水中加入水产无脊椎动物幼体或亲本，浸泡 0. 5 2h，为第一次浸泡；
(5)第二次浸泡第一次浸泡后第7天时，采集培养样本，用双平板法涂布平板，裂解宿主菌株，选取噬菌斑，分离噬菌体，利用该噬菌斑制作与第一次浸泡的浸泡使用液同等浓度的噬菌体使用液，并在养殖海水中投放与噬菌体使用液同样浓度的本步骤制作得到的噬菌体，用另一组水产无脊椎动物幼体或亲本作第二次浸泡，浸泡0. 5^2h ；
(6)以与第二次浸泡同样的方式进行连续多次浸泡，并进行噬菌体的培养选择，但从第二次浸泡开始，将采集培养样本时间逐步延长，每一次延长5 7天，经过4 12代反复， 延长到27 60天后，停止浸泡；
(7)经噬菌体的培养选择后，所选择的噬菌体以水体终浓度4XKfpfu/mL的浸泡方式， 进入水产无脊椎动物幼体或亲本体内，在连续多次浸泡后，经浸泡的水产无脊椎动物幼体或亲本体内得到长期存活的噬菌体，取出浸泡后的水产无脊椎动物幼体或亲本清洗后投入洁净海水中正常养殖。所述培养样本的采集方法是从水产无脊椎动物幼体或亲本取血淋巴或采集水产无脊椎动物幼体养育成的幼苗，将幼苗清洗、勻浆和离心后取上清液，获得勻浆液。所述噬菌体的培养选择方法如下
(1)采集培养样本，用双平板法涂布平板，裂解宿主菌株，选取噬菌斑后，由噬菌斑分离的噬菌体株不能在水产无脊椎动物幼体或亲本血淋巴中生存达到27天的，弃之不用；
(2)采集培养样本，将采集得到的无菌的勻浆液作为培养基连续培养宿主弧菌3次，然后于TCBS培养基接种划线培养挑出单菌落，使宿主弧菌培养复壮；在每一次浸泡后，采集培养样本，分离、纯化噬菌体，以双平板法测定噬菌斑的噬菌体对复壮后的宿主菌的裂解能力，其中保持80% 85%裂解活性的噬菌体继续使用，低于80% 85%裂解活性的噬菌体弃之不用；
(3)在每一次浸泡和上一次浸泡比较，噬菌体在水产无脊椎动物幼体或亲本血淋巴中的存活数量增加10% 15%以上，则该噬菌体用于继续选择，否则，该噬菌体不能用于继续选择；
(4)每一次浸泡后，测定已浸泡噬菌体的水产无脊椎动物幼体或亲本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶，测定得到所有指标变化幅度和未浸泡噬菌体的水产无脊椎动物幼体或亲本基本一致，没有统计学上显著差异时，该噬菌体用于继续选择，否则，该噬菌体不能用于继续选择；
(5)经过权利要求3中的(1) (4)选择得到最终噬菌体，以该最终噬菌体以水体终浓度为IXlO6 pfu/ ml，浸泡水产无脊椎动物幼体与亲本，每间隔15天重复浸泡一次，养殖水产无脊椎动物幼体与亲本30 60天，测定其生长速度，其生长速度和未浸泡噬菌体的正常水产无脊椎动物幼体与亲本基本一致，没有统计学上显著差异的则该最终噬菌体可以用于浸泡，否则，该最终噬菌体不能用于浸泡；
(6)经选择得到的最终噬菌体在用于浸泡过程中，每15天从已投放该最终噬菌体的养殖水产无脊椎动物幼体或亲本体内抽取血淋巴，用双平板法在宿主弧菌生长平板得到噬菌斑，重新分离噬菌体，并以双平板法测定每个噬菌斑的噬菌体裂解能力，其中保持85%裂解活性的该最终噬菌体继续使用，低于85%裂解活性的该最终噬菌体弃之不用；则此保持85% 裂解活性的最终噬菌体即为所选择的噬菌体。所述弧菌噬菌体是指弧菌属弧菌及其噬菌体。所述水产无脊椎动物为对虾、东风螺、牡蛎、杂色鲍、扇贝、贻贝、海参中的一种。所述水产无脊椎动物幼体与亲本在用于浸泡和投放前经检测不含有使用的弧菌菌株及噬菌体。
所述的使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术也适用于对虾养殖场或东风螺、杂色鲍、东风螺工厂化养殖场或牡蛎、扇贝、贻贝、海参养殖场的无脊椎动物幼体与亲本无害携带多价噬菌体。本发明相对于现有技术的有益效果是本发明的使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术是利用无脊椎动物没有特异抗体反应的特性，用噬菌体浸泡水产无脊椎动物，浸泡后，从水产无脊椎动物幼体或亲本采集培养样本，再将噬菌体从水产无脊椎动物体内分离，再浸泡，反复多次进行连续浸泡，同时对噬菌体进行培养选择，最后得到在水产无脊椎动物体内长期存活的噬菌体。采用本发明技术所得到的噬菌体无毒无害，在水产无脊椎动物体内可长时间保持对宿主裂解活力，同时还可以满足水产无脊椎动物幼体与亲本的生产需要，为防治水产无脊椎动物弧菌病提供了新的技术。

