专利名称：生物芯片的制作方法近年，随着基因利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用了基因的医疗受人关注，另外在农畜产领域，也开发了很多将基因用于品种鉴别、品种改良的方法。作为利用基因的技术，PCR(Polymerase Chain Reaction)法等核酸扩增技术已广泛普及。如今，PCR法已成为生物物质信息解析中的不可欠缺的技术。在PCR法中，通常采用使用称为管或芯片(以下，称为生物芯片)的、用于进行生化反应的容器来进行反应的方法。但是，在现有的方法中，存在需要的试剂等的量多，为了实现反应所需要的热循环而装置变复杂，反应耗费时间这样的问题。因此，需要如下的生物芯片、反应装置，即使用微量的试剂、样品，将PCR精度良好且短时间内进行。为了解决这种问题，在日本特开2009-136250号公报中公开了一种生物芯片和装置在填充有不与反应液混合的比重不同于反应液的液体(矿物油等)的管中，使以液滴状态被含有的反应液往返移动来实施热循环，从而进行反应。但是，当把日本特开2009-136250号公报所公开的生物芯片用于从容器外部进行荧光测定而检测扩增产物这样的用途时，需要用透明的材料形成容器。作为透明的材料，可举出树脂、耐热玻璃，但这些材料容易因摩擦等而带电。虽然在容器的内表面实施亲水处理则可以抑制带电，但属于水溶液的反应液将会附着于容器从而妨碍移动，所以难以将亲水处理用于生物芯片。另一方面，从对热和反应液的稳定性的观点出发，作为不与反应液混合的比重不同于反应液的液体可以使用硅油、矿物油，但这些油一般是绝缘体，因而导入到油中的反应液的液滴容易极化。因此，在透明材料的容器中填充油并导入反应液，则有时反应液和容器之间产生电场，反应液被吸引附着在容器的内壁，或因排斥而浮游于油中。这种状态下， 在生物芯片中进行依靠重力使反应液移动的方式(以下，本说明书中，将该方式称为“升降型”)的PCR时，有时反应液无法适当地移动，不能实施期望的热循环。本发明是鉴于以上的问题而完成的，其目的是提供一种能够消除生物芯片中产生的电荷，对反应液实施稳定的热循环的生物芯片。
本发明解决上述课题的至少一部分，可以作为以下方式或适用例而实现。[适用例1]本适用例的生物芯片是通过重力作用使反应液沿长度方向移动，其包含由透明材料形成的容器和密封所述容器的密封部，所述容器填充有比重与所述反应液不同且不与所述反应液混合的液体；所述液体的体积电阻率为大于0Ω · cm且小于等于 5 X IO13 Ω · cm。本申请发明人进行深入研究的结果发现本适用例记载的生物芯片中，如果比重与反应液不同且不与所述反应液混合的液体的体积电阻率为5Χ1013Ω -cm以下，则可以使容器或反应液中产生的电荷分散在液体中，消除电荷的聚集。因此，当向容器中分配反应液且用密封部密封的情况下，很难妨碍反应液的移动，可提供能对反应液实施稳定的热循环的生物芯片。[适用例2]如上述的适用例，其中，填充于生物芯片的所述液体可以包含比重与所述反应液不同的第1液体，和比重与所述反应液不同且体积电阻率小于所述第1液体的第2液体。本适用例记载的生物芯片由于含有第1液体和体积电阻率比所述第1液体小的第 2液体，所以可以通过调节第2液体占所述液体的比例，调节所述液体的体积电阻率。因此， 作为第1液体也能选择体积电阻率大的液体，所以可以按照所述液体成为更适合PCR的性质的方式进行调整。[适用例3]上述适用例中的生物芯片可以使用硅油或矿物油作为所述第1液体。因为本适用例记载的生物芯片含有硅油或矿物油作为第1液体，所以可以按照液体成为更适合PCR的性质的方式进行调整。[适用例4]上述的适用例中的生物芯片可以使用改性硅油作为所述第2液体。由于本适用例记载的生物芯片含有改性硅油作为第2液体，所以可以调节液体的导电性。[适用例5]本适用例的生物芯片是通过重力作用使反应液沿容器的长度方向移动，其包括填充有比重与所述反应液不同且不与所述反应液混合的液体的、由透明材料形成的2个以上的容器，和密封各个所述容器的密封部，以及将所述2个以上的所述容器保持在同一平面内的基板；并且，所述液体的体积电阻率为大于0 Ω · cm且小于等于 5Χ1013Ω · cm，且以所述平面的1点为中心的放射方向与所述容器的所述长度方向可以一致。