一种用于处理生物样本的组合物的制作方法【技术领域】。[0002]利用离心法富集生物样本中的生物颗粒是生物学研究中应用最为广泛的一项技术。许多生物颗粒均可以通过离心法这一技术实现富集，例如，动物或植物的细胞、亚细胞结构、细菌、病毒或生物大分子等。这些在悬液中的生物样本在离心作用下的表现主要取决于生物样本的大小和密度，这可以通过斯托克斯方程(Stokes equation)得到解释。斯托克斯方程(见下式)描述了球形颗粒在液体介质中受到离心作用时运动速率的变化规律: d2( P2-P1) X g[0003]- [0004]其中:d代表球形颗粒的直径，P2代表球形颗粒的密度，P1代表液体介质的密度，η代表液体介质的粘度，g代表离心力。[0005]通过斯托克斯方程很容易得到如下结论:(1)沉降速率与颗粒大小成正比；(2)沉降速率和颗粒密度/液体介质的密度差成正比；(3)当颗粒和液体介质的密度相等时，颗粒的沉降速率为零；(4)沉降速率与液体介质的粘度成反比；(5)沉降速率与离心力成正比。[0006]根据斯托克斯方程，离心法富集颗粒需要借助一种适宜材料的液体介质得以实现，在这种液体介质中，不同的生`物颗粒由于其各自的颗粒大小、颗粒密度或其它理化及生物学特性不同而具有不同的表现，从而实现其各自的富集目的。依据生物颗粒在液体介质中的表现类型不同，可以将离心法富集生物颗粒分为差速离心和密度梯度离心，而密度梯度离心又可以进一步被分为速率-区带离心和等密度离心。
[0007]等密度离心法是一种在细胞生物学中广泛用于富集特定细胞的技术方案，其原理如上述由斯托克斯方程所得到的结论(3)中所阐释的那样:由于所选择的液体介质的密度等于或略大于欲富集的目的细胞，因此目的细胞在离心作用下，无论离心时间长短，都将无法穿透液体介质的界面沉到离心容器的底部，进而在液体介质的界面处(即平衡位置)得到富集。典型的等密度离心法是利用单次密度梯度离心法纯化血液或骨髓样本中的淋巴细胞，其中所采用的液体介质通常是含有聚蔗糖-碘化物组合配方的具有生理渗透压的水溶液。可商购获得的此类产品有很多种，例如通用电气医疗集团(GE Healthcare)的产品Ficoll-Paque?PLUS、西格玛集团(Sigma)的产品Histopaquel077?等。这些常用的液体介质大多采用相同的主要原料作为配方，即聚蔗糖400 (Ficoll 400)和泛影酸钠(Diatrizoate),这是20世纪70年代由Boyum等人逐渐建立并不断优化而得到的十分成功的配方体系。
[0008]选择这两种主要原料作为介质配方是有其深刻原因的，J Graham在他的著作Biological Centrifugation中详细总结了适合作为密度梯度介质的材料应具备的特性，包括(I)能够制备所需密度范围的足够的溶解度；(2)在所需密度范围内不形成高粘度的溶液；(3)当待分离的生物样本对渗透压敏感时，密度梯度介质既不高渗也不低渗；(4)可以调节PH值等参数与待分离的生物样本保持一致；(5)不影响样本的生物学活性；(6)无毒且不被细胞代谢；(7)不与离心管反应，且不影响检测过程；(8)容易从纯化的产品中去除；(9)价格低廉等。应当指出，没有一种产品可以同时满足上述全部特性，因此适用于不同生物样本的多种产品应运而生。例如，DNA的密度在1.50-1.80g/cm3之间，应选用高密度介质氯化铯或硫酸铯溶液等。聚蔗糖400和泛影酸钠的组合配方除了能提供足够的密度，又能够避免过高的粘度影响分离效率，因此成为了细胞纯化操作中构建密度梯度介质的一种良好选择。
[0009]具体而言，聚蔗糖400是一种化学合成的高分子聚合物，平均分子量约为400kD，可溶于水，其最大水溶液密度可高达1.23g/mL，大于血液或骨髓样本中密度最大的红细胞，适用性较广。此外，聚蔗糖400由于其多羟基大分子的特殊结构，可与红细胞表面吸附结合，破坏红细胞表面的电荷层，从而降低红细胞之间的静电斥力，并通过“桥联”模式促使红细胞出现缉1钱状沉淀。聚鹿糖400这种促进红细胞聚集沉降的作用对于淋巴细胞的纯化是至关重要的。根据斯托克斯方程可知，红细胞发生聚集而得的聚集体由于其具有更大体积而显著加速了其沉降速度，这不仅大大提高了纯化效率，更重要的是对于数量占绝对多数的红细胞的去除而言，这种聚集沉降的作用保证了较高的淋巴细胞纯度，有效减少了红细胞的污染。然而，这种促进红细胞聚集沉降的作用也有其负面影响，盛佳等报道了高分子对于红细胞的这种聚集沉降作用随分子量变大而增强(盛佳等，红细胞聚集的生物力学基础，《力学进展》，1999年，第29卷，第I期)，可知聚蔗糖400对于红细胞的这种聚集沉降作用较强，而过快的沉降会致使淋巴细胞等目的细胞陷入红细胞聚集体而发生目的细胞群的非特异性丢失，这也是离心法进行淋巴细胞纯化操作中低收率的一个原因。综上所述，红细胞的这种聚集应受到合理控制，高分子这种促进聚集的作用应在适宜的范围内，速度应适中。泛影酸钠是临床常用的一种小分子离子型碘对比剂，其与聚蔗糖400组合可以进一步为组合体系提供适宜的粘度和渗透压以提高纯化效率。