(1)培养样本的采集采集对虾幼体养育成的仔虾，清洗得到的勻浆经离心后取上清液，获得勻浆液；
(2)噬菌体的培养选择方法
①采集培养样本，用双平板法涂布平板，裂解宿主菌株，选取噬菌斑后，由噬菌斑分离的噬菌体株不能在对虾幼体中生存达到27天的，弃之不用；
②采集培养样本，将采集得到的无菌的勻浆液作为培养基连续培养宿主弧菌3次，然后于TCBS培养基接种划线培养挑出单菌落，使宿主弧菌培养复壮；在每一次浸泡后，采集培养样本，分离、纯化噬菌体，以双平板法测定噬菌斑的噬菌体对复壮后的宿主菌的裂解能力，其中保持80% 85%裂解活性的噬菌体继续使用，低于80% 85%裂解活性的噬菌体弃之不用；
③在每一次浸泡和上一次浸泡比较，噬菌体在对虾幼体中的存活数量增加15%以上， 则该噬菌体用于继续选择，否则，该噬菌体不能用于继续选择；
④每一次浸泡后，测定对虾幼体样本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶， 测定得到所有指标变化幅度和未浸泡噬菌体的正常对虾幼体基本一致，没有统计学上显著差异时，该噬菌体用于继续选择，否则，该噬菌体不能用于继续选择；
⑤经过上述① ④选择得到最终噬菌体，以该最终噬菌体以水体终浓度为1X IO6 pfu/ ml，浸泡对虾幼体，每间隔15天重复浸泡一次，养殖对虾幼体30天，测定其生长速度，其生长速度和未浸泡噬菌体的对虾幼体基本一致，没有统计学上显著差异的则该最终噬菌体可以用于浸泡；
⑥经选择得到的最终噬菌体在用于浸泡过程中，每15天从已投放该最终噬菌体的养殖对虾幼体体内抽取血淋巴，用双平板法在宿主弧菌生长平板得到噬菌斑，重新分离噬菌体，并以双平板法测定每个噬菌斑的噬菌体裂解能力，其中保持85%裂解活性的该最终噬菌体继续使用，低于85%裂解活性的该最终噬菌体弃之不用；则此保持85%裂解活性的最终噬菌体即为所选择的噬菌体。7、经上述噬菌体的培养选择后，所选择的噬菌体以水体终浓度4X Kfpfu/mL的浸泡方式，进入对虾幼体体内，在连续多次浸泡后，经浸泡的对虾幼体体内得到长期存活的噬菌体，取出浸泡后的对虾幼体清洗后投入洁净海水中正常养殖。实施例2以体长为16 18cm的凡纳滨对虾亲本(以下简称“对虾亲本”)为例，按下列步骤实施本发明技术。1、从养殖水体按常规分离弧菌属菌株及其噬菌体，得到噬菌体裂解液。2、将步骤1获得的噬菌体裂解液经离心回收，0. 22ΜΠ1滤膜过滤后，用双平板法测效价，得到浓度为SAXliTpfu/ml的噬菌体液，于4°C保存，作为保存液，备用；具体方法 从单个菌落培养的生长对数期菌液中加入新鲜制备来自噬菌体单斑的噬菌体原液，放入摇床剧烈振摇后得到的裂解液，离心除去细菌碎片，加入胰DNAI酶与胰RNA酶除去细菌核酸。 加入lmol/L氯化钠至和10%W/V聚乙二醇(PEG6000)，冰浴中使噬菌体颗粒沉淀。离心回收沉淀的噬菌体颗粒，并将噬菌体重悬于PBS中，加入等体积的氯仿，去除噬菌体悬液中的聚乙二醇，离心后回收水相，用灭菌的0. 22ΜΠ1滤膜过滤，用双平板测效价，于4°C保存备用。3、将步骤2获得的保存液以蛋白胨水稀释，以双平板法计数，得到浓度为1. 5X IO9 pfu/mL的噬菌体液，作为浸泡使用液。4、第一次浸泡将步骤3获得的浸泡使用液投放于养殖海水中，使浸泡使用液终浓度为IXlO7 Pfu/ml，然后向养殖海水中加入对虾亲本，浸泡池，为第一次浸泡。5、第二次浸泡第一次浸泡后第7天时，采集培养样本，用双平板法涂布平板，裂解宿主菌株，选取噬菌斑，分离噬菌体，利用该噬菌斑制作与第一次浸泡的浸泡使用液同等浓度的噬菌体使用液，并在养殖海水中投放与噬菌体使用液同样浓度的本步骤制作得到的噬菌体，用另一组对虾亲本作第二次浸泡，浸泡池。6、以与第二次浸泡同样的方式进行连续多次浸泡，并进行噬菌体的培养选择，但从第二次浸泡开始，将采集培养样本时间逐步延长，每一次延长5天，经过12代反复，延长到60天后，停止浸泡。其中，培养样本的采集方法和噬菌体的培养选择方法如下