本适用例记载的生物芯片含有以同一平面的1点为中心的放射方向与所述容器的所述长度方向一致的方式被保持的2个以上的所述容器。因此，可提供如下生物芯片将本适用例的生物芯片安装到升降型的PCR装置进行反应时，通过以所述1点作为旋转中心使所述基板旋转，从而能对多个所述容器均勻地实施热循环。图1是第1实施方式的生物芯片1的截面图。图2是模式性表示第1实施方式的热循环仪100的主要部分的分解立体图。图3是模式性表示第1实施方式的热循环仪100的主要部分的立体图。图4模式性表示第2实施方式的生物芯片2，(a)是平面图，(b)是模式性表示(a) 的A-A线的截面的截面图。图5是模式性表示第2实施方式的热循环仪101的主要部分的立体图。图6是模式性表示第2实施方式的热循环仪101的主要部分的其它立体图。图7是模式性表示变形例的生物芯片加的平面图。图8是模式性表示变形例的热循环仪IOla的主要部分的立体图。[符号说明]1...生物芯片、10...容器、20...投入口、30...液体、40...密封部、50...反应液。
由于容器10是具有长度方向即细长形状的容器，从而例如在使用后述的升降型的热循环仪，以对容器10内的液体30形成温度不同的区域的方式对生物芯片1进行温度控制时，可容易地加长不同温度区域间的距离。由此，在每个容器10内的区域可容易地将液体30控制成不同温度，所以能实现适合PCR的热循环。应予说明，所谓升降型的热循环仪，是指通过温度控制来在容器10中形成至少2个温度区域，通过使反应液50在这些温度区域间往返移动而实现热循环的装置。另外，由于容器10具有细长形状，因而容器10的表面积相对于容器10的体积的比例增大，所以导热的效率变得良好，液体30的温度调节变容易。容器10的形状只要具有长度方向，则没有特别限定，但在用于升降型的PCR时，优选是近似圆筒形状且内径D与长度方向的长L的比在1 5 1.5 20的范围。进而，更优选内径D为1. 5 2mm、长L为10 20mm。如果是这种形状，则可抑制加热容器10内的液体30时容器10内发生液体30的对流。由此，能使液体30的温度梯度稳定，所以可在反应液50中实施适当的热循环。容器10被构成为可从投入口 20投入反应液50。反应液50是含有能够包含靶核酸(作为扩增对象的核酸)的样品的液体。作为靶核酸，例如可举出由血液、尿、唾液、脊髓液等样品制备的DNA、或者从由该样品制备的RNA逆转录而成的cDNA等。反应液50可以含有用于扩增靶核酸的引物、PCR预混液(例如含有聚合酶、核苷酸和MgCl2等)、以及用于检测靶核酸的扩增产物的荧光探针。应予说明，也可以在生物芯片1的容器10内涂布必要量的引物和荧光探针的至少一方。由此，如果从投入口 20将样品的制备物和PCR预混液分配到生物芯片1中，则可以将引物和荧光探针的至少一方与样品的制备物混合，所以能更简单地进行PCR。在容器10中填充有液体30。当向容器10中分配反应液50利用后述的密封部40 进行密封时，优选填充至容器10的液体30的量为容器10内不残留空气的程度。由此，能防止因残留在容器10内的气泡而妨碍反应液50的移动，所以可以实施稳定的热循环。作为液体30，可使用比重比导入到生物芯片1的反应液50小且不与该反应液50 混合的性质的液体。液体30的体积电阻率为大于0 Ω · cm且小于等于5 X IO13 Ω · cm。其中，所谓体积电阻率，是指材料(这里是液体30)的电阻率，也称为体积电阻系数。通过使用不与反应液50混合的性质的液体30，在将反应液50导入至容器10时， 反应液50与液体30发生液-液相分离，所以液体30中反应液50可以成为液滴的形态。另外，如果使用比重比反应液50小的液体30，则在容器10中导入反应液50时，反应液50的液滴比重比液体30大，所以可以通过重力作用在液体30中沿重力作用的方向移动。