[0010]利用密度梯度介质完成淋巴细胞的富集是一项常规的实验操作，其一般步骤包括:(I)用一定比例的平衡盐溶液或生理盐水对血液或骨髓样本进行预稀释；(2)将稀释后的样本小心沿离心容器壁加入预装有密度梯度介质的离心容器中，保持样本与介质的界面清晰，不发生混合；(3)在一定温度和一定离心条件下进行离心，比如20° C时，离心力为400g的条件下离心30分钟；(4)小心从离心机中取出装有样品的离心容器，利用巴斯德吸管或移液管等装置吸取富集在样本和介质层交界面处的“白膜层” ；(5)用一定比例的平衡盐溶液、生理盐水或细胞培养基洗涤得到的细胞产品，除去血小板、细胞碎片与部分死细胞，以及残余的密度梯度介质；(6)将得到的细胞悬液用于细胞培养等后续实验，在临床应用方面，特别是在细胞移植或成分输血的情况中，得到的细胞悬液可能将被直接输注入人体。
[0011]含有聚蔗糖400-泛影酸钠组合配方的在售的密度梯度介质产品已可以满足实验室生物学研究的大部分需要。然而，这种组合配方对目的细胞的生物学影响也是不可忽略的，特别是其对一些特定细胞表面抗原表达量的影响已在多篇文献中见诸报道。例如，Watson等人报道了聚鹿糖介质对嗜中性粒细胞表面抗原的影响(Watson F等人，Neutrophil function in whole blood and after purification:changes inreceptor expression, oxidase activity and responsiveness to cytokines,Biosc1.Rep.1992，12(2): 123.) ；LundahI等人报道了通过聚鹿糖-泛影酸钠组合配方分离而得的单核细胞与通过氯化铵裂解而得的单核细胞相比，⑶Ilb/⑶18比例发生了显著改变(Lundahl J 等人，Altered expression of CDllb/CD18 and CD62L on human monocytesafter cell preparation procedures, J.1mmunol.Methods.1995, 180(1):93.)；又如Souques等人报道了通过聚蔗糖-泛影酸钠组合配方分离而得的单核细胞的⑶16和⑶62L表面抗原均发生了显著的过表达(Souques F等人，Modification of surface markerexpression on CD 14 monocytes of allergic patients after lysis or Ficollpurification, J.Tmmunol.Methods.1997, 204:153)。聚鹿糖 400 作为一种高分子量的聚合物，已具有较强的抗原性，能够引起致敏反应，这在在体实验中得到了明确证实，例如一些文献中报道了利用聚蔗糖400作为半抗原的载体，增强小鼠对弱抗原的免疫反应应答等。更重要的是，聚蔗糖400本身缺乏药用经验，其毒理学、代谢动力学等重要药学数据缺失。显而易见，含有聚蔗糖400的密度梯度介质如果用于临床用途时，所得的细胞产品中聚蔗糖400的残留量必须受到最严格的控制，避免其与细胞产品一同输注进入人体，产生进一步的不良后果，这一点在一些国家的法律法规中已有明确限制，例如，2011年5月美国药典(USP)〈1043〉中就细胞、基因和组织工程产品辅料(Ancillary Materials forCell, Gene, and Tissue-Engineered Products)制定了普遍适用的指导方针，其中有三点可以为我国在相同领域设定标准提供重要参考:(1)细胞、基因和组织工程辅料被定义为不在终产物中出现的物料，这要求辅料的使用应选取最小用量，且生产过程应使辅料的残留量最小化并形成高效的定量检定残留量的方法；(2)辅料按风险程度分级，治疗用药物、生物制品、医疗器械和植入材料属于低风险级别，即得到高度认证的产品；而没有临床应用经验的化学试剂级物料属于中等风险级别，残留量需得到更严格控制；动物源性提取物及有明确毒性的化学实体属于高等风险级别，残留量需得到更严格的控制；(3)推荐采用最低风险级别的产品，即采用的辅料选择得到认证的治疗产品，因为其受到很好的鉴定，具有备案的毒性资料，并严格按受控、备案的过程进行制备。据此，很容易做出判断，聚蔗糖400由于不是得到认证的治疗产品，其缺乏严格的管理标准，因此聚蔗糖400-泛影酸钠组合配方的密度梯度介质应被归为中等风险材料，经其处理的细胞终产品中的残留量需得到严格控制，而这对于细胞产品的生产而言，生产周期和成本无疑将大大增加。因此，筛选一种更为高效，特别是一种得到认证的治疗产品作为原料的密度梯度介质，将为密度梯度介质的临床应用提供安全性和法律依从性上的双重保障。
[0012]我国2009年颁布的《细胞移植治疗技术管理规范》中明确提出了纯化细胞所需试剂和器械均必须经食品药品监督管理部门审批，具有临床应用许可证。然而，目前仍没有一个可商购获得的产品宣称可以用于临床非诊断用途，聚蔗糖400对这类产品的临床应用转化产生了不可忽视的制约作用。