(1)培养样本的采集从对虾亲本围心窦取血淋巴，清洗得到的勻浆经离心后取上清液，获得勻浆液；
(2)噬菌体的培养选择方法
①采集培养样本，用双平板法涂布平板，裂解宿主菌株，选取噬菌斑后，由噬菌斑分离的噬菌体株不能在对虾亲本血淋巴中生存达到27天的，弃之不用；
②采集培养样本，将采集得到的无菌的勻浆液作为培养基连续培养宿主弧菌3次，然后于TCBS培养基接种划线培养挑出单菌落，使宿主弧菌培养复壮；在每一次浸泡后，采集培养样本，分离、纯化噬菌体，以双平板法测定噬菌斑的噬菌体对复壮后的宿主菌的裂解能力，其中保持80%裂解活性的噬菌体继续使用，低于80%裂解活性的噬菌体弃之不用；
③在每一次浸泡和上一次浸泡比较，噬菌体在对虾亲本血淋巴中的存活数量增加10% 以上，则该噬菌体用于继续选择，否则，该噬菌体不能用于继续选择；
④每一次浸泡后，测定对虾亲本样本的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、一氧化氮活酶， 测定得到所有指标变化幅度和未浸泡噬菌体的对虾亲本基本一致，没有统计学上显著差异时，该噬菌体用于继续选择，否则，该噬菌体不能用于继续选择；
⑤经过上述① ④选择得到最终噬菌体，以该最终噬菌体以水体终浓度为1X IO6 pfu/ ml，浸泡对虾亲本，每间隔15天重复浸泡一次，养殖对虾亲本60天，测定其生长速度，其生长速度和未浸泡噬菌体的正常对虾亲本基本一致，没有统计学上显著差异的则该最终噬菌体可以用于浸泡；
⑥经选择得到的最终噬菌体在用于浸泡过程中，每15天从已投放该最终噬菌体的养殖对虾亲本体内抽取血淋巴，用双平板法在宿主弧菌生长平板得到噬菌斑，重新分离噬菌体，并以双平板法测定每个噬菌斑的噬菌体裂解能力，其中保持85%裂解活性的该最终噬菌体继续使用，低于85%裂解活性的该最终噬菌体弃之不用；则此保持85%裂解活性的最终噬菌体即为所选择的噬菌体。7、经上述噬菌体的培养选择后，所选择的噬菌体以水体终浓度4X Kfpfu/mL的浸泡方式，进入对虾亲本体内，在连续多次浸泡后，经浸泡的对虾亲本体内得到长期存活的噬菌体，取出浸泡后的对虾亲本清洗后投入洁净海水中正常养殖。实施例3从湛江东海岛当地养殖场得到副溶血弧菌及其噬菌体。在洁净海水中加入终浓度均为4X Kfpfu/mL的选择的副溶血弧菌噬菌体，将刚孵化的凡纳滨对虾幼体在其中浸泡1. 0h，按照常规育苗方式继续培育20天，仔虾体内未见宿主菌，成活率65%，在对照组仔虾体内宿主菌高达4X 104cfu/mL，成活率5%。实施例4从湛江东海岛东风螺工厂化养殖场得到溶藻弧菌及其噬菌体。按照本发明技术，每隔20天一次，反复多次浸泡东风螺亲本，每次浸泡1.5h，检测表明，东风螺亲本体内噬菌体4X IO6 4Xl(fpfu/mL，东风螺体内宿主弧菌0 5 X 10cfu/mL，海水水体 1.0X102 1. 1 X 103cfu/mL,东风螺生长存活正常，对照组海水水体1. 3X 106cfu/mL，体内宿主弧菌5 X IO4 1. 5X 108cfu/mL，有弧菌病症状和少量死亡。


本发明公开了一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术。本发明的使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术是利用无脊椎动物没有特异抗体反应的特性，用噬菌体浸泡水产无脊椎动物幼体或亲本，浸泡后，从水产无脊椎动物幼体或亲本采集培养样本，再将噬菌体从水产无脊椎动物体内分离，再浸泡，反复多次进行连续浸泡，同时对噬菌体进行培养选择，最后得到在水产无脊椎动物体内长期存活的噬菌体。采用本发明技术所得到的噬菌体无毒无害，在水产无脊椎动物体内可长时间保持对宿主菌裂解活力，同时还可以满足水产无脊椎动物幼体与亲本的生产需要，为防治水产无脊椎动物弧菌病提供了新的技术。