液体30可以是比重大于反应液50的液体。这时，由于反应液50的液滴比重小于液体30，所以可以通过重力作用在液体30中沿与重力作用的方向相反方向移动。如果液体30的体积电阻率为5X 1013Ω -cm以下，则可以使容器10的电荷分散在液体30中，另外可以抑制反应液50的极化，因而可以消除容器10和反应液50的电荷的聚集。因此，例如在将反应液50分配到容器10中以密封部40进行密封的情况下，即使容器 10或反应液50的电荷密度发生局部的聚集，也可以介由液体30分散电荷，所以可以使生物芯片1的电荷密度均勻化。由此，可以防止反应液50对容器10的附着，所以能提供可以实施稳定的热循环的生物芯片1。
液体30的体积电阻率越小、生物芯片1越难发生电荷的聚集，所以该体积电阻率只要是大于0Ω 的范围，则越小越优选。另外，为了使用后述的升降型的热循环仪使反应液50在液体30中移动，优选液体30的粘度为1 X IO4NsnT2以下，为了以适合PCR的热循环的速度进行移动，更优选粘度为5Xl(fNsm_2以下。作为这种液体30，可例示二甲基硅油和矿物油。液体30可以含有比重比导入至生物芯片1的反应液50小的第1液体，和比重比反应液50小且体积电阻率比第1液体小的第2液体。因为第2液体体积电阻率小于第1液体，所以可以通过调节第1液体与第2液体的混合比例来调节液体30的体积电阻率。作为第1液体可以采用体积电阻率大的液体，所以除体积电阻率外，也可以将粘性和对热的稳定性等液体30的性质按照成为适合PCR的性质的方式进行调整。例如，当第1液体的性质是单独作为液体30使用时其体积电阻率大， 而其它性质比第2液体适合PCR时，可在第1液体中混合第2液体。可以通过第1液体与第2液体的混合比，调节液体30的性质，所以可以得到期望的体积电阻率之外还具有适合 PCR的性质的液体30。作为第1液体，例如可使用硅油或矿物油。其中，所谓硅(有机硅)，是指具有硅氧烷键作为主骨架的低聚物或聚合物。本说明书中，特别地将有机硅中的在热循环处理中使用的温度带中为液体状态的材料称为硅油。另外，本说明书中，将从石油提纯的、在热循环处理的温度带中为液体的材料称为矿物油。由于这些油对热的稳定性高，并且例如粘度为 5X10W2以下的产品也容易获得，所以适合升降型的PCR。作为硅油，可例示信越有机硅(Shin-Etsu Silicone)公司制的KF-96L-0. 65cs、 KF-96L-lcs、KF-96L-2cs、KF-96L-5cs、Dow Corning Toray 公司制的 SH200 C FLUID 5 CS ^Momentive Performance Materials Inc. Japan, LLC TSF451-5A>TSF451-10
甲基硅油。作为矿物油，可例示含有碳原子数14到20左右的链烷作为主成分的材料。艮口， 可例示正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十四烷。作为第2液体，例如可使用改性硅油。其中，所谓改性硅油，是指具有取代基的硅油。作为第2液体，例如优选具有甲醇基、烷基硅基(alkylsilyl)、氟代烷基、硅醇基、或烷基硅倍半氧烷基(alkylsilsesquioxy)作为取代基的物质。第2液体可以具有多个这些取代基，例如可以是具有烷基硅基和烷基硅倍半氧烷基的物质，可以是具有烷基硅基和氟代烷基的物质。另外，也可使用环状硅氧烷。更优选第2液体在进行热循环处理的温度范围内具有对热稳定的性质。例如可例示甲醇改性硅油、Siin-Etsu Silicone公司制的 KF-600U Dow Corning iToray 社制的 BY 16-201,5562 CALBIN0L FLUID、以及 Momentive Performance Materials Inc. Japan, LLC 制的 XF42-B0970。甲醇改性硅油的粘度为 3X IO4NsnT2以上，单独用于升降型的PCR时粘度高，但因为体积电阻值比二甲基硅油低，所以通过与二甲基硅油混合，从而可以调整液体30的导电性。即，添加量越多、体积电阻率越小。第2液体可以是含有多种成分的液体，可以是多种液体的混合物。例如可使用Shin-Etsu Silicone公司制的X21_5250(三甲基硅烷氧基硅酸酯 (trimethylsiloxysilicate)50%、环戊硅氧烷50% )、X21-5616 (三甲基硅烷氧基硅酸酯 60%、异十二烷 40% )。