[0013]专利申请201110456878.2公开了一种用于单个核细胞分离的组合物及复方淋巴细胞分离介质，其是由分子量大于40kD的右旋糖酐、羟乙基淀粉与泛影酸钠或泛影葡胺组成的。该专利申请提供的组合物及分离介质的分离效果与常规分离介质没有显著性差异，但是，该专利申请提供的组合物和分离介质的配方较复杂，含有三种主要原料，这对于需要严格控制内毒素的此类产品而言，为其制备带来了巨大不便。胡文滨对无菌产品细菌内毒素的控制做了较为详细的总结(胡文滨，无菌产品细菌内毒素的控制，河北省科学院学报，2010年，第27卷，第4期)。在无菌产品细菌内毒素的控制中，用量较大的主要原料是携带内毒素的重要媒介，因此，无论对于主要原料的内毒素检测还是涉及主要原料的生产操作或设备载体均是重要的控制点。这说明，配方越复杂，涉及的主要原料种类越多，生产工艺中对于内毒素的控制将越困难，且生产成本将越高。这一配方的复杂性为其工业生产的转化带来了巨大障碍。造成这一问题的重要原因是基于专利申请201110456878.2中表明了如下带有偏见的认识:即该组合物和分离介质必须采用特定比例的两种功能分子(右旋糖酐和羟乙基淀粉)才能够提供适宜的红细胞凝集速度，并实现良好的淋巴细胞纯度和淋巴细胞回收率，并且，该专利申请特别指出这种适宜的红细胞凝集速度是两种分子中单一的某一种分子无法实现的。
[0014]综上所述，研发一种配方更为简单、生产工艺更为便捷、成本更低、且产品内毒素更容易控制的用于处理生物样本的组合物及液体介质是本领域亟待解决的问题之一，解决这一问题将为实现临床治疗用途的密度梯度介质的工业生产转化产生巨大推动作用。


[0015]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于处理生物样本的组合物，通过将药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂和/或PH值调节剂相混合得到一种具有良好效果的用于生物颗粒富集的组合物。
[0016]本发明的目的还在于提供一种采用上述组合物制成的液体介质，其可以用于生物颗粒的富集纯化，是一种良好的用于生物颗粒富集的液体介质。
[0017]为达到上述目的，本发明首先提供了一种用于处理生物样本的组合物，其由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、PH值调节剂组成，其质量比为 2.0-12.0:2.5-12.0:0-0.4:0-0.5 ;优选为 3.5-12.0:3.5-12.0:0-0.3:0-0.4 ;更优选为 5.0-12.0:5.0-11.0:0-0.25:0-0.4。
[0018]该用于处理生物样本的组合物也可以称为用于生物颗粒富集的组合物。
[0019]本发明还提供了一种用于处理生物样本的液体介质，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉2.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂
2.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.4wt%、pH值调节剂0-0.5wt%和余量水组成；优选地，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉3.5-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂3.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.3wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成；更优选地，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉5.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂5.0-11.0wt%、渗透压调节剂0-0.25wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成。
[0020]该液体介质可以是由本发明所提供的上述组合物溶于水(优选注射用水)得到的，其主要用于生物颗粒的富集和分离，因此，也可以称为用于生物颗粒富集的液体介质。
[0021]根据本发明的具体实施方案，优选地，上述液体介质的pH值为5.0-7.5，优选为
6.1-7.5。
[0022]根据本发明的具体实施方案,优选地,上述液体介质的渗透压为270_335m0sm/kg ；更优选地，该液体介质的渗透压为280-320m0sm/kg。
[0023]根据本发明的具体实施方案，优选地，上述液体介质的密度为1.070-1.085g/mL ；更优选地，该液体介质的密度为1.077-1.083g/mL。
[0024]对于本发明所提供的液体介质，通过在本发明所提供的范围内调整其成分组成可以使其具有不同的渗透压、密度等，以适应不同的生物样本以及需要分离的目的细胞。
[0025]羟乙基淀粉是一种临床最常用的血浆代用品，俗称706代血浆，是治疗和预防低血容量的首选药物，其结构通式如下:
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