容器10的投入口 20可以用密封部40密封。密封部40可以由与容器10同样的材质形成。密封部40的结构只要是能密闭容器10的结构即可，例如可以是旋盖、栓、塞等结构。图1中，密封部40是旋盖结构。1-2.使用第1实施方式的生物芯片的热循环处理。图2是模式性表示本实施方式的热循环仪100的主要部分的分解立体图，图3是模式性表示本实施方式的热循环仪100的主要部分的立体图。本实施方式的热循环仪100包含具备安装生物芯片1的安装孔IlOa的安装部 110，在将生物芯片1安装于安装部110后以非重力方向的轴R为旋转轴使安装部110旋转的旋转体120，在将生物芯片1安装于安装部110后加热生物芯片1的容器10的至少一部分的第1加热器130和第2加热器140。在图2所示的例子中，旋转体120的形状是圆筒形，如图3所示，以2个旋转体120 夹持安装部110的方式进行配置，构成热循环仪100的主要部分。旋转体120在图3的状态中通过未图示的电机等的驱动机构，以轴R为中心进行旋转。安装部110是将生物芯片 1插入安装孔IlOa而进行安装的结构。安装孔IlOa的长度方向与以轴R为中心的放射方向一致。如果安装孔IlOa这样地形成，则在将导入了反应液50的生物芯片1安装到安装孔IlOa上时，生物芯片1的长度方向与以轴R为中心的放射方向一致。由此，当安装生物芯片1使安装部110旋转时，通过重力作用，可以使反应液50沿生物芯片1的长度方向移动。如图2和图3所示，当形成多个安装孔IlOa时，通过这样配置安装孔110a，也能够对所有的生物芯片1均勻地实施热循环。因此，这里的“一致”的程度只要是将导入了反应液50 的生物芯片1安装到安装部110上使其旋转时反应液50能够恰当地移动的程度即可。应予说明，为了通过重力的作用使反应液50移动，优选旋转体120的旋转速度为不使作用于生物芯片1的离心力变过大的程度，例如优选为Irpm(rotation per minute) lOrpm。另外，在图2所示的例子中，在旋转体120的轴R附近设置第1加热器130，在外周附近设置第2加热器140。第1加热器130和第2加热器140形成为以轴R为中心的同心圆状。第1加热器130和第2加热器140可以控制成不同的温度。第1加热器130和第2 加热器140的温度例如可通过未图示的控制部来设定为适合反应的温度。例如，在将本实施方式的热循环仪100用于两级温度PCR(2 step PCR)时，第1加热器130的温度设为63°C，第2加热器140的温度设为95°C。由此，形成了从轴R的附近向外侧温度升高的温度梯度，所以当将导入了反应液50的生物芯片1安装到安装部110使热循环仪100运行时，液体30中形成包含容器10的第1加热器130附近的区域为63°C、第 2加热器140附近的区域为95°C的2个温度区域的温度梯度。因此，使旋转体120旋转将反应液50往返移动时，可以对反应液50实施高温和低温的热循环。2.第2实施方式2-1.第2实施方式的生物芯片的构成。图4(a)是模式性表示第2实施方式的生物芯片2的平面图。图4(b)是模式性表示第2实施方式的生物芯片2的图4(a)的A-A线的截面的平面图。图4(a)和图4(b)表示在容器中未导入反应液的状态。本实施方式的反应液与第1实施方式相同，所以标记相同的序号省略说明。第2实施方式的生物芯片2的构成包含2个以上的容器11、密封各个容器11的密封部41、以及基板60。在图4(a)和图4(b)所示的例子中，多个容器11保持在圆板状的基板60上。多个容器11按照以基板60的中心部的点C为中心的放射方向(以下，成为该放射方向的中心的点称为“生物芯片2的中心C”或“中心C”)与各容器11的长度方向一致的方式配置在基板60上。如果容器11这样地配置在基板60上，则在将生物芯片2安装到后述的热循环仪上并以穿过生物芯片2的中心C的非重力方向的直线作为旋转的轴R使生物芯片2旋转时，通过重力作用，对于所有的容器11，可以使容器11内的反应液50沿容器11的长度方向移动。而且，多个容器11按照位于与轴R正交的单一平面上的方式配置在基板60上。 通过将容器11保持在同一平面上，从而在通过重力的作用而使反应液50移动时，能使各容器11中的反应液50的移动速度变相等。由此，可以对多个容器11均勻地实施热循环。因此，这里的“一致”和“相等”的程度只要是将导入了反应液50的生物芯片2安装到后述热循环仪上使其旋转时，反应液50能恰当地移动的程度即可。在图4(a)所示的例子中，基板60是外周带有切口 60a的形状。由此，在将生物芯片2安装到后述热循环仪时，可将生物芯片2定位于热循环仪而进行固定。用于安装的结构可以适当设计，可在基板60的一部分设置孔、凹槽、凸部结构等，也可以组合这些结构。生物芯片2的基板60可以是与容器11 一体形成的结构，也可以是如图4所示在与容器11不同的材质的基板60上固定容器11的结构。前者的情况下，基板60可以是与容器11同样的材质。后者的情况下，对基板60的材质没有特别限定，但优选为耐受PCR中的加热的材质。基板60由与容器11同样的材料形成时，也可以配合炭黑、石墨、钛黑、苯胺黑，或Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co或Cu的氧化物、Si、Ti、Ta、Zr或Cr的碳化物等黑色物质等。 通过在基板60的材质中配合这种黑色物质，能够抑制树脂等所具有的自发荧光，所以例如可优选在实时PCR这样的伴有荧光测定的用途中使用生物芯片2。容器11可以是与第1实施方式的容器10同样的材质。如图4所示，本实施方式的生物芯片2是容器11露出到基板60的外部的结构。通过使生物芯片2的至少一部分从基板60露出，将容器11制成与第1实施方式的容器10同样的材质，从而能够得到与第1 实施方式的容器10同样的效果。密封部41可以是与第1实施方式的密封部40同样的材质，能够得到与第1实施方式同样的效果。对于本实施方式的容器11的形状没有特别限定，可以使用与第1实施方式的容器 10同样的形状，能够得到与第1实施方式同样的效果。在图4(a)和图4(b)所示的例子中， 相较于第1实施方式的容器10，容器11的投入口 21的位置和结构不同。如图4(a)和图 4(b)所示，通过将投入口 21的位置设在基板60的一侧的平面侧，从而例如在从投入口 21 导入反应液50时，即使不特别使用支撑器具等也能够将基板60放置在桌上的状态稳定地进行操作。在容器11中，填充有液体30。液体30是与第1实施方式同样的液体，能够得到与第1实施方式同样的效果。在图4(a)和图4(b)所示的例子中，密封部41是塞式的结构。密封部41的结构没有特别限定，也可以通过设计而采用与第1实施方式的密封部40同样的旋盖结构。在图 4(a)和图4(b)所示的例子中，密封部41是对每个容器11独立设置，但考虑操作性等，也可以一体构成多个密封部41以便于能够一次密封多个容器11。
2-2.使用第2实施方式的生物芯片的热循环处理。图5是模式性表示本实施方式的热循环仪101的主要部分的立体图，图6是模式性表示本实施方式的热循环仪101的主要部分的其它的立体图。相较于第1实施方式的热循环仪100，本实施方式的热循环仪101的构成在安装部110的结构上不同，其它构成与热循环仪100相同。因此，对与第1实施方式的热循环仪100同样的构成标记同一符号，省略详细的说明。在图5和图6所示的例子中，2个旋转体121、122以利用未图示的机构来进行开闭的方式构成，是在2个旋转体121、122之间夹持生物芯片2而进行保持的结构。图5表示旋转体121、122分离的状态，图6表示闭合旋转体121、122的状态。安装部111作为对应于生物芯片2的形状的结构形成在旋转体121或122上。在本实施方式中，安装部111是旋转体121的一部分突出的结构。可以通过将本实施方式的生物芯片2的切口 60a嵌合在图5的安装部111中，从而能够将生物芯片2安装到热循环仪上。本实施方式中虽然例示了旋转体121上形成有安装部的例子，但旋转体122与旋转体121也可以是同样的结构。在安装生物芯片2时，优选安装部111的结构设计成生物芯片2的中心与旋转轴 R—致。由此，生物芯片2的中心成为旋转的中心，所以当将导入了反应液50的生物芯片2 安装到安装部111并如图6所示在以旋转体121夹持的状态下使旋转体121和122旋转时， 通过重力的作用，对于所有的容器11，可以使反应液50沿容器11的长度方向移动。即，在含有多个容器11的生物芯片2中，也与使用多个具有1个容器的生物芯片的情况同样地， 可以对所有的容器11均勻地实施热循环。因此，这里的“一致”的程度，只要是在将导入了反应液50的生物芯片2安装到后述的热循环仪上使其旋转时，反应液50能恰当地移动的程度即可。另外，各个容器11中的反应液50的动作与实施方式1相同。[实施例]3.实施例以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不受实施例限定。在本实施例中，对使用了第1实施方式的生物芯片1的例子进行说明，但即使使用第2实施方式的生物芯片2也同样可以实施。使用高纯度的二甲基硅油作为第1液体，改变第2液体的种类和混合第2液体的比例(添加量)，进行研究反应液举动的实验。第2液体的种类和混合的比例如下述表1所示。其中，第2液体的比例是在将属于第1液体和第2液体的混合物的液体30的体积作为 100时，第2液体占液体30的体积的比例(％ )。在生物芯片1中填充第1液体和第2液体， 分配反应液并用密封部40密封。对于生物芯片1，使用内径D为2mm、长度L为20mm的生物芯片1，反应液是0.5μ1。高纯度的二甲基硅油是绝缘体，对热以及对反应液的稳定性高。 KF-96L-0. 65cs(甲醇改性硅油)的添加量是以为间隔从到5%。对于XS66_B82^ 和XS66-C1191 (三氟烷基二甲基三甲基硅烷氧基硅酸酯)、X21-5250 (三甲基硅烷氧基硅酸酯50%、环戊硅氧烷50% )、以及SilR)rm Flexible Resin (聚甲基硅倍半氧烷)，以4%、 1%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、0. 01%和0. 005%的添加量进行实验。准备各条件的容器10各 10根，在规定温度下使用上述的热循环仪使各条件的生物芯片1旋转，观察反应液的举动。 将反应液不附着于容器10并在2秒以下的时间内从一侧端部移到另一侧端部的情况判定为没有附着，将反应液附着于容器10或移动需要的时间大于2秒的情况判定为存在附着。在表中，10根中5根以上的容器被判定为没有附着时以〇表示，6根以上被判定为存在附着时以X表示。另外，对于甲醇改性硅油以外的上述4种油，表中仅表示了附着状态变化的、 即判定为〇的最少添加量和判定为X的最大添加量的数据。应予说明，关于第2液体的添加量确然到了其多于表中记载的量时反应液移动，少于表中记载的量时反应液发生附着。对于判定为〇的最少添加量和判定为X的最大添加量，测定液体30的体积电阻率。测定使用Universal electrometer MM A_II_17B (株式会社川口电气制作所)，以测定电压IOV进行。其结果，判定为〇的条件中、体积电阻率值最大的是添加4%甲醇改性硅油的情况，测定值为4. 8 X IO13 Ω · cm。[表 1]


本发明提供一种生物芯片，其能够消除生物芯片上产生的电荷，实施稳定的热循环。本发明的生物芯片，通过重力作用使反应液沿长度方向移动，包含由透明材料形成的容器，所述容器填充有比重比所述反应液小且不与所述反应液混合的液体，和密封所述容器的密封部；并且，所述液体的体积电阻率为大于0Ω·cm且小于等于5×1013Ω·cm。